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    可溶性B7-H4在早期胃癌中的診斷價(jià)值探討①

    2012-02-05 13:58:34華建江楊慶偉徐志康梁巧玲
    中國免疫學(xué)雜志 2012年8期
    關(guān)鍵詞:胃癌血清檢測

    華建江 陳 望 姜 健 楊慶偉 徐志康 梁巧玲

    (廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院檢驗(yàn)科,深圳518104)

    可溶性B7-H4在早期胃癌中的診斷價(jià)值探討①

    華建江 陳 望 姜 健②楊慶偉 徐志康 梁巧玲

    (廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院檢驗(yàn)科,深圳518104)

    目的:探討可溶性B7-H4(soluble B7-H4,sB7-H4)在早期胃癌中的診斷價(jià)值。方法:應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)夾心法檢測80例早期胃癌患者與50例正常人血清sB7-H4水平,用化學(xué)發(fā)光法檢測血清CEA、CA19-9水平,利用受試者工作特性曲線(ROC),比較分析sB7-H4作為早期胃癌血清標(biāo)志物的診斷價(jià)值。結(jié)果:早期胃癌患者血清sB7-H4水平(47.61 ±13.57)ng/ml明顯高于正常人(30.62 ±8.65)ng/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.01)。sB7-H4 在早期胃癌診斷中的靈敏度(81.25%)和準(zhǔn)確性(78.46%)均高于CEA及CA19-9,特異性(74%)低于CEA及A199。結(jié)論:sB7-H4在早期胃癌診斷中具有良好的臨床應(yīng)用前景,聯(lián)合檢測sB7-H4、CEA和CA19-9可提高胃癌的診斷率。

    胃癌;B7-H4;ELISA;受試者工作特性曲線

    胃癌是死亡率最高的惡性腫瘤之一,早診斷、早治療是提高胃癌生存率的最有效手段。目前臨床常用的血清標(biāo)志物CEA、CA19-9的特異性和靈敏度較低,被認(rèn)為缺乏早期診斷價(jià)值[1]。B7-H4是最新發(fā)現(xiàn)的B7家族成員,它在抗原特異性的免疫反應(yīng)中起到非常重要的調(diào)節(jié)作用[2,3]。利用免疫組織化學(xué)染色方法,業(yè)已發(fā)現(xiàn)B7-H4在各種腫瘤組織中均有過度表達(dá),如結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌等。B7-H4可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞膜上和胞漿內(nèi),還可以可溶性形式存在于血清中,且有實(shí)驗(yàn)證明了宮頸癌、食管癌患者血清中可溶性B7-H4(sB7-H4)水平的增高[4,5]。本研究用雙抗體 ELISA 夾心法[6],定量檢測早期胃癌患者血清中 sB7-H4水平,比較分析sB7-H4與CEA、CA19-9在靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度上的差異,探討sB7-H4在早期胃癌診斷中的價(jià)值。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 80例早期胃癌(均經(jīng)臨床診斷和病理診斷確診)標(biāo)本來自2008年6月至2011年12月廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院腫瘤科和普外科的住院和門診患者,其中男49例,女31例,年齡17~84歲。正常人50例,均為經(jīng)本院體檢健康的志愿者,其中男32例,女18例,年齡22~71歲。

    1.2 試劑和儀器 酶聯(lián)微量反應(yīng)板(Cloning公司),抗人B7-H4單克隆抗體(eBioscience公司),兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體(由廣東醫(yī)學(xué)院臨床免疫學(xué)教研室制備),HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),TMB底物及顯色劑(沈陽惠民公司)。癌胚抗原(CEA)、糖鏈抗原19-9(CA19-9) (美國貝克曼原裝試劑)。BOTEK Elx800型酶標(biāo)儀,ACCESS2化學(xué)發(fā)光儀等。

    1.3 雙抗體夾心ELISA法 檢測可溶性B7-H4雙抗體夾心ELISA法的建立參見文獻(xiàn)[6]。采用抗人B7-H4 mAb包被酶標(biāo)板,F(xiàn)CS封閉。在包被好的酶標(biāo)板中加入待測血清標(biāo)本,用重組小鼠B7-H4蛋白作為參考標(biāo)準(zhǔn)品,37℃作用1小時(shí),加入稀釋的兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體,用PBST洗3次,再加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG,加顯色底物,以硫酸終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上測A450值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算未知樣品的濃度。

    1.4 標(biāo)本收集和檢測所有患者和正常人在早上空腹采血,分離血清后放-70℃保存。采用上述建立的ELISA法對(duì)所有樣本在同一批內(nèi)進(jìn)行檢測,每個(gè)樣本設(shè)立兩個(gè)平行孔,取平均A值計(jì)算樣本中sB7-H4的含量(ng/ml),同時(shí)上機(jī)檢測所有患者和正常人血清CEA、CA19-9含量。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)值用±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 早期胃癌患者和正常人血清 sB7-H4、CEA、CA19-9水平 與正常人相比,早期胃癌患者血清中sB7-H4、CEA、CA19-9水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),該結(jié)果提示,sB7-H4在胃癌早期診斷中具有潛在應(yīng)用的價(jià)值。

    2.2 sB7-H4與 CEA、CA19-9相關(guān)性分析 將80例早期胃癌患者血清 sB7-H4水平分別與 CEA、CA19-9水平進(jìn)行單因素直線相關(guān)分析,結(jié)果顯示sB7-H4與 CEA、CA19-9均呈正相關(guān)(r分別為0.496 和0.506,P 均 <0.01)。

    表1 胃癌患者和正常人三種血清標(biāo)記物水平比較(±s)Tab.1 The comparison of three kinds of serum marker levels in early gastric cancer patients and normal people(±s)

    表1 胃癌患者和正常人三種血清標(biāo)記物水平比較(±s)Tab.1 The comparison of three kinds of serum marker levels in early gastric cancer patients and normal people(±s)

    Note:There was significant difference between early gastric cancer patients and normal people,1)P <0.01.

    Groups nsB7-H4(ng/ml)CEA(ng/ml)CA19-9(IU/L) Early gastric Cancer patients 80 47.61 ±13.57 10.38 ±7.54 40.88 ±20.79 Normal people50 30.62 ±8.651)3.71 ±2.121)23.83 ±16.541)

    2.3 早期胃癌患者血清sB7-H4、CEA、CA19-9曲線下面積比較 利用受試者工作特性曲線(ROC)測得sB7-H4對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的曲線下面積(AUC)為0.857 (95%可信區(qū)間為0.793~0.921),大于 CEA 的0.734(95%可信區(qū)間為0.646~0.821)和CA19~9的0.805(95%可信區(qū)間為0.728 ~0.881),如圖1。

    2.4 早期胃癌患者血清sB7-H4、CEA、CA19-9診斷效率比較(%) 通過ROC曲線分析,sB7-H4的最佳診斷值為34.71 ng/ml,它在早期胃癌診斷中的靈敏度(81.25%)和準(zhǔn)確性(78.46%)均高于CEA及CA19-9,特異性(74%)低于 CEA及 A199,CEA和CA19-9單項(xiàng)檢測時(shí)的陽性率都比較低,而聯(lián)合檢測sB7-H4、CEA和CA19-9可將早期胃癌的診斷率提高至90%。

    圖1 早期胃癌患者血清sB7-H4、CEA、CA19-9曲線下面積比較Fig.1 The comparison of the area under the curve (AUC)of sB7-H4,CEA and CA19-9 in early gastric cancer patients

    表2sB7-H4、CEA、CA19-9診斷效率比較(%)Tab.2 The comparison of diagnostic efficiency of sB7-H4,CEA and CA19-9 in early gastric cancer patients (%)

    3 討論

    胃癌的發(fā)病率及死亡率始終居消化系統(tǒng)惡性腫瘤之前列,目前胃癌診斷后的5年生存率仍低于20%。胃癌早期癥狀不明顯,且缺乏有效的普查方法,84.5% 的胃癌患者就診時(shí)已處于中、晚期[7]。因此,尋找新的分子標(biāo)志物依然是胃癌診斷和治療的研究熱點(diǎn)之一。

    目前,國內(nèi)有關(guān)B7-H4與腫瘤關(guān)系的研究越來越多,已證實(shí)大多數(shù)腫瘤組織均高表達(dá)B7-H4,如前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌等等[8-10],幾乎涵蓋了腫瘤的各個(gè)領(lǐng)域。眾多的研究表明,B7-H4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要作用,可為腫瘤的診斷和治療提供一種新的靶位點(diǎn),具有良好的臨床應(yīng)用前景。然而,目前對(duì)B7-H4的研究大多采用Western blot和免疫組織化學(xué)染色的方法,操作繁鎖,只能定性研究B7-H4在腫瘤組織中表達(dá)情況,難比較手術(shù)前后病人B7-H4含量的變化。Simon等[11]在2006年發(fā)現(xiàn)了以可溶性形式存在于血清中的B7-H4(sB7-H4),且顯示了sB7-H4輔助CA125診斷卵巢癌的優(yōu)越性。

    本項(xiàng)目用前期研究中建立的雙抗體夾心ELISA法,定量檢測80例早期胃癌患者血清中sB7-H4水平,同時(shí)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤常用的輔助診斷指標(biāo)CEA、CA19-9作對(duì)比,比較分析三者在靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度上的差異,以探討sB7-H4在早期胃癌診斷中的價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn),胃癌患者血清sB7-H4水平明顯高于正常人,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。直線相關(guān)分析顯示,sB7-H4與CEA、CA19-9均呈正相關(guān),提示sB7-H4初步具備胃癌血清標(biāo)志物的潛質(zhì)。利用受試者工作特性曲線(ROC)測得sB7-H4對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的曲線下面積(AUC)為0.857,大于CEA的0.734 和 CA19-9 的 0.805,與 Simon 等[11]測得sB7-H4在卵巢癌對(duì)應(yīng)的曲線下面積(0.86)結(jié)果較一致。此結(jié)果說明,雖然三者在早期胃癌的診斷中均有一定的準(zhǔn)確性,但sB7-H4的準(zhǔn)確性要稍高于CA19-9和CEA。據(jù)報(bào)道,血清CEA檢測對(duì)胃癌的靈敏度為33.3% ~70.4%,特異性為83.5% ~85.7%[12,13],血清 CA19-9 的靈敏度為 18.75% ~60%,特異度為 80% ~85%[12-15],本研究測得 CEA和CA19-9的靈敏度較低,分別為38.75%、45%,這可能是CEA和CA19-9被認(rèn)為缺乏早期診斷價(jià)值的原因。sB7-H4的靈敏度、準(zhǔn)確度分別為81.25%、78.46%,均明顯高于CEA和CA19-9,而特異度僅為74%,低于 CEA的 80%和 CA19-9的92%,提示sB7-H可能是一個(gè)廣譜的腫瘤標(biāo)志物。盡管三種血清標(biāo)志物均具有一定的診斷價(jià)值,但sB7-H4的診斷效率要高于CEA和CA19-9。CEA和CA19-9單項(xiàng)檢測時(shí)的陽性率都比較低,而聯(lián)合檢測sB7-H4、CEA和CA19-9可將早期胃癌的診斷率提高至90%。因?yàn)槟[瘤的發(fā)生是多基因、多步驟改變的結(jié)果,也是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的調(diào)控過程,聯(lián)合檢測正成為該領(lǐng)域一個(gè)重要的探索方向,能彌補(bǔ)單項(xiàng)檢測的不足,可明顯提高早期胃癌的診斷率。

    綜上所述,本研究表明sB7-H4在早期胃癌診斷中具有良好的臨床應(yīng)用前景,但尚需做以下的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí):(1)目前對(duì)于B7-H4的受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚未明確[16],尚不清楚sB7-H4來源于何處,以及sB7-H4能在多大程度上代表體內(nèi)總的B7-H4含量;(2)對(duì)B7-H4分子表達(dá)的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步明確。

    1 李錦洲,盛家和,陳光意.腫瘤標(biāo)記物檢測在消化系統(tǒng)腫瘤診斷中作用[J].醫(yī)藥論壇雜志,2005;26(14):18-20.

    2 FuEs D B,cHEN L.The new B7s:playing a pivotal role in tumor immunity[J].J Immunother,2007;30(3):251-260.

    3 BOENISCH O,SAYEGH M H,NAJAFlAN N.Negative T—cell costimulatory pathways:their role in regulating alloimmune responses[J].Curr Opin Organ Transplant,2008;13(4):373-378.

    4 胡國艷,鄭淑華,劉 偉et al.宮頸癌患者血清可溶性B7-H4檢測及臨床意義[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010;14(9):1425-1427.

    5 蔣 敏,顧國浩,張光波et al.可溶性B7-H4在食管癌患者血清中的表達(dá)分析[J].廣東醫(yī)學(xué),2009;30(6):925-926.

    6 胡國艷,鄭淑華,劉偉et al.檢測可溶性B7-H4 ELISA夾心法的建立[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2008;24(8):831-833.

    7 孫 杰,張 紅.胃癌的內(nèi)鏡下診斷與活檢結(jié)果的相關(guān)性分析[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009;18(26):3175-3176.

    8 Zang X,Thompson R H,Al-Ahmadie H A et al.B7-H3 and B7x are highly expressed in human prostate cancer and associated with disease spread and poor outcome[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007;104 (49):19458-19463.

    9 Miyatake T,Tringler B,Liu W et al.B7-H4(DD-O110)is overexpressed in high risk uterine endometrioid adenocarcinomas and inversely correlated with tumor T-cell infiltration[J].Gynecol Oncol,2007;106(1):119-127.

    10 Awadallah N S,Shroyer K R,Langer D A et al.Detection of B7-H4 and p53 in pancreatic cancer:potential role as a cytological diagnostic adjunct[J].Pancreas,2008;36(2):200-206.

    11 Simon I,Zhuo S,Corral L et al.B7-H4 is a novel membrane-bound protein and a candidate serum and tissue biomarker for ovarian cancer[J].Cancer Res,2006;66(3):1570-1575.

    12 孫龍安,李 龍,林 綱.醫(yī)學(xué)特種檢驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)室診斷[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2002:161-162.

    13 Marrelli D.Prognostic signicance of CEACAl9-9 and CA72-4 Preoperative sersum levels in gastric carcinoma[J].Oncologr,1999;1:55-57.

    14 Koproski H,Steplewski L,Mitchell K et al.Colorectal Carcinoma antigens detected by hybriodoma antibodyies[J].Somat Cell Genet,1979;(5):957-963

    15 成 軍,王嚴(yán)慶.胃癌患者胃液血清中CA72-4、CAl9-9和CEA聯(lián)合檢測的臨床價(jià)值探討[J]重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2003;28(1): 17-20.

    16 Salceda S,Tang T,Kmet M et al.The immunomodulatory protein B7-H4 is overexpressed in breast and ovarian cancers and promotes epithelial cell transformation[J].Exp Cell Res,2005;306(1):128-141.

    [收稿2011-11-20 修回2012-04-20]
    (編輯 許四平)

    The research on diagnosis value of soluble B7-H4 in early gastric cancer

    HUA Jian-Jiang,CHEN Wang,JIANG Jian,YANG Qing-Wei,XU ZHi-Kang,LIANG Qiao-Ling.Department of Laboratory Medicine,Shenzhen Shajing Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Shenzhen 518104,China

    Objective:To discuss the diagnosis value of soluble B7-H4(sB7-H4)in early gastric cancer.MethodsUsing ELISA sandwich method,the serum level of soluble B7-H4 was detected in 80 cases of early gastric cancer patients and 50 cases of normal people,Chemiluminescence method was adopted to determine the serum CEA and CA19-9 levels ,then analyzed the diagnosis value of sB7-H4 in early gastric cancer with ROC(Receiver Operating Characteristic).ResultsThe serum level of soluble B7-H4 in early gastric cancer patients [(47.61 ±13.57)ng/ml]was significantly higher than that in normal people[(30.62 ±8.65)ng/ml],there was significant difference within them(P <0.01).The sensitivity(81.25%)and accuracy(78.46%)of sB7-H4 in early gastric cancer was higher than CEA and CA19-9,but the specificity(74%)was lower than CEA and CA19-9.ConclusionSoluble B7-H4 have good prospects in clinical application on diagnosing early gastric cancer,detecting the serum levels of sB7-H4,together with CEA and CA19-9 can raise the positive rate of early gastric cancer.

    Gastric neoplasms;B7-H4;ELISA;Receiver Operating Characteristic(ROC)

    R735.2

    A

    1000-484X(2012)08-0745-03

    10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.016①本文為深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.200803231)和深圳市寶安區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2008174)

    ②深圳市福田區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科,深圳518000

    華建江(1973年-),男,碩士,副主任技師,主要從事血液疾病檢驗(yàn)方面的研究。

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