一種溫敏復(fù)制缺陷T載體的構(gòu)建及在雞白痢沙門氏菌基因敲除中的應(yīng)用

郭春，林蕾，任妮妮，姜軻冉，袁海霞，余旭平

浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058

基因敲除是后基因組時(shí)代基因功能研究的最有效手段之一，而載體是基因敲除工作的工具和核心[1]。2010年李軍華等[2]以pBS246質(zhì)粒為骨架，在該質(zhì)粒的兩個(gè)LoxP序列之間插入正篩選標(biāo)記基因，并在兩個(gè)LoxP序列外側(cè)分別插入兩組攜帶“8 堿基”酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列(MCS-1和MCS-2) 和負(fù)篩選標(biāo)記基因，成功構(gòu)建了通用型基因打靶載體 pGT-V1，該載體的構(gòu)建為有效開(kāi)展基因打靶提供了新的平臺(tái)。同年姜娜等[3]通過(guò)構(gòu)建打靶載體pHY-Kan-ssaV，成功敲除了傷寒沙門氏菌S.ty2的ssaV基因，獲得傷寒沙門氏菌 ssaV基因缺失株?；蛉笔е甑臉?gòu)建是研究病原微生物致病機(jī)理的重要手段[4]，通過(guò)構(gòu)建致病菌的基因缺失株并分析其表型[5]，有助于快速了解致病基因功能和致病機(jī)制。2007年喬鳳等[6]在pUC19質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，在其多克隆位點(diǎn)處插入卡那霉素抗性基因，并在該基因兩側(cè)添加多個(gè)酶切位點(diǎn)，成功構(gòu)建了pUC19K質(zhì)粒。作者進(jìn)一步利用該自殺質(zhì)粒構(gòu)建了布魯氏菌外膜蛋白 Omp25基因突變株，為細(xì)菌基因功能研究奠定基礎(chǔ)。2011年胡勇等[7]以pMD18-T為載體，利用交錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建了傷寒沙門氏菌bcfD基因敲除突變株，為進(jìn)一步研究 bcfD的基因功能提供有效的技術(shù)手段。

基因敲除方法很多，插入復(fù)制突變法(Insertion duplication mutation，IDM) 是其中一種簡(jiǎn)單高效的基因敲除和基因功能研究方法[8-9]。IDM是利用克隆于載體中的DNA片段與基因組中的相應(yīng)基因同源重組，插入另一拷貝DNA片段和質(zhì)粒骨架，導(dǎo)致重組菌中相應(yīng)基因被截?cái)喽贸DM可以用于基因功能的鑒定，包括細(xì)菌基因的必需性鑒定。2004年Knuth 等[8]采用IDM方法鑒定出鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的 257個(gè)必需基因，該方法構(gòu)建了一個(gè)帶溫度敏感復(fù)制子的pIDM1質(zhì)粒，它在37 ℃時(shí)不能復(fù)制；利用該載體的 KpnⅠ位點(diǎn)，Knuth等[8]克隆了基因組隨機(jī)PCR (rPCR) 產(chǎn)物，構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌本菌株基因組文庫(kù)。通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)溫度的改變，篩選出發(fā)生了同源重組并插入 pIDM1骨架 (含tet基因) 的重組菌。由于必需基因的IDM敲除菌株不能存活，理論上不能通過(guò)培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)換而篩選到重組菌 (實(shí)際上因非同源重組、突變等原因，仍可能篩到極少量的四環(huán)素耐藥菌株)，而非必需基因的敲除不影響細(xì)菌的生存，因此能篩選到大量的重組菌，計(jì)算重組率 (Integration rate per cell，IPC) 可以了解基因的必需性[9]。2007年，Klumpp等[10]還進(jìn)一步測(cè)定經(jīng)pIDM1質(zhì)粒突變的菌株在巨噬細(xì)胞中的存活情況，篩選獲得與巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制相關(guān)的致病基因。

pIDM1是一個(gè)有效的基因敲除載體，但pIDM1質(zhì)粒需要經(jīng)KpnⅠ等單酶切，并需進(jìn)一步脫磷處理以避免自身環(huán)化，操作較繁瑣，成功率低；另一方面，PCR產(chǎn)物也需首先經(jīng)過(guò)酶切，而不能進(jìn)行直接克隆。為此，本實(shí)驗(yàn)擬在 pIDM1的基礎(chǔ)上，在EcoRⅠ和PstⅠ位點(diǎn)間插入XcmⅠ接頭，構(gòu)建可以直接克隆PCR產(chǎn)物的T載體，進(jìn)一步應(yīng)用構(gòu)建的T載體進(jìn)行雞白痢沙門氏菌2個(gè)基因的敲除和必需性檢測(cè)，驗(yàn)證該載體的有效性。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

基因工程宿主菌E. coli TG1由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pIDM1 (溫度敏感、tet抗性) 由德國(guó)博士Fuchs TM (Zentralinstitut für Ern?hrungs-und Lebensmittelforschung (ZIEL) ， Abteilung Mikrobiologie，Technische Universit?t München)饋贈(zèng)；雞白痢沙門氏菌CVCC527菌株購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑和工具酶

EcoRⅠ、PstⅠ等限制性內(nèi)切酶和rTaq DNA聚合酶、dNTPs Mix購(gòu)自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶和 XcmⅠ內(nèi)切酶購(gòu)自 New England Biolabs；DNA marker (DL5000、DL2000) 購(gòu)自東盛公司；AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、PCR清潔試劑盒均購(gòu)自Axygen公司；血液/細(xì)胞/基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京博大泰克生物有限公司；基因片段引物及接頭引物的合成在南京金思瑞生物有限公司完成，測(cè)序由華大基因科技股份有限公司完成。

1.3 引物

本實(shí)驗(yàn)所用引物名稱及序列見(jiàn)表1。

1.4 pIDM-T質(zhì)粒的構(gòu)建

1.4.1 XcmⅠ接頭引物的設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)一對(duì)接頭引物 XcmⅠ-up和 XcmⅠ-dn，并在上下游引物的兩端分別增加EcoRⅠ位點(diǎn)和PstⅠ位點(diǎn) (表1)，以便克隆入質(zhì)粒pIDM1的EcoRⅠ位點(diǎn)和PstⅠ位點(diǎn)間，引物由南京金思特有限公司合成。

1.4.2 接頭的退火、酶切與純化

取XcmⅠ-up、XcmⅠ-dn (10 μmol/L) 各10 μL混合，100 ℃下煮沸5 min，緩慢冷卻至室溫，得到雙鏈接頭。對(duì)接頭進(jìn)行EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切并純化回收。

1.4.3 pIDM1質(zhì)粒的雙酶切

用EcoRⅠ和PstⅠ對(duì)pIDM1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切并回收。

1.4.4 連接

將上述回收的接頭酶切產(chǎn)物與 pIDM1/ EcoRⅠ/PstⅠ酶切產(chǎn)物于16 ℃連接，轉(zhuǎn)化E. coli TG1并篩選得到重組質(zhì)粒pIDM-T。用限制性內(nèi)切酶 XcmⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證和測(cè)序分析，測(cè)序由華大基因科技股份有限公司完成，測(cè)序引物為M13F。1: the EcoR I and the Pst I sites are underlined and the two Xcm I sites are boxed in the Xcm I adapter; 2: the position of the eno and ybdr primers corresponding to the genome sequence of Salmonella gallinarum str. 287/91 (GenBank Accession No. NC_011274.1); 3: the position of universal primers on the constructed pIDM-T vector referred to the Xcm I cassette (for m13F-47up and M13F: upstream of the Xcm I cassette, for m13R-Mdn: downstream of the Xcm I cassette); 4: the theoretically calculated length of DNA fragments amplified together with m13R-Mdn, respectively; 5: the length of DNA amplified from the pIDM-T vector with no insertion.

表1 引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of primers

1.5 選定基因pIDM-T敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

1.5.1 目的基因的選取

根據(jù)DEG必需基因庫(kù) (Database of essential genes) 已有信息和文獻(xiàn)報(bào)道[8,10,12-13]，選取 2個(gè)雞白痢沙門氏菌基因eno和ybdr作為目標(biāo)敲除基因。eno在DEG庫(kù)的多種細(xì)菌中均為必需基因，ybdr在PEC (Profiling of E. coli Chromosome) 數(shù)據(jù)庫(kù)上公布為大腸桿菌的非必需基因，且在本實(shí)驗(yàn)室前期雞白痢沙門氏菌必需基因片段篩選工作中驗(yàn)證為非必需基因。

1.5.2 引物設(shè)計(jì)與合成

從NCBI上公布的雞傷寒沙門氏菌基因組序列中，獲得選定基因的序列，并應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物：eno-up和eno-dn，ybdr-up和ybdr-dn，引物序列見(jiàn)表1，引物由南京金思瑞生物有限公司合成。

1.5.3 目的基因片段的擴(kuò)增與克隆

以S. Pullorum基因組DNA為模板，用上述設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出目的基因片段，將純化后的基因片段與經(jīng)純化的pIDM-T/XcmⅠ載體進(jìn)行16 ℃連接12~14 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。

1.5.4 陽(yáng)性克隆篩選

在pIDM-T質(zhì)粒中具有M13通用引物結(jié)合位點(diǎn)，因此選擇合成 m13F_47up與 m13R_M-dn引物 (表 1)，用于轉(zhuǎn)化克隆的菌落 PCR鑒定。取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子稀釋液為模板，用上述通用引物進(jìn)行菌落 PCR檢測(cè)，篩選陽(yáng)性克隆 (空載體PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為305 bp)，進(jìn)一步抽提陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 pIDM-T質(zhì)粒復(fù)制溫敏特性的測(cè)定

pIDM-T質(zhì)粒是在pIDM1基礎(chǔ)上插入XcmⅠ位點(diǎn)構(gòu)建而成的，理論上它與pIDM1質(zhì)粒一樣，在30 ℃培養(yǎng)時(shí)正常復(fù)制，在37 ℃培養(yǎng)時(shí)質(zhì)粒因不能復(fù)制而逐步在子代細(xì)胞中丟失，新的細(xì)胞將因tet抗性基因丟失而無(wú)法在tet平板上存活，只有重組菌因基因組中整合了一拷貝的質(zhì)粒 (含tet抗性基因) 而能在37 ℃平板上生長(zhǎng)。為驗(yàn)證上述推論，以排除因質(zhì)粒未完全丟失而對(duì)IPC值測(cè)定的影響，我們開(kāi)展了如下實(shí)驗(yàn)：將pIDM-T空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雞白痢沙門氏菌527菌株，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克隆，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，將過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋后涂布四環(huán)素抗性平板，37 ℃培養(yǎng)24~48 h，同時(shí)以克隆有非必需 ybdr基因片段的 pIDM-T_ybdr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌為陽(yáng)性對(duì)照，觀察細(xì)菌 (重組菌落) 的生長(zhǎng)情況。

1.7 IPC值計(jì)算及基因的必需性鑒定

將抽提的陽(yáng)性質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至527菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布含四環(huán)素的 LB平板，30 ℃培養(yǎng)24~48 h。挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆接種于含四環(huán)素的SOC液體培養(yǎng)基中，30 ℃溫和振蕩培養(yǎng)20~24 h。

為使計(jì)數(shù)更加精確和方便，對(duì)稀釋方法進(jìn)行了摸索。對(duì)30 ℃培養(yǎng)條件下的細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)，嘗試了104、105、106、107、108等多個(gè)稀釋梯度；對(duì)37 ℃條件下的重組菌計(jì)數(shù)，我們進(jìn)行過(guò)2倍、3倍、4倍稀釋，比較各個(gè)梯度菌液在平板上的生長(zhǎng)情況，確定最佳稀釋倍數(shù)。據(jù)前期的摸索用96 孔板將菌液稀釋為30倍和120倍，并將稀釋菌液50 μL涂布于含四環(huán)素的LB平板，每個(gè)稀釋度做3次重復(fù)，將平板置于37 ℃培養(yǎng)24~48 h，計(jì)數(shù)重組菌的數(shù)量。同樣再用 96孔板將菌液稀釋為105和106倍，將稀釋菌液50 μL涂布于含四環(huán)素的LB平板，每個(gè)稀釋度做3次重復(fù)，并將平板置于30 ℃培養(yǎng)24~48 h，計(jì)數(shù)菌液中的細(xì)菌總數(shù)。

根據(jù)公式 (IPC=重組子個(gè)數(shù)/細(xì)菌總個(gè)數(shù)，即37 ℃平板菌落總數(shù)/30 ℃平板菌落總數(shù)) 計(jì)算出IPC值。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8,10]，IPC≤1.0×10-6時(shí)判定目的基因?yàn)楸匦杌颍?.0×10-4≤IPC≤1.0×10-2時(shí)判定目的基因?yàn)榉潜匦杌颉?/p>

1.8 雞白痢沙門氏菌突變株重組插入位點(diǎn)的鑒定

參照雞傷寒沙門氏菌基因組全序列，分別在目的基因片段的上游200 bp左右設(shè)計(jì)突變株鑒定引物eno-I-up，ybdr-I-up (表1)，將上述鑒定引物與位于pIDM-T載體上的下游引物m13R-Mdn (或上游引物m13F_47up，因T載體克隆片段時(shí)可以正反向二種方式插入) 組合，對(duì) 37 ℃條件下生長(zhǎng)的2個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定。依據(jù)能否擴(kuò)增出特異的基因片段及片段的測(cè)序結(jié)果鑒定突變株IDM插入位點(diǎn)的正確性。

2 結(jié)果

2.1 pIDM-T質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將XcmⅠ接頭插入pIDM1的EcoRⅠ和PstⅠ后獲得pIDM-T重組質(zhì)粒，為驗(yàn)證接頭已正確插入，用XcmⅠ酶切重組質(zhì)粒，獲得1條約3.9 kb的片段；而未插入接頭的 pIDM1原始質(zhì)粒不能被XcmⅠ酶所消化 (圖1)。用引物M13-F對(duì)已構(gòu)建的pIDM-T質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期一致。

圖1 pIDM-T重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 1 Gel electrophoresis of the recombinant vector pIDM-T identified by enzyme digestion. M: marker (DL5000); 1: pIDM-T digested with XcmⅠ; 2: pIDM1 digested with XcmⅠ; 3: pIDM-T plasmid.

2.2 選定基因pIDM-T敲除質(zhì)粒的構(gòu)建

eno和 ybdr基因擴(kuò)增片段的預(yù)期大小分別為：429 bp和436 bp，電泳結(jié)果顯示與預(yù)期相符(圖2)。用通用引物m13F_47up與m13R_Mdn對(duì)pIDM-T載體克隆的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，理論上陽(yáng)性克隆片段條帶大小為目的基因克隆片段加 300 bp (空載體擴(kuò)增出的條帶大小為305 bp)，對(duì)應(yīng)地eno、ybdr陽(yáng)性克隆的擴(kuò)增長(zhǎng)度分別約為730 bp和740 bp，電泳檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期一致 (圖略)。提取初步鑒定為陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切再次驗(yàn)證，電泳結(jié)果可見(jiàn)兩條帶，小片段與插入片段大小一致 (圖3)。

2.3 pIDM-T質(zhì)粒復(fù)制溫敏特性的測(cè)定

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14]，pIDM1在沙門氏菌細(xì)胞中的質(zhì)?？截悢?shù)約為300個(gè)，盡管細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)時(shí) pIDM1質(zhì)粒不復(fù)制，但它可以繼續(xù)隨細(xì)胞分裂而分配，因此，pIDM1質(zhì)?？勺疃喾峙涞?00多個(gè)子代細(xì)胞中。如果細(xì)菌基因組上沒(méi)有重組的質(zhì)?？截?，新的細(xì)菌細(xì)胞中將因質(zhì)粒丟失而無(wú)法在四環(huán)素平板上存活。pIDM-T質(zhì)粒是在pIDM1質(zhì)粒的基礎(chǔ)上插入 XcmⅠ酶切位點(diǎn)構(gòu)建而成的，理論上它與 pIDM1質(zhì)粒的溫敏特性是一樣的，因此，如果pIDM-T或其衍生質(zhì)粒不與基因組發(fā)生有效的重組，tet基因傳遞給子代細(xì)胞的數(shù)量是有限的。

圖2 目的片段擴(kuò)增Fig. 2 The amplification of the target genes. M: marker (DL2000); 1: amplification without template; 2: eno fragment; 3: ybdr fragment.

圖3 陽(yáng)性質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig. 3 The double digestion of the target plasmid. M: marker (DL5000); 1: EcoRⅠ/PstⅠdouble digestion of pIDM-T_eno; 2: EcoRⅠ/PstⅠdouble digestion of pIDM-T_ybdr.

為驗(yàn)證上述推論，在實(shí)驗(yàn)時(shí)我們將pIDM-T空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雞白痢沙門氏菌527菌株，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌 30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后稀釋涂布于四環(huán)素抗性平板，37 ℃培養(yǎng)約36 h后，觀察細(xì)菌 (重組菌落)的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)在pIDM-T空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌涂布的平板上僅見(jiàn)到較淡的菌苔背景，無(wú)單個(gè)的重組菌落 (圖4A)；而平行開(kāi)展的pIDM-T_ybdr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌則在較淡的菌苔背景上見(jiàn)到明顯的重組菌落 (圖4B，黑色箭頭標(biāo)示)。

由此可見(jiàn)，pIDM-T質(zhì)粒在37 ℃培養(yǎng)時(shí)會(huì)逐步丟失，不會(huì)影響IPC值的測(cè)定。

2.4 IPC值計(jì)算及選定基因的必需性鑒定

將2個(gè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化527菌株，將轉(zhuǎn)化菌株接種LB液體30 ℃增菌，菌液稀釋涂板后分別置于30 ℃和37 ℃培養(yǎng)。30 ℃培養(yǎng)用于計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，而37 ℃培養(yǎng)用于計(jì)數(shù)重組子數(shù)。根據(jù)公式IPC=重組子數(shù)/細(xì)菌總數(shù)=37 ℃平板菌落總數(shù)/30 ℃平板菌落總數(shù)，計(jì)算得eno和ybdr的IPC值分別為1.92×10-7和1.64×10-4(表2)。從測(cè)定數(shù)值看出，eno基因片段的重組率低于1.0×10-6，鑒定為必需基因，而ybdr基因片段重組率較高，鑒定為非必需基因，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖4 pIDM-T及其衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的37 ℃平板培養(yǎng)結(jié)果Fig. 4 Growth of the transformants of pIDM-T and its derivative plasmid in 37 ℃. (A) The growth of the 527 strain with pIDM-T plasmid on tet plate after incubated in 37 ℃ for 36 hours. (B) The growth of the 527 strain with pIDM-T_ybdr plasmid on tet plate after incubated in 37 ℃ for 36 hours. Black arrows point to recombinant colonies grown on the plate.

表2 菌落計(jì)數(shù)及IPC值測(cè)定Table 2 The colony number and IPC value

2.5 雞白痢沙門氏菌突變菌株重組插入位點(diǎn)的鑒定

攜帶非必需的 ybdr基因片段的pIDM-T_ybdr質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至527菌株后，目的基因片段可與細(xì)菌基因組 DNA同源片段發(fā)生重組，pIDM-T質(zhì)粒骨架插入到對(duì)應(yīng)基因中，使目的基因被敲除，同時(shí)使細(xì)菌基因組中攜帶1拷貝的tet抗性基因 (原理圖見(jiàn)圖5)。盡管37 ℃條件下pIDM-T_ybdr質(zhì)粒不能復(fù)制，逐漸丟失，由質(zhì)粒表達(dá)的 tet抗性也隨之消失，但發(fā)生了同源重組的細(xì)菌基因組上仍含有1拷貝的tet基因，因此重組菌可以在四環(huán)素平板上存活。然而，攜帶eno基因片段的pIDM-T_eno質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至 527菌株后，因eno基因的必需性，發(fā)生特異性同源重組的菌株因eno基因的敲除而死亡，因此理論上不可能出現(xiàn)eno基因中插入質(zhì)粒骨架和tet基因的菌株。

為驗(yàn)證上述分析的正確性，我們從37 ℃培養(yǎng)的pIDM-T_ybdr質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板中，隨機(jī)挑選了2個(gè)菌落，用 ybdr-I-up上游引物分別與m13R-Mdn和m13F-47up引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果用ybdr-I-up與m13R-Mdn引物組合時(shí)擴(kuò)增出約750 bp的片段，ybdr-I-up與m13F-47up引物組合擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物 (圖 6)。對(duì)擴(kuò)增出的約750 bp的片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示該片段含有一段ybdr基因序列和小段載體序列 (144 bp)，與預(yù)期一致，說(shuō)明構(gòu)建的SalΔybdr 527突變株是由于pIDM-T載體克隆的ybdr基因片段經(jīng)IDM方式特異性地同源重組的結(jié)果。檢索GenBank中的基因功能注釋，ybdr基因編碼一個(gè)脫氫酶。可能由于雞白痢沙門氏菌527菌株具有多種該脫氫酶的同工酶的緣故，在 LB液體和 LB平板培養(yǎng)SalΔybdr 527突變株和原始野生株時(shí)，未發(fā)現(xiàn)二者具有明顯的生長(zhǎng)特性差異。突變株的其他表型鑒定有待進(jìn)一步開(kāi)展。

圖5 SalΔybdr突變株構(gòu)建原理圖Fig. 5 Construction of the SalΔybdr mutant strain by homologous recombination. A 436 bp fragment of ybdr gene was cloned into pIDM-T, and the resulting IDM mutant SalΔybdr carries a truncated gene followed by linearized plasmid pIDM-T and rest part of the gene.

對(duì)eno基因敲除平板篩選到的1個(gè)tet抗性菌落，我們用引物eno-I-up分別與m13R-Mdn和m13F-47up引物組合對(duì)其進(jìn)行 PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果無(wú)任何條帶 (圖6)，對(duì)野生菌株菌液的對(duì)照PCR擴(kuò)增也無(wú)任何產(chǎn)物，因此可初步確定質(zhì)粒沒(méi)有特異性地插入eno基因中。進(jìn)一步以該菌培養(yǎng)物的稀釋液為模板，以eno-up和 eno-dn為引物擴(kuò)增eno基因片段，電泳檢測(cè)獲得與預(yù)期一致的DNA條帶 (約430 bp，圖略)，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步顯示eno基因?yàn)橐吧?，說(shuō)明eno基因沒(méi)有被插入突變。將該菌抽提質(zhì)粒，電泳結(jié)果未檢測(cè)到與pIDM-T質(zhì)粒大小相近的小質(zhì)粒 (約3.9 kb，圖略)。由此推測(cè)，該克隆可能是質(zhì)粒隨機(jī)重組至細(xì)菌基因組的結(jié)果，具體重組位置有待進(jìn)一步測(cè)定。

3 討論

圖6 突變菌株的PCR鑒定Fig. 6 PCR verification of the mutant strains. M: marker (DL5000); 1,2: SalΔybdr mutant strain amplified by ybdr-I-up and m13R-Mdn; 3: SalΔeno mutant strain amplified by eno-I-up and m13R-Mdn; 4: SalΔeno mutant amplification by eno-I-up and m13F-47up; 5: SalΔybdr mutant amplification by ybdr-I-up and m13F-47up; 6,7: wild type control.

Taq DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，在擴(kuò)增DNA的3′末端非模板依賴地加上一個(gè)腺苷酸。為解決PCR產(chǎn)物的克隆，需要在線性化載體的3′末端多加一個(gè)的脫氧胸腺嘧啶核苷 (T)，這就是TA克隆，相應(yīng)的載體通常被稱為 T-載體[15-16]。商品 T載體多數(shù)是在平末端上加 T而成，而XcmⅠ識(shí)別CCA (N5/N4) TGG序列，切割后產(chǎn)生單個(gè)核苷酸突出的3￠末端，且切割位點(diǎn)附近的堿基可以簡(jiǎn)并[16]。將識(shí)別序列的第8位設(shè)為T，重組質(zhì)粒在兩個(gè)反向XcmⅠ序列接頭處經(jīng)XcmⅠ切割，便可獲得線性化的T載體。

Knuth等[8]用pIDM1質(zhì)粒構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌的基因文庫(kù)，通過(guò) IDM的方法鑒定了鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的必需基因，我們采用類似的方法構(gòu)建了雞白痢沙門氏菌 527菌株文庫(kù)，并篩選了 527菌株的必需基因 (結(jié)果待發(fā)表)。pIDM1可用于克隆隨機(jī)片段，構(gòu)建文庫(kù)，并有效地應(yīng)用于必需基因的大規(guī)模篩選和鑒定，但在實(shí)際應(yīng)用時(shí)該質(zhì)粒需首先經(jīng) KpnⅠ酶切線性化，然后用熱敏磷酸酶 (Antarctic phosphates)脫磷處理，防止自身環(huán)化[17]，操作繁瑣，成功率低；另一方面它不能直接克隆 PCR產(chǎn)物，因此PCR產(chǎn)物克隆前同樣需要酶切。為方便地克隆PCR產(chǎn)物，提高效率，以用于特定基因的敲除，我們?cè)?pIDM1載體的多克隆位點(diǎn)插入了兩個(gè)串聯(lián)XcmⅠ接頭，對(duì)pIDM1質(zhì)粒進(jìn)行了T載體改造，經(jīng)檢測(cè)正確。構(gòu)建的pIDM-T質(zhì)粒經(jīng)XcmⅠ酶切后即可成為T載體，能直接快速有效地克隆未經(jīng)處理的單個(gè)目標(biāo)PCR產(chǎn)物。由于T載體采用內(nèi)切酶法制備，保證了質(zhì)量的穩(wěn)定，且成本低廉，適合普通實(shí)驗(yàn)室使用。

理論上，pIDM-T與 pIDM1質(zhì)粒一樣，在37 ℃培養(yǎng)時(shí)不復(fù)制，存在于細(xì)菌中的原始質(zhì)?？截悓㈦S細(xì)菌的分裂而分配給有限的子代細(xì)胞，若質(zhì)粒不與基因組發(fā)生有效的重組，經(jīng)一定代數(shù)后，pIDM-T質(zhì)粒將從新增殖的細(xì)胞中丟失而使細(xì)菌無(wú)法在四環(huán)素平板上存活。為驗(yàn)證上述推論，我們將pIDM-T空質(zhì)粒和pIDM-T_ybdr重組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化雞白痢沙門氏菌527菌株，通過(guò)觀察兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在 37 ℃ tet平板上的生長(zhǎng)情況，我們發(fā)現(xiàn)：pIDM-T空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌在平板上僅形成淡淡的菌苔背景，未見(jiàn)單個(gè)重組菌落；而 pIDM-T_ybdr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌則在較淡的菌苔背景上生長(zhǎng)有明顯的重組菌落。由此可見(jiàn)，pIDM-T質(zhì)粒在37 ℃培養(yǎng)時(shí)會(huì)逐漸丟失，轉(zhuǎn)化菌在四環(huán)素平板上才出現(xiàn)了有限增殖，因此，它不影響IPC值的測(cè)定。

為使細(xì)菌總數(shù)和重組菌計(jì)數(shù)更加精確和方便，以獲得準(zhǔn)確的IPC值，我們對(duì)稀釋方法進(jìn)行了摸索。對(duì)30 ℃培養(yǎng)條件下的細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)，我們?cè)鴩L試 104、105、106、107、108等多個(gè) 10倍梯度稀釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在設(shè)定的 96孔板培養(yǎng)條件下50 μL菌液中的細(xì)菌總數(shù)在2.5×106~2.1×108之間，105和 106倍兩個(gè)稀釋梯度較為合適；對(duì)37 ℃條件下的重組菌計(jì)數(shù)，我們?cè)鴩L試10、20、40、80和160倍 (經(jīng)10倍稀釋后再倍比稀釋)，10、30、90和270倍 (10倍稀釋后再3倍稀釋) 及30、120和480倍 (30倍稀釋后再4倍稀釋) 等多個(gè)稀釋梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稀釋倍數(shù)偏低會(huì)因?yàn)樾纬删Χ谏w了重組菌落的識(shí)別，稀釋過(guò)高則平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，而30和120倍二個(gè)梯度較為適合。

與pIDM1質(zhì)粒一樣，pIDM-T可應(yīng)用于特定基因的敲除及必需性的鑒定。為驗(yàn)證pIDM-T的有效性，我們選取eno和ybdr兩個(gè)基因，運(yùn)用插入復(fù)制突變法在雞白痢沙門氏菌527菌株中進(jìn)行了必需性鑒定和敲除。將eno和ybdr擴(kuò)增片段克隆于線性化的pIDM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)鑒定獲得帶有目的片段的重組質(zhì)粒。將攜帶有目的片段的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至527菌株，將轉(zhuǎn)化子增菌后稀釋涂板，并分別置于30 ℃和37 ℃培養(yǎng)，計(jì)數(shù)重組子和菌落總數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算得出eno的IPC值為1.92×10-7，鑒定為必需基因；ybdr的IPC值為1.64×10-4，鑒定為非必需基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 DEG必需基因庫(kù) (Database of essential genes)、大腸桿菌 PEC(Profiling of E. coli Chromosome)數(shù)據(jù)庫(kù)的已有信息，以及文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]和本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

為確認(rèn)IDM敲除非必需的ybdr基因的插入位點(diǎn)的正確性，以及IDM無(wú)法敲除必需基因eno，我們從ybdr基因敲除的篩選平板上隨機(jī)挑取了2個(gè)克隆，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒插入ybdr基因的交界處片段，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)pIDM-T質(zhì)粒骨架已插入在ybdr基因所在的細(xì)菌基因組特定位點(diǎn)，由此說(shuō)明，ybdr基因已通過(guò)IDM重組被特異性地敲除。ybdr基因是一個(gè)脫氫酶編碼基因[18-19]，可能由于雞白痢沙門氏菌527菌株具有多種該脫氫酶的同工酶的緣故，我們未發(fā)現(xiàn)SalΔybdr 527突變株和原始野生株在LB液體和LB平板生長(zhǎng)特性的差異。

我們對(duì)eno基因敲除篩選平板上生長(zhǎng)的唯一1個(gè)抗性菌落同樣進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果無(wú)任何條帶；進(jìn)一步對(duì)該菌落的eno基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)和測(cè)序結(jié)果均顯示eno基因?yàn)橐吧?，由此說(shuō)明eno基因未被pIDM-T質(zhì)粒骨架插入而破壞。對(duì)該抗性菌培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，結(jié)果也未檢測(cè)到與 pIDM-T質(zhì)粒大小相近的質(zhì)粒，因此我們推測(cè)該菌落可能是質(zhì)粒隨機(jī)重組至細(xì)菌基因組的結(jié)果。據(jù)報(bào)道，Knuth等[8]應(yīng)用pIDM1質(zhì)粒鑒定鼠傷寒沙門氏菌 257個(gè)必需基因時(shí)，超過(guò)1/3的克隆有非特異性重組現(xiàn)象 (即IPC值大于零)，我們?cè)陂_(kāi)展雞白痢沙門氏菌必需基因克隆鑒定時(shí)也有類似的現(xiàn)象 (結(jié)果待發(fā)表)，可見(jiàn)這種隨機(jī)重組現(xiàn)象是較普遍的，它可能受基因片段長(zhǎng)度等多種因素影響[20]，但因IPC值的數(shù)量級(jí)不同，它不影響基因必需性的鑒定。

由此可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pIDM-T質(zhì)粒是一個(gè)有效快速的基因敲除載體，它可以快速克隆PCR產(chǎn)物，并應(yīng)用IDM方法快速有效地鑒定特定基因的必需性，構(gòu)建非必需基因的突變株，為雞白痢沙門氏菌基因功能研究提供了一種有效的手段。

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