新能量狀態(tài)下抗腫瘤光敏劑的研究

李 翀，卓先勤

(1三亞市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，海南三亞572000;2瓊州學(xué)院理工學(xué)院，海南三亞572022)

0 引言

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)對腫瘤殺傷作用的基礎(chǔ)研究，近年來引起人們的高度重視.Survivin是近年新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤特異性凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)，具有抑制凋亡效應(yīng)蛋白酶caspase活性、參與細胞周期調(diào)控及調(diào)節(jié)細胞有絲分裂等多種生物學(xué)作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］.

在假定新能量狀態(tài)下光敏劑為有重大潛力光敏劑的基礎(chǔ)上，探討了新能量狀態(tài)下光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力及其產(chǎn)生的單線態(tài)氧對腫瘤細胞的殺傷能力，旨在為新能量狀態(tài)下光敏劑光敏劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 新能量狀態(tài)下光敏劑

以文獻［2，3］的方法制備溶于5%二氯甲烷的甲醇溶液成1mg/ml新能量狀態(tài)下光敏劑儲液.

1.2 NADPH磷酸鹽重水緩沖液的配制［4］

將樣品配成2 mg/ml的二甲基亞砜溶液.稱取0.626gNa2HPO2·12H2O和0.0314gKH2PO4溶于適量水中，使總體積為100ml，即得pH7.4－7.8的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液.稱取33.25 mg還原型輔酶Ⅱ鈉鹽加入上述磷酸鹽重水緩沖液，即為0.4 mmol/L NADPH磷酸鹽重水緩沖液.

1.3 新能量狀態(tài)下光敏劑在重水中對NADPH氧化作用的光動力敏化效應(yīng)

將新能量狀態(tài)下光敏劑與適量NADPH磷酸鹽緩沖液混勻，使樣品濃度分別為1、2、3、4、5μmol/L，光源由高壓汞燈加濾光片(800 nm)獲得，然后在紫外分光光度計上于波長340 nm測定輻照后樣品溶液中NADPH殘留量.用同樣照光的不含NADPH而含等量同濃度樣品的磷酸鹽緩沖液作空白，以照光的不含樣品而含等量水的NADPH緩沖液作對照，測定各個樣品于不同濃度下NADPH剩余百分率，取3次測定的平均值，結(jié)果見表1.

1.4 細胞培養(yǎng)

用RPMI 1640(胎牛血清FCS含量10%)培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代的腫瘤細胞，在細胞達指數(shù)相增長后，通過二倍稀釋法取一定量的細胞培養(yǎng)液，使用血細胞記數(shù)板確定細胞的濃度.

1.5 新能量狀態(tài)下光敏劑中新能量狀態(tài)下光敏劑濃度參數(shù)的探討

將新能量狀態(tài)下光敏劑儲液用5%二氯甲烷的甲醇溶液依次稀釋成20、10、5、3、1 μg/ml，作為新能量狀態(tài)下光敏劑參考濃度.

對腫瘤細胞進行新能量狀態(tài)下光敏劑－PDT處理的同時，以單純光照組、單純新能量狀態(tài)下光敏劑組為處理組的對照，并以未處理的細胞為空白對照.取密度為1×105個/ml的細胞，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔98 μl細胞液加入2 μl對應(yīng)濃度得新能量狀態(tài)下光敏劑溶液，每一濃度設(shè)5個復(fù)孔，在CO2培養(yǎng)箱中暗作用3 h后，到光反應(yīng)室照光50 min，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱中暗作用4 h后，輕輕吸取上清70 μl，加入DMSO 150 μl，混勻，至甲溶液中溶解，于酶聯(lián)檢測儀上測定各孔的OD490值.計算細胞的存活率:

細胞存活率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%.

每孔重復(fù)計數(shù)3次取平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 D2O中新能量狀態(tài)下光敏劑對NADPH的光動力敏化效應(yīng)

表1 鋅菌綠素在D2O中對NADPH光氧化作用的敏化效應(yīng)

由表1可見，鋅菌綠素在重水中對NADPH具有較強的光氧化作用，在10 μg·ml－1時可以使90%以上的NADPH發(fā)生光氧化作用，提示鋅菌綠素具有較強的單線態(tài)氧產(chǎn)率.

2.2 不同新能量狀態(tài)下光敏劑濃度對腫瘤細胞存活率的影響

圖1 不同新能量狀態(tài)下光敏劑濃度對腫瘤細胞存活率的影響

由圖1可知，隨著新能量狀態(tài)下光敏劑濃度的增加，腫瘤細胞存活率呈明顯的下降趨勢.當新能量狀態(tài)下光敏劑濃度為10 μg/ml和20 μg/ml，腫瘤細胞的存活率分別為5.7%和5.2%，兩者之間無顯著差異.

3 討論

光動力療法治療腫瘤，臨床上已證實有確切療效，但其作用機理尚未完全闡明.一般認為，PDT主要通過一下三方面機制而達到治療腫瘤的作用［5］:(1)直接殺死腫瘤細胞，(2)破壞腫瘤組織內(nèi)的血管，(3)免疫調(diào)節(jié)作用.如中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所周傳農(nóng)［6］研究員的課題組經(jīng)十多年努力，認為光動力作用主要是通過微血管內(nèi)皮細胞損傷和微循環(huán)障礙引起局部缺血、缺氧，導(dǎo)致腫瘤細胞的繼發(fā)死亡.

PDT是一種高選擇性腫瘤治療方法，通過光敏劑在腫瘤細胞中聚積，受光照后產(chǎn)生氧自由基達到殺死腫瘤細胞的目的，它具有毒性低，易重復(fù)治療等優(yōu)點，氧化損傷是其主要的治療機制.但體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)其機制遠較單純氧化損傷復(fù)雜，血管損害、凋亡等多種因素均參與其中.從研究中可以看出，鋅菌綠素具有高單線態(tài)氧產(chǎn)率并對腫瘤細胞具有高殺傷，提示單線態(tài)氧對細胞的殺傷作用在PDT機理中具有重要地位.

［1］許德余.光動力治癌藥物的歷史、現(xiàn)狀、進展、問題和前景［J］.中國激光醫(yī)學(xué)雜志，2009，10(1):44～47.

［2］王夢亮，常如波，劉滇生.金屬細菌葉綠素的合成及其抗腫瘤活性研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，2005，40(10):920－923.

［3］M.Wendling，K.Lapouge，F(xiàn).van Mourik，et al.Steady－state spectroscopy of zinc－bacteriopheophytin containing LH1 － an in vitro and in silico study.Chem.Phys，2011，275:31 －45.

［4］方勇，許德余，劉建飛.卟啉還原合成二氫卟吩及其光生物活性研究［J］.中國激光醫(yī)學(xué)雜志，2010，10(2):82－85.

［5］Kristjan Plaetzer，Tobias Kiesslich，Thomas Verbare and so on.The Modes of Cell Death Induced by PDT:An Overview［J］.Med.Laser.Appl，2003，18:7 －19.

［6］周傳農(nóng).國外光動力療法新進展——國際光動力學(xué)會第九屆年會簡介［J］.中國激光醫(yī)學(xué)雜志，2003，12(4):262－264.