4個(gè)品系西藏?cái)M溞12S rRNA基因序列及其分子進(jìn)化研究

趙文，李睿

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

4個(gè)品系西藏?cái)M溞12S rRNA基因序列及其分子進(jìn)化研究

趙文，李睿

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116023）

應(yīng)用線粒體12S rRNA基因序列對(duì)4個(gè)地理品系的西藏?cái)M溞 (納木卡錯(cuò)品系、色林錯(cuò)品系、班戈湖品系、賽里木湖品系）進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育研究，并結(jié)合GenBank中7種相近溞類的12S rRNA基因序列探討了西藏?cái)M溞的分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明，在4個(gè)品系西藏?cái)M溞的4條12S rRNA基因序列中，A、T、G、C的平均含量分別為31.9%、32.45%、17.33%和17.95%，A+T的含量64.35%，G+C的含量為35.28%，A+T的含量明顯高于G+C的含量，符合節(jié)肢動(dòng)物A、T含量高的特點(diǎn)。聚類分析結(jié)果表明，西藏?cái)M溞和其他溞屬枝角類動(dòng)物有著明顯的遺傳差異，說(shuō)明西藏?cái)M溞在枝角類生物學(xué)研究中有其獨(dú)特的地位。遺傳多樣性計(jì)算結(jié)果表明:在4個(gè)品系的西藏?cái)M溞中，納木卡錯(cuò)品系與色林錯(cuò)品系以及納木卡錯(cuò)品系與班戈湖品系的遺傳相似性均較高，達(dá)98%左右;班戈湖品系與納木卡錯(cuò)品系間的遺傳距離最小，僅為0.0126，班戈湖與賽里木湖間的遺傳距離最大，為0.0199;與其他溞屬枝角類相比較，4個(gè)品系西藏?cái)M溞種內(nèi)差異相對(duì)不明顯，而與其他溞種間的差異顯著，西藏?cái)M溞有著較高的遺傳多樣性水平。研究表明，12S rRNA基因序列包含有可靠的進(jìn)化信息，可作為西藏?cái)M溞種類鑒定良好的分子標(biāo)記，同時(shí)利用這種分子標(biāo)記法從分子系統(tǒng)進(jìn)化方面證明了Daphnia tibetana和Daphniopsis tibetanaSars應(yīng)分屬于不同的種。

西藏?cái)M溞;12S rRNA基因序列;遺傳多樣性;系統(tǒng)進(jìn)化

西藏?cái)M溞Daphniopsis tibetana Sars隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門 Arthropoda、甲殼綱 Crustacea、鰓足亞綱Branchiapoda、枝角目Cladocera、溞科 Daphniidae、擬溞屬Daphniopsis。 Sars［1］在 1903年對(duì)亞洲中部的枝角類調(diào)查中，最早發(fā)現(xiàn)了這一種類并對(duì)其進(jìn)行了簡(jiǎn)單的介紹，因其具有介于溞屬和低額溞屬之間的中間特征，故將其歸為擬溞屬并命名為Daphniopsis tibetana。之后，Hedin［2］在1907年對(duì)西藏地區(qū)中、西部的調(diào)查研究時(shí)，在色林錯(cuò)也發(fā)現(xiàn)了這種體色較黑的西藏?cái)M溞。趙文等［3］在對(duì)西藏羌北無(wú)人區(qū)科學(xué)考察中，再次檢出此溞，并于2001年12月在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將其進(jìn)行海水馴化，獲得了這一種類實(shí)驗(yàn)室內(nèi)生物學(xué)參數(shù)的第一手材料。西藏?cái)M溞主要分布于中國(guó)西藏、青海、新疆等地，在國(guó)外分布于前蘇聯(lián)和印度，為一冷水種和鹽水種，在枝角類生物學(xué)研究中有其獨(dú)特的地位［4］。西藏?cái)M溞在中國(guó)西北部的很多半咸水湖中為優(yōu)勢(shì)種群，能在高寒、貧營(yíng)養(yǎng)性鹽水水體中存活，而且密度和生物量相當(dāng)可觀，經(jīng)過(guò)引種或馴化后，西藏?cái)M溞可作為寒冷季節(jié)海水魚蝦苗種高效適口的一種活餌料。目前，有關(guān)西藏?cái)M溞遺傳多樣性的研究報(bào)道較少［5］。線粒體12S rRNA基因作為研究動(dòng)植物相近種及種內(nèi)群體間親緣關(guān)系的有效標(biāo)記，也是調(diào)查動(dòng)物群體遺傳多樣性并了解物種形成及進(jìn)化歷程的有效工具。使用線粒體12S rRNA基因作為分子遺傳標(biāo)記，對(duì)于研究西藏?cái)M溞的起源進(jìn)化、親緣關(guān)系以及遺傳結(jié)構(gòu)等方面都具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 西藏?cái)M溞 試驗(yàn)用西藏?cái)M溞有西藏地區(qū)的3個(gè)品系和新疆地區(qū)的1個(gè)品系，經(jīng)形態(tài)鑒定，本試驗(yàn)所用的西藏?cái)M溞均為同一個(gè)種。西藏品系于2007年5月采自藏北3個(gè)湖泊——納木卡錯(cuò)、色林錯(cuò)和班戈湖，分別記為NMKC、SLC和BG;新疆品系于2007年11月采自新疆賽里木湖，記為SLM。西藏?cái)M溞4個(gè)品系的取樣資料如表1所示，其中西藏班戈湖品系的樣品采集后饑餓48 h后用液氮保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室;而其他群體均為在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴化培養(yǎng)的群體。

1.1.2 主要試劑 Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒 (Promega Corporation USA），TaqDNA聚合酶10×PCR Buffer，引物 (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品），瓊脂糖Bioscience。

表1 西藏?cái)M溞的采樣地點(diǎn)、時(shí)間和鹽度Tab.1 Localities，time and salinity for samples of Daphniopsis tibetana Sars

1.2 方法

1.2.1 西藏?cái)M溞的馴化培養(yǎng) 除班戈湖品系外其余3個(gè)西藏?cái)M溞品系均馴化培養(yǎng)于大連海洋大學(xué)水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，根據(jù)每個(gè)種群的培養(yǎng)鹽度(表1）配制各自的培養(yǎng)用水 (經(jīng)煮沸消毒的海水），水溫為16℃，用折射鹽度計(jì) (ATAGOS－10）檢測(cè)稀釋海水的鹽度。用鹽藻Dunaliella salina、蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa等單胞藻進(jìn)行投喂。

1.2.2 DNA的提取 使用Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒分別對(duì)4個(gè)品系的西藏?cái)M溞提取單只樣品的基因組DNA。每個(gè)品系取樣30只，除班戈湖品系用液氮保存樣品外，其他3個(gè)品系取樣前均饑餓處理48 h，以消除餌料藻類DNA對(duì)西藏?cái)M溞個(gè)體DNA的影響。由于溞體微小，提取的單只DNA含量也很少，利用瓊脂糖電泳檢測(cè)很難發(fā)現(xiàn)條帶，本試驗(yàn)中通過(guò)使用紫外分光光度儀測(cè)定樣本吸收紫外輻射量來(lái)確定樣品中DNA的含量和純度。結(jié)果顯示，絕大部分樣品在260 nm波長(zhǎng)下的吸光度與280 nm波長(zhǎng)下的吸光度的比值為1.8～1.9，符合試驗(yàn)要求。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 引物設(shè)計(jì)參考 Raay等［6］公布的蚤狀溞Daphnia pulex12S rRNA基因特異性引物片段，由寶生物工程 (大連）有限公司合成。

根據(jù)試驗(yàn)要求確定最佳PCR反應(yīng)體系為:模板 DNA 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，dNTP 0.5 μL，上、下游引物各 1 μL，Taq 酶(5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 16.3 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?72℃下預(yù)變性2 min;94℃下變性30 s，56℃下退火30 s，72℃下延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃下再延伸10 min，4℃下保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)［6－7］。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化及目的片段序列的測(cè)定 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物效果好的樣品進(jìn)行純化和測(cè)序，為提高序列精確度，使用正反鏈雙向測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果的比對(duì)與分析 使用Mega 4.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比較，并將比對(duì)的序列保存為Clustal格式，使用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行比對(duì)，利用BIOEDIT進(jìn)行圖像處理，結(jié)果見圖1。

將校準(zhǔn)后的序列利用DNAMAN進(jìn)行堿基組成分析，并計(jì)算各序列間未校正的遺傳距離 (P距離）。對(duì)空位的處理采用完全刪除 (complete deletion），同時(shí)采用Smith＆Waterman(最佳比對(duì)）策略進(jìn)行動(dòng)態(tài)比對(duì)，得出西藏?cái)M溞以及7個(gè)溞屬物種序列的同源性。

用Mega 4.0軟件去除非編碼位點(diǎn)，用“bootstrap”自舉檢測(cè)1 000次表明各分支的置信度，構(gòu)建NJ樹。

2 結(jié)果

2.1 序列同源性的比較

測(cè)序結(jié)果 (圖1）經(jīng)校對(duì)后上傳至GenBank，使用Blast軟件進(jìn)行序列相似性搜索，相似度最大的是西藏?cái)M溞線粒體12S rRNA基因序列 (序列號(hào)為AY921475.1），相似度為96%;其次為多刺裸腹溞線粒體12S rRNA基因序列 (序列號(hào)為AF217136.2），相似度為95%。測(cè)序結(jié)果顯示，4個(gè)品系西藏?cái)M溞12S rRNA基因序列具有高度的保守性，每一品系30個(gè)個(gè)體的相似度分別為:納木卡錯(cuò)品系99.3%、班戈湖品系98.9%、色林錯(cuò)品系99.1%、賽里木湖品系98.1%。

2.2 西藏?cái)M溞12S rRNA基因序列的組成

對(duì)4個(gè)品系的西藏?cái)M溞序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明 (表2）:在西藏?cái)M溞的4條12S rRNA基因序列中，A、T、G、C的平均含量分別為 31.9%、32.45%、17.33%和 17.95%，A+T的含量為64.35%，G+C的含量為35.28%，A+T的含量明顯高于G+C的含量，符合節(jié)肢動(dòng)物A、T含量高的特點(diǎn)。

圖1 4個(gè)品系西藏?cái)M溞線粒體12S rRNA基因片段序列Fig.1 Nucleotide sequence of mitochondrial 12S rRNA region in four populations of Daphniopsis tibetana Sars

表2 4個(gè)品系西藏?cái)M溞12S rRNA基因序列核苷酸組成Tab.2 Nucleotide composition of 12S rRNA gene fragment sequences of our populations of Daphniopsis tibetana Sars %

4個(gè)品系西藏?cái)M溞12S rRNA基因片段序列堿基轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)及不同位點(diǎn)堿基對(duì)出現(xiàn)的頻率見表3。從表3可見，4個(gè)品系西藏?cái)M溞12S rRNA基因序列在第2密碼子和第3密碼子共出現(xiàn)了3次AG轉(zhuǎn)換，僅在第2密碼子發(fā)生了1次TC轉(zhuǎn)換。4個(gè)品系西藏?cái)M溞基因序列中轉(zhuǎn)換高于顛換，其中在第3密碼子的轉(zhuǎn)換率、顛換率分別為1.08%和0.54%，R值為2.0;在第2密碼子的轉(zhuǎn)換率、顛換率分別為1.59%和0;在第1密碼子的轉(zhuǎn)換率、顛換率分別為0.53%和0;所有序列的轉(zhuǎn)換和顛換的比值R為6.0。在核苷酸替換中，顛換很少發(fā)生，轉(zhuǎn)換主要發(fā)生在A與G之間?？偟膩?lái)說(shuō)，4個(gè)序列之間并未體現(xiàn)出較大的單核苷酸多態(tài)性。

表3 4個(gè)品系西藏?cái)M溞12S rRNA基因片段序列堿基轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)及不同位點(diǎn)堿基對(duì)出現(xiàn)頻率Tab.3 Nucleotide pair frequencies and transition/transversion ratios of 12S rRNA gene sequences in four strains of Daphniopsis tibetana Sars

2.3 西藏?cái)M溞群體間的遺傳多樣性

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取不同地理品系的7種相似 序 列 溞 類Daphnialongicephala(AF217136.2）、Daphnia cf.bolivariAP－2005 from Spain(DQ116599.1）、Daphnia atkinsonifrom Israel(DQ116595.1）、Daphnia angulata strainVictoria(AF217137.2）、Daphnia angulata fromAustralia(AY921460.1）、Daphnia salinifera(AF217131.2）、Daphniopsis tibetana(AY921475.1）的12S rRNA基因片段，計(jì)算不同種間的遺傳距離。從表4可見:屬間的遺傳距離明顯大于屬內(nèi)的遺傳距離，西藏?cái)M溞與其他種類之間的遺傳距離基本都在0.57以上，說(shuō)明西藏?cái)M溞與其他溞存在較大的遺傳進(jìn)化差異;而4個(gè)品系西藏?cái)M溞中，班戈湖品系與納木卡錯(cuò)品系間的遺傳距離最小，僅為0.0126，班戈湖品系與賽里木湖品系間的遺傳距離最大，為0.0199。

對(duì)11個(gè)種群溞類的12S rRNA進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果表明 (表4）:最大遺傳相似性依然存在于西藏?cái)M溞4個(gè)品系之間，納木卡錯(cuò)品系與色林錯(cuò)品系以及納木卡錯(cuò)品系與班戈湖品系的遺傳相似性較高，達(dá)98%左右;其他7種溞中，屬內(nèi)的遺傳相似性也明顯大于屬間的遺傳相似性。

2.4 序列分析及系統(tǒng)樹的構(gòu)建

從圖2可見:西藏?cái)M溞品系與其他7種溞基本劃分為2大分支，在第Ⅰ大分支中，D.tibetana顯然與其他6種溞具有一定的差異;西藏?cái)M溞所在的第Ⅱ大分支中，賽里木湖品系獨(dú)立于3個(gè)西藏品系分化為一支，可以明顯看出，由于西藏和新疆地理位置所造成的差異。

由所建的NJ樹可以看出，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出與遺傳距離和同源性相吻合的信息。

3 討論

3.1 西藏?cái)M溞12S rRNA序列組成和分子進(jìn)化分析

在西藏?cái)M溞4個(gè)品系的12S rRNA序列中，表現(xiàn)出節(jié)肢動(dòng)物門線粒體DNA序列A、T含量高的特征，其中A+T含量為64.35%，G+C含量為35.28%，A+T含量明顯高于G+C含量。線粒體12S rRNA在生物進(jìn)化過(guò)程中很保守，通常被用作屬以上分類單位遺傳多樣性的鑒定指標(biāo)。從各品系西藏?cái)M溞的種間遺傳距離以及相關(guān)NJ樹可以看出，由于地理隔離所產(chǎn)生的種間差異很明顯，本試驗(yàn)中所用的西藏?cái)M溞采自于中國(guó)西藏和新疆，從進(jìn)化樹上看，賽里木湖品系和3個(gè)西藏品系的距離較遠(yuǎn)，但是雖然其序列間存在差異，也不能簡(jiǎn)單地歸結(jié)于地理隔離的原因，更深入的研究有待于采集更廣泛的西藏?cái)M溞品系和開展對(duì)線粒體其它部分序列的測(cè)序。

表4 西藏?cái)M溞和溞屬7種枝角類12S rRNA基因片段序列種間遺傳距離(P距離）及遺傳相似性Tab.4 P－distance and homology matrix of 12S rRNA gene fragment sequences in 7 species between Daphnia and Daphniopsis tibetana Sars

圖2 4個(gè)品系西藏?cái)M溞與7種溞Nei's遺傳距離的NJ樹Fig.2 NJ trees of fours strains of Daphniopsis tibetana and 7 species of Daphnia based on Nei's genetic distance

對(duì)西藏地區(qū)3個(gè)品系的西藏?cái)M溞進(jìn)行分析，最為接近的是納木卡錯(cuò)品系和班戈湖品系，它們構(gòu)成一相近群。從3個(gè)湖泊的地理位置看，納木卡錯(cuò)(30°46'N，90°52'E）至班戈湖 (31°43'N，89°29'E）的直線距離為120.7 km，至色林錯(cuò) (31°50'N，89°00'E）的直線距離為213.4 km，班戈湖至色林錯(cuò)的直線距離為87.5 km，就納木卡錯(cuò)品系而言，地理距離與其遺傳距離有一定的聯(lián)系。

西藏?cái)M溞是冷水性廣鹽種，從鹽度方面看，3個(gè)湖泊都為內(nèi)陸鹽水湖泊［7］，納木卡錯(cuò)鹽度為16，班戈湖為20，而色林錯(cuò)為30，其鹽度差異與遺傳進(jìn)化樹也是相對(duì)應(yīng)的。從pH方面看，班戈湖和納木卡錯(cuò)都為9.5，色林錯(cuò)為9.3［8］，其 pH差異與遺傳進(jìn)化樹相符。趙文等［5］認(rèn)為，納木卡錯(cuò)和班戈湖的西藏?cái)M溞可能來(lái)源于同一地理種群，分子進(jìn)化距離及進(jìn)化樹已印證了這一觀點(diǎn)，但其更具體的分類有待于對(duì)其他方面進(jìn)一步地分析。從湖泊容積看，3個(gè)湖泊之中，色林錯(cuò)面積為1 658 km2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于班戈湖 (80 km2）和納木卡錯(cuò) (12 km2），

水體容積大小對(duì)溞類的影響是間接的，可能通過(guò)不同的因子起作用，3個(gè)湖泊水體容積的大小關(guān)系與本試驗(yàn)對(duì)3個(gè)品系西藏?cái)M溞的分子遺傳的進(jìn)化分類關(guān)系也基本相符。

3.2 關(guān)于Daphnia tibetana和Daphniopsis tibetana Sars

Sars在1903年最早發(fā)現(xiàn)西藏?cái)M溞，將其歸為擬溞，并命名為Daphniopsis tibetana。1936年Wagler將該溞歸屬于溞屬，命名為西藏溞Daphnia tibetana，拒絕將其歸屬于擬溞屬，自此對(duì)這種枝角類的命名便開始了分類上的爭(zhēng)論［9］。趙文等［9］的研究表明，西藏溞和西藏?cái)M溞的外部形態(tài)具有截然不同的特征，它們應(yīng)分屬于不同的種，最明顯的區(qū)別為西藏溞的殼瓣后背角有殼刺，而西藏?cái)M溞的殼瓣后背角鈍圓不生成殼刺。

從傳統(tǒng)意義上來(lái)看，本試驗(yàn)中所研究的Daphniopsis tibetanaSars與Daphnia tibetana屬于高度相似種，但通過(guò)表4和圖2的遺傳距離以及遺傳相似性來(lái)看，Daphnia tibetana與4個(gè)品系Daphniopsis tibetanaSars之間依然存在著較大的差異:平均遺傳距離為0.3746，平均遺傳相似性為71.6%。Daphnia tibetana和Daphniopsis tibetanaSars在線粒體12S rRNA上的差異從分子方面證明了Daphnia tibetana和Daphniopsis tibetanaSars應(yīng)分屬于不同的種，這與形態(tài)鑒定結(jié)果［9］相一致。

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［5］ 趙文，畢進(jìn)紅，韓婷婷，等.西藏?cái)M溞遺傳多樣性的初步研究［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26(2）:108－113.

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［7］ 鄭綿平，向軍，魏新俊，等.青藏高原鹽湖［M］.北京:科學(xué)技術(shù)出版社，1989.

［8］ 趙文，霍元子，高敬.西藏?cái)M溞營(yíng)養(yǎng)成分的分析與評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2006，13(3）:446－451.

［9］ 趙文，王巧晗.西藏?cái)M溞形態(tài)結(jié)構(gòu)的再描述［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20(3）:165－173.

Molecular phylogeny of four strains of Daphniopsis tibetana Sars based on mitochondrial 12S rRNA gene sequences

ZHAO Wen，LI Rui
(Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province，College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

The molecular phylogeny of four strains ofDaphniopsis tibetanaSars(NMKC，SLC，BG and SLM）were studied based on mitochondrial 12S rRNA gene sequences.The molecular evolution ofD.tibetanawere dicussed by means of 12S rRNA gene sequence of the corresponding sequences of 7 other species ofDaphniaCladocera from GenBank.The results showed that the mean concentration of A，T，G，C for 4 strainsD.tibetanaof 12 SrRNA gene sequences were 31.9%，32.45%，17.33%and 17.95%，respectively.The base pair concentrations were 64.35%in A+T and 35.28%in G+C.These were accordance with feature of higher A，T concentration in Arthropoda animals.There were significant differences betweenD.tibetanaand other species of cladocera，according to the results of genetic distance and using UPGMA cluster analysis in the Mega 4 software package procedures，indicating thatD.tibetanahas an unique position in the research of biology of Cladocera.The highest genetic similarity were between NMKC strain and SLC strain as well as between NMKC strain and BG strain，the genetic distance between NMKC strain and BG strain was the lowest in 0.0126，and highest was between SLM strain and BG strain in 0.0199.It was indicated that the interspecific difference was very significant，and the intraspecific difference is unconspicuous compared with other species ofDaphnia suchas.All above shows thatD.tibetanaSars has high levels of genetic diversity，and mitochondrial 12S rRNA can provide the reliable evolutionary information，and it can be used as molecular markers for phylogeny events.In addition，Daphniopsis tibetanaSars andDaphnia tibetanawere proved to be different species in molecular aspects by this method.

Daphniopsis tibetanaSars;12S rRNA;genetic diversity;phylogeny

S917.4

A

2095－1388(2012）04－0300－06

2011－12－20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (31072210）

趙文 (1963－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E－mail:zhaowen@dlou.edu.cn