酶催化熒光法測(cè)定鹽酸腎上腺素

(周口師范學(xué)院化學(xué)系，河南周口 466001)

鹽酸腎上腺素為兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)，是一類(lèi)非常重要的生理學(xué)神經(jīng)遞質(zhì)。通過(guò)檢測(cè)人體腎上腺素及其代謝產(chǎn)物的濃度，為藥物分析及臨床提供參考，因此，探索快速、方便、靈敏檢測(cè)鹽酸腎上腺素的方法具有重要意義［1］。目前測(cè)定的方法有高效液相色譜法、熒光光度法、電化學(xué)分析法、毛細(xì)管電泳法、化學(xué)發(fā)光分析法、分光光度法等［2-7］。目前檢測(cè)鹽酸腎上腺素的方法雖各有其特點(diǎn)，但在靈敏度、特異度和檢測(cè)速度等方面大多還不能滿(mǎn)足臨床疾病診斷的需要。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析法在臨床、藥物、農(nóng)業(yè)、工業(yè)過(guò)程檢測(cè)中具有廣泛的應(yīng)用［8］，采用酶催化熒光猝滅法分析鹽酸腎上腺素還未見(jiàn)報(bào)道。

本文基于在堿性介質(zhì)中，利用鹽酸腎上腺素對(duì)血紅蛋白酶催化熒光體系具有強(qiáng)烈的猝滅作用，建立了酶催化熒光法測(cè)定鹽酸腎上腺素的新方法。方法的檢出限為3.4×10-8mol/L。該法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn)，已成功的應(yīng)用于藥物制劑中鹽酸腎上腺素含量的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JASCO FP-750型熒光光度儀，日本分光公司;pHS-3C型酸度計(jì)，上海理達(dá)儀器廠;BS210S電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司。

血紅蛋白，上海伯奧生物科學(xué)有限公司、L-酪氨酸，北京化學(xué)試劑廠;H2O2溶液;NH3-NH4Cl緩沖溶液。

鹽酸腎上腺素:中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.494 0 g，用二次蒸餾水溶解配成2.2×10-2mol/L儲(chǔ)備液(4℃冰箱保存);工作液:用二次蒸餾水逐級(jí)稀釋成2.2×10-4mol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL比色管中依次加入2.0 mL pH值為9.1 的 NH3-NH4Cl緩沖溶液，4.0 mL 濃度為 1.0×10-3mol/L的L-酪氨酸溶液，不同濃度的鹽酸腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.8 mL濃度為1.0×10-5mol/L的牛血紅蛋白溶液，0.6 mL濃度為 1.0×10-3mol/L的H2O2溶液，用水定容。在室溫下放置20 min后，在選定的激發(fā)波長(zhǎng)315 nm下測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度為F，以不加鹽酸腎上腺素的空白溶液為參比，同時(shí)測(cè)得空白溶液的熒光強(qiáng)度F0，計(jì)算熒光強(qiáng)度差值即熒光強(qiáng)度猝滅值ΔF=F0－F，以熒光強(qiáng)度猝滅值ΔF對(duì)鹽酸腎上腺素的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

在血紅蛋白的作用下，H2O2能夠氧化L-酪氨酸產(chǎn)生熒光二聚體。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸腎上腺素對(duì)此熒光體系有強(qiáng)烈的猝滅作用，藉此建立了一種用熒光猝滅法測(cè)定鹽酸腎上腺素的新方法。熒光光譜如圖1所示，其中熒光二聚體的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別λex=315 nm，λem=404 nm。由圖1可知，鹽酸腎上腺素的加入能夠顯著的抑制該體系的熒光強(qiáng)度。

圖1 體系的熒光光譜

2.2 測(cè)定條件的優(yōu)化

2.2.1 酸度條件的選擇

溶液酸堿度對(duì)酶促反應(yīng)有很大的影響，所以NH3-NH4Cl緩沖溶液的pH值要嚴(yán)格控制。分別考察了 pH 值為 8.3、8.6、8.9、9.1、9.5 的 NH3-NH4Cl緩沖溶液的影響，如圖2所示。隨著pH值的升高，鹽酸腎上腺素對(duì)熒光體系的猝滅作用先增大后減小，在pH值為9.1時(shí)ΔF值最大，且體系基本恒定。因此，實(shí)驗(yàn)中選擇pH值為9.1的NH3-NH4Cl緩沖溶液作為反應(yīng)介質(zhì)。

2.2.2 H2O2濃度的影響

H2O2在反應(yīng)體系中作為氫受體底物，它的濃度直接影響到反應(yīng)的速度和完全程度。濃度過(guò)高，鹽酸腎上腺素易被氧化;濃度過(guò)低，氧化反應(yīng)不完全。因此，選擇H2O2的濃度為6.0×10-5mol/L。

2.2.3 L－ 酪氨酸濃度的影響

分別試驗(yàn)了不同濃度的L-酪氨酸對(duì)熒光體系的影響。實(shí)驗(yàn)證明:隨著L-酪氨酸濃度的增大，熒光猝滅作用逐漸先增強(qiáng)后減弱。當(dāng)L-酪氨酸溶液的濃度為4.0×10-4mol/L時(shí)熒光猝滅作用最大。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇L-酪氨酸溶液的最佳濃度為4.0×10-4mol/L。

圖2 pH值的影響

2.2.4 血紅蛋白濃度的影響

分別試驗(yàn)了不同濃度的血紅蛋白對(duì)熒光體系的影響。結(jié)果表明:隨著血紅蛋白Hb的濃度的增大，鹽酸腎上腺素對(duì)熒光體系的猝滅作用先增大再逐漸減小，當(dāng)Hb的濃度為8.0×10-7mol/L時(shí)，鹽酸腎上腺素對(duì)熒光體系的猝滅作用最強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)選擇Hb的濃度為8.0×10-7mol/L。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間的確定

研究了不同鹽酸腎上腺素濃度下反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)行為。隨著鹽酸腎上腺素濃度增大，其熒光猝滅作用也逐漸增強(qiáng);同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速度逐漸減慢，室溫20 min后體系趨于穩(wěn)定，因此，選擇20 min作為體系的反應(yīng)時(shí)間。

2.3 分析方法特性

在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，鹽酸腎上腺素的濃度在1.5×10-7～2.2×10-6mol/L范圍內(nèi)對(duì)該體系的熒光強(qiáng)度猝滅值ΔF有較好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸為:

方法檢出限，經(jīng)3Sb/k經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算為3.4×10-8mol/L，其中Sb為空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為線(xiàn)性校正斜率。對(duì)濃度為1.2×10-6mol/L的鹽酸腎上腺素進(jìn)行11次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%，表明該方法有較好的重現(xiàn)性和較高的精密度。

表1 不同測(cè)定鹽酸腎上腺素方法的比較

將本法與其它用于測(cè)定鹽酸異丙嗪的方法進(jìn)行比較(見(jiàn)表1)，本法具有較高的靈敏度。

2.4 共存物質(zhì)的影響

按試驗(yàn)方法雖濃度為1.2×10-6mol/L的鹽酸腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)，當(dāng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差不大于±5.0%時(shí)，下列離子不干擾測(cè)定(以mol/L計(jì)):Na+、Cl-、F-、K+、NO-3、CO2-3、葡萄糖、淀粉、硬脂酸鈉(1 000)，EDTA、PO3-4、抗壞血酸(500)，Ca2+、OH-、Cu2+、Mg2+(100)，F(xiàn)e3+(10)。

2.5 樣品分析

表3 鹽酸腎上腺素注射液分析結(jié)果(n=5)

將不同批號(hào)的鹽酸腎上腺素注射液適當(dāng)稀釋后按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可以看出，加標(biāo)回收率為94.5% ～105.4%，結(jié)果滿(mǎn)意。

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