應(yīng)用組織芯片檢測大腸癌組織中p27和cyclin D1的表達(dá)及意義

金錦蓮 張端蓮 談新提

（武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系430071）

大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在各個(gè)國家和地區(qū)發(fā)病率存在差異，美國和歐洲的發(fā)病率較高，亞洲較低［1］。目前大腸癌占全世界癌癥發(fā)病的第3位，且全球大腸癌發(fā)病率仍以2%的速度遞增，我國大腸癌發(fā)病率近些年以較快的速度增加，尤以大城市為顯，引起人們高度重視，在歐美大腸癌死亡率高居惡性腫瘤的第2位，我國年輕人直腸癌發(fā)病率較高，且預(yù)后較差［2－3］。

大腸癌的發(fā)生和發(fā)展是腫瘤發(fā)生的多階段過程和多基因改變的典型例子。細(xì)胞周期中Gl／S期調(diào)控點(diǎn)在細(xì)胞惡變的過程中起著很重要的作用，許多癌基因和抑癌基因正是作用于G1／S期調(diào)控點(diǎn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化［4］。近來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是腫瘤發(fā)生的重要原因，p27和cyclinD1是兩種重要細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［5］。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法在組織芯片上檢測大腸癌組織中p27與cyclinD1表達(dá)情況，探討它們在大腸癌中表達(dá)的意義及相互關(guān)系，為進(jìn)一步研究大腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制和臨床治療的靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1.材 料

人大腸癌芯片4張由桂林泛譜生物技術(shù)有限公司構(gòu)建，15×10點(diǎn)陣，每點(diǎn)直徑1.1mm，4μm厚，其中包括70例大腸癌組織，5例癌旁組織，雙芯布陣。所有組織來自臨床外科手術(shù)切除標(biāo)本，經(jīng)10%中性緩沖甲醛固定24h。大腸癌患者中，男40例，女30例，年齡22-76（平均56.8）歲。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。所有病例術(shù)前均未實(shí)施放療、化療。兔抗人cyclinD1多克隆抗體、鼠抗人p27多克隆抗體（北京中杉生物技術(shù)有限公司），羊抗兔／鼠生物素化二抗。

2.方 法

免疫組織化學(xué)法檢測大腸癌組織芯片中p27和cyclinD1的表達(dá)。

2.1 具體步驟：（1）4μm 組織切片常規(guī)脫蠟入水；（2）抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)法）；（3）滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；（5）分別滴加一抗；（6）滴加鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物復(fù)合物37℃濕盒孵育；（7）滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色；（8）蘇木素復(fù)染；（9）梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；（10）用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為p27和cyclinD1的陽性對照組。

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

p27和cyclinD1都是以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。

2.3 采用美國CRI公司Nuance Fx多光譜成像系統(tǒng)對p27和cyclinD1的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值（陽性面積率＝單位面積中陽性反應(yīng)的總面積／單位面積中細(xì)胞的總面積×100%）。

3.統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理

量子點(diǎn)染色結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 13.0軟件對各組反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

結(jié) 果

1.p 27的表達(dá)

大腸癌組織中可見少量的棕黃色顆粒，p27表達(dá)弱（圖1）；癌旁組織中可見較多的棕黃色顆粒，p27表達(dá)強(qiáng)（圖2）。圖像分析結(jié)果見表1。大腸癌組p27的表達(dá)明顯低于癌旁組織（P＜0.05）。（表1）。

2.c yclinD1的表達(dá)

大腸癌組織內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，cyclinD1呈強(qiáng)陽性表達(dá)（圖3）；癌旁組織核內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，cyclinD1表達(dá)弱（圖4）。圖像分析結(jié)果顯示：大腸癌組織的平均光密度和陽性面積率見表2。經(jīng)q檢驗(yàn)，大腸癌組織與癌旁組織之間，cyclinD1的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表2）。

表2 大腸癌和癌旁組織中cyclinD1表達(dá)的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of cyclinD1 in Colorectal carcinoma and cancer side tissue（ˉx±s）

討 論

大腸癌是最常見的消化系惡性腫瘤之一，雖然臨床上對其可采取綜合性的治療措施，但其發(fā)病率和死亡率仍居惡性腫瘤的前列，且呈逐年上升的趨勢。腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移仍是大腸癌患者死亡的主要原因。目前臨床上尚缺乏有效預(yù)測大腸癌轉(zhuǎn)移和早期診斷的方法。

在細(xì)胞增殖過程中，細(xì)胞周期素（cyclin）、細(xì)胞周期依賴性激酶（cyclin2dependent kinase，CDK）和細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑（cyclin2dependent kinase inhibitor，CD2KI）起著非常重要的作用。cyclin和CDK起正調(diào)控作用，而CDKI起負(fù)調(diào)控作用［6－7］。

細(xì)胞周期素是一些蛋白質(zhì)在細(xì)胞周期中周期性地積累和降解。在人類，周期素有5類，即cyclin-A，cyclin-B，cyclin-C，cyclin-D，cyclin-E，分別參與細(xì)胞周期中不同時(shí)期的調(diào)節(jié)。cyclin D1基因又稱CCND1、bcl-1或PRAD1，是近年提出的重要的原癌基因，它定位于11q13染色體上，全長15kb，含有5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子［8－10］。在人類多種惡性腫瘤中存在擴(kuò)增、重排及轉(zhuǎn)位等異常，正常細(xì)胞周期受到促進(jìn)和抑制2種相反調(diào)控，包括細(xì)胞周期素基因的表達(dá)、細(xì)胞周期素的降解以及CDKS的磷酸化和去磷酸化，兩者處于動(dòng)態(tài)平衡［11］。如果由于各種因素使平衡被打破，無論是促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)增強(qiáng)，或者是抑制細(xì)胞增殖的信號(hào)減弱到某種程度，細(xì)胞增殖都會(huì)失控，進(jìn)而出現(xiàn)腫瘤［12］。

cyclin-D1與腫瘤的關(guān)系是近年研究的熱點(diǎn)，它是由CCND1基因編碼的產(chǎn)物，促進(jìn)細(xì)胞生長與分裂。正常情況下cyclin-D1蛋白在G1期是恒定的或保持在極低水平；異常情況下其過度表達(dá)增加其同CDKS的結(jié)合，刺激細(xì)胞分裂和增殖，形成癌瘤。研究發(fā)現(xiàn)，cyclin-D1蛋白的過度表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［13－16］。

細(xì)胞周期中有兩個(gè)關(guān)鍵的控制點(diǎn)，即G1PS期轉(zhuǎn)換和G2PM期轉(zhuǎn)換。嚴(yán)格控制這兩個(gè)“控制點(diǎn)”的通行，可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞周期的控制。但如果這兩個(gè)“控制點(diǎn)”失控，可使本來停止增殖或生理性凋亡的細(xì)胞不停地進(jìn)入細(xì)胞周期，造成惡性增生［17－18］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測人大腸癌組織芯片和5例癌旁組織中p27的表達(dá)。并采用多光譜成像系統(tǒng)對免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行圖像分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大腸癌組織中P27呈低表達(dá)，癌旁組織中呈高表達(dá)。圖像分析結(jié)果顯示。大腸癌組織中的平均光密度和陽性面積率明顯低于癌旁組織（P＜0.05）。推測p27基因突變在腫瘤的發(fā)生過程中是稀有事件，p27與腫瘤的關(guān)系主要體現(xiàn)在其蛋白水平上，表現(xiàn)為p27蛋白的減少或缺失其機(jī)制可能為p27高表達(dá)抑制CDK的活性，使腫瘤細(xì)胞停滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；而p27在大腸癌的低表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化，促使腫瘤發(fā)展。并提示在大腸癌中，p27蛋白表達(dá)下降，表明p27蛋白參與大腸癌細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)，這種表達(dá)模式有利于癌細(xì)胞的快速增殖，細(xì)胞分裂中產(chǎn)生的異常染色體來不及修復(fù)致使異常細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)致大腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

在我們的試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中cyclinD1呈高表達(dá)，癌旁組織中cyclinD1呈低表達(dá)，圖像分析結(jié)果顯示：大腸癌組織中的平均光密度和陽性面積率明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。結(jié)果表明：CyclinD1蛋白在大腸癌的癌變過程中具有促進(jìn)細(xì)胞過度增殖的作用，并最終導(dǎo)致調(diào)節(jié)失控和惡性腫瘤的發(fā)生；cyclinD1在細(xì)胞周期關(guān)鍵限速點(diǎn)G1至S期轉(zhuǎn)換中，通過激活CDK4或CDK6使后者催化一系列關(guān)鍵底物而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子釋放，促進(jìn)DNA合成而發(fā)揮加速細(xì)胞增殖的正性調(diào)節(jié)作用。

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟、多階段、多種癌基因參與的復(fù)雜病理過程，在我們的試驗(yàn)中大腸癌組織中p27的低表達(dá)與cyclinD1的高表達(dá)同時(shí)存在，與病變的進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)，多基因異?？商崾敬竽c癌組織中的轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后不良，對這兩種基因進(jìn)行監(jiān)測，可以更好的指導(dǎo)臨床治療。

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圖 版 說 明

圖1 p27的表達(dá) 大腸癌組織中可見少量的棕黃色顆粒，p27表達(dá)弱，S-P×400

圖2 p27的表達(dá) 癌旁組織中可見較多的棕黃色顆粒，p27表達(dá)強(qiáng)，S-P×400

圖3 cyclinD1的表達(dá) 大腸癌組織內(nèi)可見較多棕黃色顆粒，cyclinD1表達(dá)強(qiáng)；S-P×400

圖4 cyclinD1的表達(dá) 癌旁組織漿內(nèi)可見少量的棕黃色顆粒，cyclinD1表達(dá)弱.S-P×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1p27expression There were few brown particles in Colorectal carcinoma，p27expressed weakly（→）.S-P×400

Fig.2p27expression There were plenty of brown particles in cancer side tissue，p27expressed strongly（→）.S-P×400

Fig.3cyclinD1expression There were plenty of brown particles in Colorectal carcinoma，cyclinD1expressed strongly（→）.S-P×400

Fig.4cyclinD1expression There were few brown particles in cancer side tissue，cyclinD1expressed weakly（→）.S-P×400