四川省自貢市兒童與成人分離肺炎鏈球菌株的血清型分布及抗生素敏感性比較

章 成，董一山，黃文祥

(1.四川省自貢市第四人民醫(yī)院感染科，四川 自貢 643000;2.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 402260; 3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)感染研究所，重慶 400016)

肺炎鏈球菌是社區(qū)獲得性肺炎、院內(nèi)獲得性肺炎比較常見(jiàn)細(xì)菌之一［1，2］，且感染率有逐年上升的趨勢(shì)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的多器官功能損害，是導(dǎo)致老年人群、兒童人群死亡的常見(jiàn)致病菌之一。根據(jù)莢膜多糖不同的抗原性，可將肺炎鏈球菌分為90個(gè)血清型［3］，其常見(jiàn)的血清分型流行情況存在著一定的地理差異，對(duì)不同地區(qū)肺炎鏈球菌進(jìn)行正確的血清型分型以明確該地區(qū)的常見(jiàn)血清型，對(duì)該地區(qū)預(yù)防接種選用合適的肺炎多糖疫苗，以及指導(dǎo)臨床抗生素運(yùn)用，減少肺炎死亡率具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)2009年6月至2010年6月四川省自貢市兒童與成人分離出的肺炎鏈球菌株常見(jiàn)血清型和藥敏情況分析比較，了解不同人群分離肺炎菌的血清型特點(diǎn)及藥物敏感特點(diǎn)，用于指導(dǎo)本地區(qū)疫苗及抗菌素合理運(yùn)用。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 2009年6月至2010年6月收集四川省自貢市四家醫(yī)院門(mén)診、住院部分離的166株肺炎鏈球菌。86株來(lái)源于兒童(來(lái)源:自貢市第一人民醫(yī)院22株，自貢市婦幼保健院35株，自貢市第四人民醫(yī)院21株，自貢市第三人民醫(yī)院8株)，80株來(lái)源于成人(來(lái)源:自貢市第一人民醫(yī)院30株，自貢市第四人民醫(yī)院32株，自貢市第三人民醫(yī)院18株);64株來(lái)源于痰培養(yǎng)，80株來(lái)源口咽試紙，10株來(lái)源血培養(yǎng)，10株來(lái)源分泌物，2株來(lái)源腦脊液培養(yǎng)。藥敏質(zhì)量控制株肺炎鏈球菌ATCC49619由重慶市寄生蟲(chóng)病傳染病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。血清分型質(zhì)量控制株1型肺炎鏈球菌購(gòu)自丹麥國(guó)家血清研究所。

1.2 細(xì)菌鑒定 依據(jù)菌落特點(diǎn)、奧普拓欣敏感試驗(yàn)、膽酸溶菌試驗(yàn)及肺炎鏈球菌分型抗血清鑒定［5，6］。所用Columbia基礎(chǔ)培養(yǎng)基購(gòu)自重慶龐通醫(yī)療器械有限公司，Mueller-Hinton(MH)液體培養(yǎng)基購(gòu)自O(shè)xoid公司，5%脫纖維綿羊血購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.3 血清學(xué)分型 用pneumo test-kit試劑盒(購(gòu)自丹麥Statens Serum institute)，采用丹麥Neufeld在1902年建立的莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)分型。嚴(yán)格按照使用說(shuō)明，使特異性抗血清與肺炎鏈球菌的莢膜抗原特異性結(jié)合形成復(fù)合物，則細(xì)菌莢膜顯著增大、腫脹，相差顯微鏡下則發(fā)現(xiàn)莢膜顯著腫大，菌體周?chē)霈F(xiàn)一無(wú)色而寬的環(huán)狀物，判斷莢膜腫脹試驗(yàn)陽(yáng)性。該試劑盒對(duì)多數(shù)菌株僅能作群的鑒別。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法測(cè)定166株肺炎鏈球菌對(duì)頭孢唑林、青霉素、阿奇霉素、克林霉素和左氧氟沙星等五種抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。判斷界值參照 CLSI標(biāo)準(zhǔn)(2009年版)應(yīng)為［7］。ATCC 49619作為質(zhì)控株跟隨整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程，結(jié)果完全在控。所用標(biāo)準(zhǔn)品:頭孢唑林粉劑(200 mg)、青霉素粉劑(200 mg)、阿奇霉素粉劑(200 mg)、克林霉素粉劑(200 mg)、左氧氟沙星粉劑(200 mg)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。方法:采用二倍瓊脂稀釋法檢測(cè)所有菌株的MIC，即先將各種抗菌藥標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋成多種梯度濃度，將各濃度的藥液分別加入到已溶化并冷卻至50℃左右的含5%脫纖維綿羊血MH瓊脂中，混勻后立即傾注平皿，使培養(yǎng)基的抗生素最終濃度達(dá)到檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)藥物濃度。用微量多點(diǎn)接種儀將標(biāo)準(zhǔn)濃度的菌懸液接種到含不同濃度抗菌藥物的上述瓊脂平板表面，置36℃的二氧化碳孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)觀察結(jié)果，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗生素濃度確定為MIC，分別統(tǒng)計(jì)MIC范圍MIC50、MIC90、MIC眾數(shù)值，并根據(jù)抗菌藥物敏感的臨界濃度，計(jì)算對(duì)細(xì)菌的敏感率、耐藥率。

表1 166株肺炎球菌菌株的血清學(xué)分型分布情況［株(%)］

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 藥物敏感性分析采用世界衛(wèi)生組織細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)中心推薦的WHONET 5.3軟件，有關(guān)率的比較采用SPSS 11.5軟件處理，用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)分型 166株菌共分離出22種血清群或型，其中兒童常見(jiàn)血清型為19、23、14、6和15群，共63株，占兒童分離菌株73.3%;成人常見(jiàn)血清型為19、23、18、5和33群，共56株，占成人分離菌株的70%。兩人群除19群、23群外，其余血清型存在較大的差異(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 兒童與成人分離菌株的體外藥敏比較 成人分離菌株對(duì)青霉素的敏感率為52.5%顯著高于兒童分離菌株對(duì)青霉素的敏感率31.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.60，P＜0.05);兩人群對(duì)阿奇霉素、克林霉素敏感率均較低，對(duì)頭孢唑林和左氧氟沙星敏感率均較高，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兒童與成人分離的常見(jiàn)血清型菌株的體外藥敏比較 (%)

3 討論

3.1 血清型分布 本研究結(jié)果與肖素坤［7］、Dunais［8］及趙瑞珍等［9］報(bào)道的研究結(jié)果存在一定的差異，而與Rivera-Olivero及任紅宇等報(bào)道的研究結(jié)果極其一致［10，11］，兒童菌株中未發(fā)現(xiàn)未分型菌株。血清學(xué)分型結(jié)果較接近成都地區(qū)結(jié)果，可能原因?yàn)槌啥嫉貐^(qū)與本地區(qū)地域上接近，流行病學(xué)特點(diǎn)較一致［11］。兒童與成人兩人群分離肺炎球菌常見(jiàn)血清型與其他地區(qū)不一的原因可能與該地區(qū)地理?xiàng)l件、氣候環(huán)境、經(jīng)濟(jì)情況、就醫(yī)情況、抗生素使用情況、肺炎球菌疫苗使用情況、飲食習(xí)慣、人種差異、人群結(jié)構(gòu)差異、風(fēng)俗習(xí)慣等因素有一定關(guān)系，以上因素可能導(dǎo)致該地區(qū)人群對(duì)不同血清型肺炎菌的定植造成影響，當(dāng)然不同研究采集的樣本量差異也是原因之一，但同一地區(qū)不同人群的研究國(guó)內(nèi)較少報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，自貢地區(qū)成人和兒童分離菌株的多種血清型(19、23、5、6、10、20、3、9、21、39、17、7、8、12、2、其他可分型以及未能分型)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，而血清型18、14、15、33的分布在兒童和成人之間則存在的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體原因，考慮與不同人群不同呼吸道黏膜不同的生理特點(diǎn)，有利于某些血清型菌株定植;不同人群的肺炎球菌疫苗的不同普及率也是導(dǎo)致血清型不同的原因之一;不同人群生活特點(diǎn)、飲食特點(diǎn)，也可能是影響不同血清型菌株定植的原因，比如吸煙、飲酒對(duì)鼻咽環(huán)境破壞，有利于某血清型菌株定植;不同人群不同基礎(chǔ)疾病、不同免疫能力，也可能導(dǎo)致不同毒力血清型菌株的選擇定植，有待流行病學(xué)進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

本研究所用試劑盒僅能對(duì)細(xì)菌作群的鑒別，不能對(duì)具體血清型的鑒定，因此，對(duì)各種血清型疫苗對(duì)本地區(qū)人群免疫保護(hù)僅能作粗略的估計(jì)，23價(jià)、7價(jià)肺炎疫苗對(duì)兒童人群最大的保護(hù)覆蓋率為97.7%(82/86)、67.4%(58/86)，而對(duì)成人最大的保護(hù)覆蓋率為90%(72/80)、58.8%(47/80)，因而23價(jià)疫苗對(duì)本地區(qū)人群的保護(hù)作用明顯高于7價(jià)疫苗，尤其對(duì)兒童，是本地區(qū)較為合適的疫苗。隨著疫苗的應(yīng)用，肺炎球菌常見(jiàn)血清型可能出現(xiàn)變異。

3.2 抗生素敏感性 本研究結(jié)果顯示，從兒童分離出的肺炎球菌青霉素的敏感率僅是31.4%，而成人為52.5%，明顯低于肖素坤等［7］報(bào)道的70.2%(兒童)和 84%(成人)，也低于王秋霞報(bào)道的68.1%［12］。與Le等報(bào)道的較接近［13］，但低于宋秀杰等報(bào)道的71.7%［14］，但明顯高于趙瑞珍等報(bào)道青霉素敏感率 15.6%［9］及楊曉華等報(bào)道的22%［15］;導(dǎo)致不同地區(qū)臨床分離肺炎菌藥敏差異原因最主要可能為不同地區(qū)臨床抗菌素藥運(yùn)用有很大關(guān)系;本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)較多研究表明兒童分離菌青霉素敏感率低明顯低于成人［16］，具體原因考慮由于兒童特定的生理特點(diǎn)，導(dǎo)致臨床醫(yī)生在臨床選用抗生素類(lèi)型以較多選用β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物為主，導(dǎo)致肺炎鏈球菌對(duì)青霉素藥物選擇壓力增大，導(dǎo)致藥物敏感性下降［17］;本研究結(jié)果表明。本地區(qū)對(duì)青霉素敏感菌株與國(guó)內(nèi)其它地區(qū)接近，但高耐藥菌株比例小，青霉素仍可作為本地區(qū)臨床成人肺炎球菌感染的治療用藥。

兩人群分離菌株對(duì)頭孢唑林的敏感率都高，耐藥率低，兒童分離菌敏感率100%，明顯高于羅勤等報(bào)道的48.1%［18］，可能與該藥該于本地區(qū)運(yùn)用普及率低可能有關(guān)，可作為本市人群肺炎治療首先藥物。

兒童和成人人群分離菌對(duì)左氧氟沙星的敏感率分別是100%、90%，與國(guó)內(nèi)報(bào)道［9，11，12，14］較接近，但本研究結(jié)果提示兒童敏感率較成人明顯高，可能原因?yàn)猷Z酮類(lèi)藥物對(duì)骨骼系統(tǒng)發(fā)育影響使得該類(lèi)藥物在臨床兒童用藥中運(yùn)用極少，抗生素選擇壓力低，因此敏感性高。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)兒童人群分離菌株與成人分離菌株生物特性存在差異的特點(diǎn)。雖然國(guó)內(nèi)較多報(bào)道肺炎菌株對(duì)喹諾酮敏感率高，但近年來(lái)隨著肺炎鏈球菌對(duì)青霉素和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的耐藥率上升，其對(duì)氟喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥也出現(xiàn)上升趨勢(shì)，加拿大學(xué)者發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌對(duì)環(huán)丙沙星耐藥率從1997年的1%上升到2005年的4.2%［19］，需予以警惕，予以監(jiān)控。

兩組人群分離菌對(duì)阿奇霉素和克林霉素的敏感率均極低，低于王秋霞［12］及楊曉華等報(bào)道［15］，但與國(guó)內(nèi)較多報(bào)道一致［9，11，20～23，24］，考慮肺炎鏈球菌耐藥表型可能為鏈陽(yáng)霉素B類(lèi)(MLSв)，即對(duì)大環(huán)內(nèi)酯、林可霉素類(lèi)、鏈陽(yáng)菌素B聯(lián)合耐藥，不能作為本地區(qū)該菌感染的治療藥物。

本研究顯示，無(wú)論成人還是兒童，分離的常見(jiàn)肺炎鏈球菌血清型對(duì)頭孢唑林、青霉素、阿奇霉素、克林霉素和左氧氟沙星等五種抗生素敏感率均明顯低于其他不常見(jiàn)血清型菌的敏感率，其中兒童分離菌青霉素敏感率31.4%，而常見(jiàn)血清型菌株敏感率23.8%;成人分離菌青霉素敏感率是52.5%，而常見(jiàn)血清型敏感率39.3%。另外，對(duì)于阿奇霉素、克林霉素，成人及兒童常見(jiàn)血清型肺炎菌的藥敏率均為0，而其他血清型發(fā)現(xiàn)敏感菌株，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)細(xì)菌對(duì)抗菌素藥物選擇壓力導(dǎo)致敏感率下降［17］，而任何地區(qū)的常見(jiàn)血清型隨人群結(jié)構(gòu)變異、肺炎球菌疫苗運(yùn)用、環(huán)境變化發(fā)生變化，提醒臨床醫(yī)生需警惕一個(gè)地區(qū)的常見(jiàn)血清型的變異情況以及其藥敏變化情況，僅此才能對(duì)特定時(shí)間段、特定地區(qū)的細(xì)菌感染疾病進(jìn)行有效的臨床治療，而不能一成不變的治療一個(gè)地區(qū)的臨床細(xì)菌感染。當(dāng)然，細(xì)菌藥敏性是否與血清型差異有關(guān)，比如與某一血清型天然敏感或耐藥，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，有待進(jìn)一步深入研究，了解不同血清型肺炎對(duì)各類(lèi)抗菌素的敏感性特點(diǎn)。

綜上，本市兒童與成人常見(jiàn)血清型有一定的差異，23價(jià)肺炎疫苗較7價(jià)疫苗對(duì)本市兩人群的免疫保護(hù)高，是本市理想的肺炎疫苗類(lèi)型，本結(jié)果對(duì)于新疫苗的研制提供參考。本市成人分離菌對(duì)青霉素、左氧氟沙星敏感率高，青霉素仍可作為成人肺炎臨床治療用藥，但兒童分離菌對(duì)青霉素藥敏中介比例高，需予以臨床監(jiān)測(cè)，且兒童肺炎最好予以藥敏試驗(yàn)后指導(dǎo)用藥，左氧氟沙星可作為本地區(qū)成人肺炎治療的理想用藥;本市兩人群分離菌對(duì)頭孢唑林敏感率較高，對(duì)阿奇霉素及克林霉素的敏感率特別低，此結(jié)果可供該地區(qū)臨床經(jīng)驗(yàn)用藥參考。

［1］劉又寧，陳民鈞，趙鐵梅，等.中國(guó)城市成人社區(qū)獲得性肺炎665例病原學(xué)多中心調(diào)查［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29(1): 3-8.

［2］胡必杰，何禮賢，張杏怡，等.我國(guó)醫(yī)院內(nèi)肺炎流行病學(xué)現(xiàn)狀:20世紀(jì)90年代發(fā)表論文的薈萃分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2001，11(3):177-180.

［3］劉麗群，趙根明.肺炎鏈球菌疾病的流行病學(xué)［J］.中國(guó)抗感染與化療雜志，2005，5(5):427-429.

［4］張濤，趙根明，陶云珍，等.蘇州地區(qū)臨床分離兒童肺炎鏈球菌耐藥情況分析［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008，35(3):353-357.

［5］董一山，黃文祥，章成，等.重慶地區(qū)臨床分離肺炎鏈球菌血清型及耐藥分析基因多態(tài)性［J］.中國(guó)抗生素雜志，2010，35(l): 59-64.

［6］孟憲意，劉爽，孟慶華，等.內(nèi)源性感染的現(xiàn)狀［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2001，11(6):478-480.

［7］肖素坤，趙春江，劉春林，等.我國(guó)成人和兒童中分離的肺炎鏈球菌的耐藥性與血清型研究［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2010，33 (8):601-607.

［8］Dunais B，Bruno-Bazureault P，Carsenti-Dellamonica H.A decadelong surveillance of nasopharyngeal colonisation with Streptococcus pneumoniae among children attending day-care centres in south-eastern France:1999～2008［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30(7):837-843.

［9］趙瑞珍，鄭躍杰，鄧秋蓮，等.廣東省深圳社區(qū)獲得性肺炎患兒肺炎鏈球菌的血清群/型的分布及其耐藥性［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2010，10(3):205-208.

［10］Rivera-Olivero IA，Del Nogal B，Sisco MC，et al.Carriage and invasive isolates of Streptococcus pneumoniae in Caracas，Venezuela: the relative invasiveness of serotypes and vaccine coverage［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，18:2149.

［11］任紅宇，王曉蕾，李馬超.123株肺炎鏈球菌血清分型及耐藥性研究［J］.中國(guó)疫苗和免疫，2010，16(1):52-55.

［12］王秋霞.91例肺炎鏈球菌藥敏分析［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2010，31 (18):2833.

［13］Le CF，Palanisamy NK，Mohd Yusof MY.Capsular Serotype and Antibiotic Resistance of Streptococcus pneumoniae Isolates in Malaysia［J］.PLoS One，2011，6(5):e19547.

［14］宋秀杰，劉又寧，梁蓓蓓.20種抗菌藥物對(duì)肺炎鏈球菌的體外抗菌活性研究［J］.中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2010，7(1):20-23.

［15］楊曉華，譚南，林愛(ài)心.廣東省中山地區(qū)兒童肺炎鏈球菌的耐藥性分析［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2010，10(1):49-62.

［16］Qin L，Watanabe H，Yoshimine H，et al.Antimicrobial susceptibility and serotype distribution of Streptococcu s pneumoniae isolated from patientswith community-acquired pneumonia and molecular analysis of multidrug-resistant serotype 19F and 23F strains in Japan［J］.Epidemiol Infect，2006，134(6):1188-1194.

［17］陳鴻波.抗生素選擇壓力與細(xì)菌耐藥性的進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):醫(yī)學(xué)分冊(cè)，2002，29(1):57-58.

［18］羅勤，劉明，程均.兒童社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎病原菌及抗菌藥物敏感性研究［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，5(9):135-136.

［19］Adam HJ，Schurek KN，Nichol KA，et al.Molecular characterization of increasing fluroquinolone resistance in Streptococcus pneumonia in Canada，1997 to 2005［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，51(1):198-207.

［20］黃璐，季偉，丁云芳，等.兒童肺炎鏈球菌急性下呼吸道感染耐藥監(jiān)測(cè)［J］.臨床兒科雜志，2010，28(6):538-541.

［21］劉尊杰，姚開(kāi)虎，袁林.1997～2007年上呼吸道感染患兒鼻咽部6群肺炎鏈球菌分離株的耐藥性變化［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2010，10(3):182-187.

［22］陳蓉，趙根明.肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素耐藥的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2010，10(3):230-233.

［23］朱旭慧，孫自鏞，李麗.肺炎鏈球菌的分布及耐藥性分析［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25(2):100-102.

［24］沈敘莊，楊慧.肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素耐藥的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2005，2(3):12-14.

［25］葉應(yīng)嫵，王毓三.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［M］.第3版.南京:東南大學(xué)出版社，2009.