鴨甲型病毒性肝炎的研究進(jìn)展

任麗倩，李晶，畢玉海，陳璨，張大丙，劉文軍

1 安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230039

2 中國科學(xué)院微生物研究所 病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101

3 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193

鴨甲型病毒性肝炎 (Duck virus hepatitis A)是危害雛鴨的一種急性、高致死性傳染病，具發(fā)病急、病程短、傳播快、病死率高等特點，主要侵害3周齡以內(nèi)雛鴨，嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展。該病已出現(xiàn)并流行半個多世紀(jì)，截至 2006年，研究人員測定出病毒的全基因組序列，標(biāo)志著國內(nèi)外對該病的研究已進(jìn)入一個嶄新階段。該病毒目前存在較多變異株，國內(nèi)外學(xué)者對其作了大量研究與分析。本文從鴨甲型病毒性肝炎的流行病學(xué)、分子遺傳進(jìn)化、基因組結(jié)構(gòu)功能等方面入手，闡述了鴨甲型病毒性肝炎常見的基因型及其臨床特征，最后分析出GenBank數(shù)據(jù)庫中鴨甲型肝炎病毒的分子遺傳與進(jìn)化圖譜，并歸納出常見的監(jiān)測方式與預(yù)防措施，旨在為全面地分析該病毒特性、較好地預(yù)防該病發(fā)生提供直觀的評價指標(biāo)和方法，為預(yù)防鴨甲型病毒性肝炎提供參考依據(jù)。

1 鴨甲型肝炎病毒的命名與溯源

目前，鴨甲型病毒性肝炎由鴨甲型肝炎病毒(DHAV) 引起。該病毒曾與鴨星狀病毒 (DAstV)統(tǒng)一被命名為鴨肝炎病毒 (DHV)，分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個血清型，均歸屬于小RNA病毒科。但根據(jù)2005年7月國際病毒分類委員會發(fā)表的最新病毒分類第八次報告，DHV-Ⅱ和DHV-Ⅲ應(yīng)歸屬于星狀病毒科 (Astroviridae)[1]，且更名為DAstV-1、DAstV-2。

2007年，Tseng等[2]和Kim等[3]分別在臺灣和韓國鑒定出與DHV-Ⅰ無抗原相關(guān)性的新型；2008年，Wang等[4]基于VP1、VP0、VP3基因序列及3D基因的部分序列將DHV-Ⅰ分A、B、C三個基因型，分別對應(yīng)血清Ⅰ型、臺灣新型和韓國新型。小 RNA病毒科研究小組建議在小RNA病毒科中增設(shè)禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種[5]，并將血清型DHV-Ⅰ的3個基因型歸屬其中。

本文將延用2008年后的分類，將引起鴨甲型病毒性肝炎的病毒歸屬于小RNA病毒科的禽肝炎病毒屬鴨甲型肝炎病毒種，稱之為鴨甲型肝炎病毒 (DHAV)。

2 鴨甲型病毒性肝炎的流行病學(xué)調(diào)查

鴨甲型病毒性肝炎自然爆發(fā)時，主要侵害3周齡以內(nèi)雛鴨，死亡率可高達(dá)90%～95%。該病無明顯季節(jié)性，病鴨和帶毒鴨是主要傳染源，僅水平傳播，可通過消化道和呼吸道感染。易感鴨品種主要有櫻桃谷、北京鴨、櫻桃谷-北京雜、櫻桃谷與其他品種鴨的雜交鴨、番鴨、半番鴨、浙江麻鴨、美國水鴨等。

DHAV-A首次報道于 1945年美國長島。1954年Asplin和McLauch從英國病鴨中分離到該病毒，1957年Macpherson和Avery在加拿大分離出 DHAV-A[6]。其后德國、意大利、印度、法國、蘇聯(lián)、匈牙利、日本等國相繼報道了本病的流行。自印度、埃及分別報道了DHAV-A型的變異情況后，美國Sandhu等1992年利用雞胚中和試驗發(fā)現(xiàn)1株DHAV-A的變異株與DHAV-A僅有單向交叉中和反應(yīng)，命名為Ia型[7]。

在我國，鴨甲型病毒性肝炎最早出現(xiàn)在上海地區(qū)，1980年王平等[8]在北京地區(qū)分離到了該病毒，1984年郭玉璞等[9]用熒光抗體間接法確定病原為 DHAV-A。近幾年，國內(nèi)學(xué)者不斷從發(fā)病鴨中分離到DHAV-A的變異株：陳建紅等[10]報道稱珠江三角洲地區(qū)部分DHAV毒株的毒力與抗原性發(fā)生變異；蘇敬良等[11]從北京和廣西兩地分離的2株毒株均與DHAV-A型陽性血清無交叉免疫反應(yīng)，將其暫定為新型鴨肝炎病毒，基因組序列測定表明該毒株與Kim報道的韓國新型同源性最高[12]；鄭獻(xiàn)進(jìn)等[13]報道了DHAV-A型變異株的存在；范書才等1999年從廣東分離的 GD株病毒在血清學(xué)和抗原相關(guān)基因上與DHAV-A不同，屬新型[14]。為了解我國鴨甲型病毒性肝炎病毒的流行現(xiàn)狀情況，袁率珍等[15]對 1999?2010年從廣東、山東、云南、河南和黑龍江等地發(fā)病死亡雛鴨分離得到DHAV分離株進(jìn)行血清型鑒定與抗原相關(guān) VP1基因序列分析，結(jié)果表明目前 DHAV-A和DHAV-C 兩種基因型同時流行。Fu等[5]對2001?2007年分離自北京、內(nèi)蒙古、重慶、廣東、上海5個地區(qū)的28個樣本基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中13株是DHAV-A，15株是DHAV-C。何冉婭等[16]對 2007?2009年華南地區(qū)各鴨場發(fā)病雛鴨進(jìn)行病原學(xué)檢測和VP1基因序列分析，結(jié)果顯示危害華南地區(qū)的鴨甲型肝炎病毒已發(fā)生變異，且存在DHAV-A、DHAV-C兩種基因型毒株的流行。此外，Liu等[17]在臨床表現(xiàn)為過度攝食、剖檢以肝病變?yōu)橹鞯牟※Z體內(nèi)也分離到了DHAV-C毒株。

3 鴨甲型病毒性肝炎的臨床特征

3.1 臨床及病變特征

DHAV潛伏期為1~2 d，臨床表現(xiàn)主要是全身性抽搐，運(yùn)動失調(diào)，兩腳痙攣，頭向后仰呈角弓反張狀，身體倒向一側(cè)或就地旋轉(zhuǎn)等神經(jīng)癥狀；剖檢病變主要出現(xiàn)于肝臟，表現(xiàn)為腫大、質(zhì)脆、色暗淡或發(fā)黃，表面有大小不等的出血斑或出血點。

3.2 組織病理變化

病理變化出現(xiàn)嚴(yán)重的肝壞死、炎性細(xì)胞滲出及膽管上皮細(xì)胞增生，非化膿性腦炎等變化。伍莉等[18]用DHAV-A感染雛鴨發(fā)現(xiàn)攻毒后12 h，肝、脾、腎及胰等器官組織以變性為主；攻毒后24 h呈現(xiàn)明顯的壞死性病變；攻毒后72~168 h，則出現(xiàn)較為明顯的增生性病變。

3.3 理化特征及生化指標(biāo)

DHAV呈球形或類球形，直徑20~40 nm，無囊膜，無血凝性，胞漿內(nèi)繁殖。DHAV耐酸(pH 3.0)，耐熱；對乙醚、氯仿、胰酶和常見消毒劑有抵抗力。

DHAV感染雛鴨的血清生化指標(biāo)表現(xiàn)為血清中葡萄糖、總蛋白、白蛋白含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的變化有一定規(guī)律性，且自由基參與鴨甲型病毒性肝炎的致病過程。

4 鴨甲型肝炎病毒的分子遺傳與進(jìn)化

GenBank數(shù)據(jù)庫中有49株DHAV-A全基因組序列，14株DHAV-C全基因組序列。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，DHAV-A可分成兩大支 (圖1)；毒株的進(jìn)化規(guī)律與時間性和地域性沒有明顯的聯(lián)系；不同地域、國家之間存在進(jìn)化地位十分相近的病毒，例如2007年越南疫苗株VXXT與94年韓國株DHV-HS、2005年臺灣株5886同在一個小分支，同源性分別為99.2%、95.4%，后兩者之間的同源性為 95.5%；2008年我國分離株LY0801與1995年韓國株DHV-HSS處于姊妹進(jìn)化分支，同源性為94.3%；北京地區(qū)F、JX毒株與蘭州獸醫(yī)研究所分離的 HDHV1-HB、HDHV1-GD毒株親緣性較近，同源性分別為95.8%~99.8%。結(jié)果表明DHAV-A有可能在相鄰國家、地域間的鴨群中傳播。

圖1 DHAV-A基因型49株病毒全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of complete genome of DHAV-A.

從DHAV-C型系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 (圖2) 可知，韓國分離株進(jìn)化地位接近并形成獨立的一個小分支，中國分離株獨自形成一個分支；1999年分離株GD與2008年佛山分離株FS親緣較近；2010年7月劉明等自病鵝體內(nèi)分離的毒株JT與廣東分離株C-GY處于姊妹進(jìn)化分支，兩者之間同源性高達(dá)99.4% (圖3)，進(jìn)化樹顯示DHAV-C有擴(kuò)大感染譜從鴨向鵝傳播的趨勢。另外，2008年我國分離株B63與2009年越南株DN2獨成一支，且全基因組序列比對也顯示DN2和B63兩毒株與其他毒株差異較大，兩者之間差異最小，同源性達(dá)96%。

圖2 DHAV-C基因型核苷酸序列同源性分析Fig. 2 Homology analysis of DHAV-C strains.

圖3 DHAV-C基因型14株病毒全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of complete genome of DHAV-C.

5 鴨甲型肝炎病毒的基因組結(jié)構(gòu)與功能

基因組全序列測定顯示 DHAV基因組是一種單股正鏈RNA分子，由5′非編碼區(qū) (5′ UTR)、開放閱讀框 (ORF)、3′非編碼區(qū) (3′ UTR)和ploy (A) 組成。到目前為止，研究人員所測基因組結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)為是否存在L蛋白及2A蛋白的數(shù)目 (表2)。

5.1 開放閱讀框

開放閱讀框 ORF編碼的多聚蛋白在病毒包裝過程中，先自我切割形成P1、P2和P3前體蛋白，再由自身編碼的3C蛋白酶 (3 Cpro) 進(jìn)行二級加工，最終被切割成12個成熟產(chǎn)物[22](圖4)。

表1 DHAV基因組結(jié)構(gòu)Table 1 The genetic structure of DHAV

5.1.1 結(jié)構(gòu)蛋白

在小RNA病毒中，結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP3和 VP1位于病毒殼體的表面，參與病毒抗原位點的形成。王麗艷等[24]發(fā)現(xiàn)DHAV-A結(jié)構(gòu)蛋白均存在類似其他小RNA病毒的八鏈反向平行β桶結(jié)構(gòu)，氨基酸序列差異主要位于連接β片層的環(huán)區(qū)，而這些區(qū)域在其他小RNA病毒中是主要免疫原。

圖4 DHAV基因組結(jié)構(gòu)示意圖[23]Fig.4 The schematic diagram of genetic structure for DHAV[23].

表2 非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能Table 2 The characteristics and functions of non-structural protein

近年研究發(fā)現(xiàn)在DHAV-A基因結(jié)構(gòu)中VP0蛋白缺少被進(jìn)一步水解成VP4和VP2的酶解位點[19-21]。劉燕等[25]最近研究發(fā)現(xiàn)VP3蛋白N端富含堿性氨基酸、約20 aa長的區(qū)域含有主要的抗原決定簇，能夠誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)。

在小RNA病毒中，VP1蛋白作為主要的宿主保護(hù)蛋白，編碼主要的抗原位點并具有主要的型特異性中和位點[26]，是決定病毒抗原性的主要成分。DHAV-C與DHAV-A各基因的氨基酸序列比較得出結(jié)構(gòu)基因以VP1的變異最為突出，源于DHAV-C的VP1較DHAV-A存在多個氨基酸的插入/缺失和位點突變。Jin等[27]對DHAV的序列進(jìn)行分析，提示 VP1 是主要的抗原位點；范衛(wèi)國等[28]對其親水性、表面可能性及抗原指數(shù)等參數(shù)進(jìn)行分析，認(rèn)為位于VP1蛋白分子表面的區(qū)段最可能是B細(xì)胞表位的優(yōu)勢區(qū)段，而該區(qū)段恰是其變異位點。

5.1.2 非結(jié)構(gòu)蛋白

隨著基因結(jié)構(gòu)研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者對DHAV非結(jié)構(gòu)蛋白的研究也取得了一定進(jìn)展。

5.2 非編碼區(qū)

DHAV 5′UTR的IRES元件可起始下游蛋白的翻譯，且不受真核起始因子 (elF) 4F活性的影響[29]。趙偉等[30]通過點突變發(fā)現(xiàn)頸環(huán)結(jié)構(gòu)SL1、SL2和Ⅲe區(qū)是維持IRES啟動內(nèi)部翻譯起始功能的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)域。3′UTR在小RNA病毒科中最長[31]；相比DHAV-A，DHAV-C 3′UTR的5′末端存在一段約50 nt的插入序列，加上其他區(qū)域的插入?缺失，使后者的3′UTR比前者長51 nt~52 nt。poly (A) 是合成負(fù)鏈RNA的模板，其長度與負(fù)鏈RNA的合成效率及病毒RNA的感染能力有關(guān)[32]。

6 鴨甲型肝炎病毒的診斷方法

臨床上診斷鴨甲型病毒性肝炎應(yīng)注意與鴨瘟、番鴨細(xì)小病毒、雛鴨副傷寒、禽霍亂等進(jìn)行區(qū)分。

6.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA

隨著單克隆抗體技術(shù)的成熟應(yīng)用，ELISA成為重要的檢測方法之一。它簡便、快速、特異性強(qiáng)，敏感性高，重復(fù)性好，但單抗的供應(yīng)尚未商業(yè)化，使其推廣受到了限制。馬秀麗等[34]和Liu等[35]用 VP1基因在大腸桿菌中表達(dá)，并以純化的重組蛋白為抗原建立鴨甲型病毒性肝炎抗體檢測ELISA法。

6.2 中和試驗

中和試驗是普遍認(rèn)為的權(quán)威診斷方法，但其操作繁瑣、費(fèi)時、成本高，不便于快速診斷，不適于臨床的推廣應(yīng)用。Kaleta[37]和陳琨等[38]分別利用DHAV及其陽性血清在鴨腎、鴨胚肝細(xì)胞單層上進(jìn)行微量血清中和試驗，用于病毒鑒定、疫病診斷和免疫監(jiān)測，敏感性高于鴨胚中和試驗。

6.3 其他方法

瓊脂擴(kuò)散試驗簡便易行、易于推廣，但靈敏度不高且較易產(chǎn)生非特異性沉淀；凝膠試驗特異、靈敏、簡便、快速，卻由于非特異性凝血因子影響及不同批次制備的紅細(xì)胞在敏感性和穩(wěn)定性方面存在波動，限制了IHA推廣應(yīng)用，早期建立的協(xié)同凝集試驗為測定 DHAV強(qiáng)弱毒株提供了一種簡便易行的方法；PCR操作簡單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、易標(biāo)準(zhǔn)化，且可以檢測病原體中特異性的核苷酸序列，多以 DHAV-A 3AB、3D、VP1基因保守序列設(shè)計引物建立[39-40]，目前已建立了 DHAV-A和 DHAV-C的鑒別RT-PCR、DHAV-A型巢式PCR和實時熒光定量RT-PCR；熒光抗體技術(shù)直觀、快速、敏感性高，可用于病原的檢測和鑒定，但費(fèi)用和對設(shè)備的要求較高；免疫膠體金檢測技術(shù)簡便、快速、靈敏、直觀，亦對設(shè)備的要求較高，借此程安春等[39]觀察到病毒形狀；免疫組織化學(xué)法可用于DHAV在感染雛鴨組織細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位和動態(tài)分布、DHAV感染雛鴨的實驗室診斷、甲醛固定組織的回顧性診斷，目前朱方偉等[41]觀察到DHAV-C的動態(tài)分布特點。

7 鴨甲型肝炎的防治與展望

近年來，鴨甲型病毒性肝炎的發(fā)生由DHAV引起，我國控制該病應(yīng)主要針對DHAV的A型和C型采取措施。目前預(yù)防和治療DHAV的方法以高免卵黃抗體、高免血清、滅活苗、雞胚化弱毒疫苗為主。其中，高免卵黃抗體和血清對雛鴨被動免疫效果很好，兔抗鴨甲型肝炎病毒高免血清雞胚中和效價達(dá)1∶25以上；代長春[42]自制的卵黃抗體中和效價分別達(dá)1∶28、 1∶28.5以上，且均在感染強(qiáng)毒24 h以內(nèi)對雛鴨進(jìn)行肌肉注射治療效果最為理想。但血清制備較繁雜，成本高產(chǎn)量低，不易滿足生產(chǎn)需要，高免卵黃抗體存在鴨群散毒及卵黃抗體攜帶強(qiáng)毒的潛在危險。臨床上弱毒和滅活疫苗仍是預(yù)防該病最常用的方法，培育的DHAV-C 63代雞胚化弱毒疫苗對1日齡雛鴨安全無致病性，免疫劑量為 2.5×105.12個ELD50/只；蘇敬良等[43]獲得的DHAV-C第54代弱毒具有良好的免疫原性、毒力穩(wěn)定；Kim等[44]用SPF雞胚致弱的DHAV-C第100代弱毒株接種1日齡雛鴨，結(jié)果顯示疫苗保護(hù)力較好，毒力穩(wěn)定。

雖然鴨甲型病毒性肝炎在全球出現(xiàn)并流行了半個多世紀(jì)，近年來國內(nèi)外學(xué)者多側(cè)重于雞胚致弱毒株的篩選和基因工程疫苗的研究，但目前國內(nèi)尚無規(guī)范化的鴨甲型病毒性肝炎疫苗。

8 小結(jié)

鴨甲型病毒性肝炎的流行給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大損失和嚴(yán)重威脅。隨著2006年DHAV-A全長基因組序列測定和報道后，國內(nèi)外對該病毒的研究進(jìn)入一個嶄新的階段和領(lǐng)域，從而開辟了DHAV分子生物學(xué)研究新方向，推動了病毒分類、基因組結(jié)構(gòu)與功能、病毒與宿主之間的相互作用、分子致病機(jī)理等的研究。目前，我國DHAV及其變異株廣泛流行，迫切需要完善鴨甲型病毒性肝炎的流行病學(xué)資料，以尋求更加快速、便捷的分子流行病學(xué)監(jiān)測方法，研制新型疫苗，制定行之有效的標(biāo)準(zhǔn)化免疫診斷程序。

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