三種赤靈芝粉對免疫抑制模型小鼠免疫功能的調節(jié)作用

付海英 賈 婷 張英林 黛文丸 小保方技利 李 航 蔡 云 李敬軒 楊 巍

(吉林大學白求恩醫(yī)學院免疫學系，長春130021)

三種赤靈芝粉對免疫抑制模型小鼠免疫功能的調節(jié)作用

付海英 賈 婷 張英林 黛文丸①小保方技利①李 航②蔡 云③李敬軒②楊 ?、?/p>

(吉林大學白求恩醫(yī)學院免疫學系，長春130021)

目的:為了探討靈芝調節(jié)機體免疫功能的作用機制，并尋找出一種能有效改善機體免疫功能的靈芝制劑，本文研究了三種赤靈芝粉對免疫抑制小鼠免疫功能的調節(jié)作用。方法:實驗動物隨機分為5組(Ⅰ～Ⅴ組)，Ⅱ～Ⅴ組采用腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)70 mg·kg－1·bw－1，隔日注射，共4次，以制備動物模型，Ⅰ組注射等體積生理鹽水。Ⅲ～Ⅴ組于注射CTX次日及末次注射CTX后11日內分別灌胃給予赤靈芝破壁孢子粉(D1)、赤靈芝孢子粉(D2)和赤靈芝精粉(D3)(1g· kg－1·bw－1)，定期監(jiān)測小鼠體重;給藥后無菌取脾臟稱重，計算脾指數;采用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗檢測巨噬細胞吞噬功能;采用NK細胞介導的細胞毒試驗檢測NK細胞功能;采用淋巴細胞轉化試驗檢測T、B淋巴細胞功能;采用流式細胞術檢測CD4+T及CD8+T細胞比例。結果:與免疫抑制組相比，小鼠給予靈芝粉后，三組小鼠體重均升高(P＜0.05);D3組脾指數降低;D1和D2組小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬指數較免疫抑制組升高(P＜0.05);三組小鼠NK細胞殺傷活性無明顯變化;脾臟T、B淋巴細胞增殖能力無明顯變化;D3組小鼠脾臟CD4+和CD8+T細胞比例明顯升高，特別是CD4+T細胞升高最為顯著且較正常對照高(P＜0.05)。結論:三種靈芝對免疫抑制模型小鼠的免疫功能具有調節(jié)作用，尤其是赤靈芝精粉具有顯著提高CD4+T細胞數量的作用，為其臨床應用提供了實驗依據。

靈芝;免疫抑制;免疫調節(jié)

①日惠有限會社，日本國群馬縣3792222

②長春日惠食用菌研究所，長春130000

③福建省農業(yè)科學院植保所，福州350013

④通訊作者，E-mail:ywei@jlu.edu.cn

靈芝(Ganoderma)是多孔菌科植物，又稱靈芝草、仙草等。靈芝種類繁多，主要分布于中國、朝鮮半島和日本，廣義上講全世界有200余種，中國有100余種，其中以紫芝和赤芝的藥用價值最高。靈芝通常以靈芝切片、靈芝粉和靈芝孢子油等形式使用，其中以靈芝粉的藥理學研究較多。靈芝粉根據不同加工技術又可分為靈芝超微粉、靈芝精粉、靈芝孢子粉及靈芝破壁孢子粉等。

研究表明靈芝制劑中含有多種生物活性成分，如多糖類、三萜類化合物、生物堿、核酸類、氨基酸以及微量元素等[1-4]，使其具有保肝解毒、改善微循環(huán)、抗衰老及抗神經衰弱的作用，亦可用于治療高血壓、糖尿病、腫瘤以及艾滋病[5-7]。

此外，靈芝還具有顯著調節(jié)免疫功能的作用。靈芝多糖可以顯著提升小鼠腹腔巨噬細胞產生IL-1和TNF-α的水平以及誘導人外周血單核細胞產生TNF-α[8，9];靈芝水提物和靈芝多糖可以增加 NK 細胞活性[10];靈芝還能促進 IFN-γ 的產生[11]。

然而，由于靈芝提取部位的不同及制備工藝的差異可直接影響其藥效，加上靈芝的免疫調節(jié)機制尚未十分明確。因此，本文通過三種不同的靈芝粉(包括赤靈芝破壁孢子粉、赤靈芝孢子粉及赤靈芝精粉)對免疫抑制模型小鼠的免疫功能的調節(jié)作用，比較其活性并探究作用機理，以尋找出一種有效的調節(jié)免疫功能的靈芝粉劑，為該靈芝制劑的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及實驗動物 YAC-1細胞購自中科院上海細胞庫。ICR小鼠，4～6周齡，體重18～22 g，購于吉林大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑及儀器 三種赤靈芝粉由日本日惠有限會社提供，均為褐色粉末，純度均達到100%，其中主要有效成分為靈芝多糖;RPMI1640(Gibco公司，美國);新生牛血清(長春博德生物技術有限責任公司，中國);脂多糖(LPS)和刀豆素A(ConA，Sigma公司，美國);PE-anti-mCD4 mAb和FITC-antimCD8a mAb(eBioscience公司，美國);流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.3 動物模型的制備 將ICR小鼠，4～6周齡，體重為16～30 g，雌雄兼用。隨機分為五組:正常對照組(Ⅰ組:19只)、免疫抑制模型組(Ⅱ組:24只)、赤靈芝破壁孢子粉(D1)組(Ⅲ組:20只)、赤靈芝孢子粉(D2)組(Ⅳ組:22只)及赤靈芝精粉(D3)組(Ⅴ組:21只)。Ⅱ～Ⅴ組小鼠于第1、3、5、7天腹腔注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(CTX)70 mg·kg－1· bw－1，Ⅰ組小鼠腹腔注射等體積無菌生理鹽水。于第2、4、6、8日及此后的11天，Ⅲ～Ⅴ組小鼠分別灌胃給予 D1、D2 和 D3(1 g·kg－1·bw－1);Ⅰ、Ⅱ組小鼠均給予同體積生理鹽水。

1.4 小鼠體重及脾指數的測定 分別于實驗開始前一天及第 4、8、13、18、22天稱量各組小鼠體重。并于第22天處死小鼠后，分離脾臟并稱重，按照下述公式計算:脾指數=脾臟重量/體重。

1.5 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗 于第19天給予小鼠腹腔注射3%無菌淀粉溶液1 ml，次日向小鼠腹腔注射2%雞紅細胞懸液1 ml，輕揉腹部，30分鐘后，脫頸處死，取腹腔液滴于載玻片上，37℃溫箱中孵育2小時。沖洗掉未黏附的細胞后，干燥，Giemsa-Wright’s染色。顯微鏡下計數，按下述公式計算吞噬百分率及吞噬指數:吞噬百分率=有吞噬作用的巨噬細胞/100×100%;吞噬指數=總共吞入的紅細胞數/100。

1.6 NK細胞介導的細胞毒試驗 采用NK細胞介導的細胞毒實驗檢測NK細胞活性。取小鼠脾臟，制備成無菌脾細胞懸液，調濃度為1×107個/ml，加入96孔板中，作為效應細胞，每孔100 μl(效靶比為20∶1)/50 μl(效靶比為 10∶1)，每只鼠設三復孔。將Yac-1細胞調濃度至5×105個/ml，每孔加入100 μl，作為靶細胞。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時后，加入 MTT(5 μg/ml)10 μl/孔，繼續(xù)孵育 4 小時。取出后，吸去上清，加入DMSO 100 μl/孔，酶標儀上讀出光密度值(OD570)。結果判斷:NK活性=[1-(實驗孔OD值-效應細胞對照孔OD值)]/靶細胞對照孔OD值×100%。

1.7 淋巴細胞轉化試驗 制備無菌脾細胞懸液，計數，調整細胞濃度為1×107個/ml，加入96孔板，每孔 100 μl。加入 ConA(終濃度為 5 μg/ml)用于刺激T細胞增殖或LPS(終濃度為20 μg/ml)用于刺激B細胞增殖，每個樣品設3復孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時后，加入 MTT(5 μg/ ml)10 μl/孔，繼續(xù)孵育4小時。取出后，吸去上清加入 DMSO 100 μl/孔，酶標儀上讀出光密度值(OD570)。刺激指數=刺激孔OD值/對照孔OD值。

1.8 CD4+和CD8+T細胞比例測定 制備脾細胞懸液，離心，棄上清。加入適量紅細胞裂解液，離心，棄上清。加2 ml PBS洗滌一次。計數，調細胞濃度為1 ×107個/ml，取 100 μl加入離心管中，避光條件下加入抗體。4℃，避光，冰浴，40分鐘。1.5 ml PBS洗滌一次，棄上清。加入300 μl 2%多聚甲醛固定，用流式細胞儀進行檢測。

1.9 統(tǒng)計學分析 所有實驗數據采用 Student’s T test分析，結果用±s表示，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三種靈芝制劑對小鼠體重及脾指數的影響結果顯示(圖1)，免疫抑制前(d0)各組小鼠體重無明顯差別;給予免疫抑制劑后(d8)四組小鼠與正常對照組相比體重均明顯降低(P＜0.05)，給藥早期(d13)三種靈芝粉對抑制小鼠體重無影響，但隨給藥時間延長，在后期(d18、d22)可恢復免疫抑制小鼠的體重(P＜0.05)，說明三種靈芝粉均具有改善免疫抑制小鼠體重的作用，其中以赤靈芝孢子粉(D2)作用較強。而三組靈芝粉組脾指數均較CTX組有所降低，其中以D3組最為顯著(P＜0.05，圖2)。說明三種靈芝粉均可在不同程度改善機體脾臟功能，從而調節(jié)外周免疫應答的能力，且赤靈芝精粉(D3)的作用最強。

圖1 三種靈芝粉對小鼠體重的影響Fig.1 The effect of three kinds of ganoderma powder on body weight of mice

圖2 三種靈芝粉對小鼠脾指數的影響Fig.2 The effect of three kinds of ganoderma powder on mice spleen index

2.2 三種靈芝制劑對巨噬細胞吞噬功能的影響與Control組相比，CTX組及三組靈芝粉組小鼠的吞噬百分率均降低，但無統(tǒng)計學差異(圖3A);與Control組相比(圖3B)，CTX組小鼠的吞噬指數明顯降低(P＜0.05)，而D1、D2組小鼠吞噬指數較CTX組明顯升高(P＜0.05)，D3組略升高但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。說明三種靈芝粉可不同程度增強巨噬細胞吞噬能力，其中赤靈芝孢子粉的作用最為顯著。

2.3 三種靈芝制劑對NK細胞殺傷功能的影響結果顯示(圖4)，CTX組及三組靈芝粉組NK細胞活性均低于正常對照組;在效靶比為10∶1時，盡管三種靈芝粉組NK細胞活性較CTX組有所升高，但均無統(tǒng)計學意義。說明三種靈芝粉均有提高免疫抑制模型鼠NK細胞活性的趨勢，但并不顯著。

圖3 三種靈芝粉對巨噬細胞吞噬功能的影響Fig.3 The effect of three kinds of ganoderma powder on phagocytic activity of macrophage

2.4 三種靈芝制劑對T、B細胞增殖功能的影響結果顯示(圖5)，與Control組相比，CTX組及 D1、D2組B細胞的刺激指數均降低(P＜0.05)，CTX組及D1、D2和D3組 T細胞刺激指數無明顯變化(P ＞0.05);與CTX 組相比，D1、D2及D3組T、B 細胞的刺激指數變化均不明顯(P＞0.05)，說明三種靈芝粉對T、B淋巴細胞的增殖功能均無明顯影響。2.5 三種靈芝制劑對CD4+及CD8+T細胞比例的影響 結果顯示(圖6)，D3組的CD4+T細胞明顯高于 Control組及 CTX組(P＜0.05);且 D3組CD8+T細胞亦較CTX組升高(P＜0.05);其它組間無明顯差別。說明赤靈芝精粉具有明顯提高機體T淋巴細胞數量的作用，特別是對CD4+T細胞的影響最為顯著，進而提示其在增強機體免疫功能中發(fā)揮著重要作用。

圖4 三種靈芝粉對NK細胞殺傷功能的影響Fig.4 The effect of three kinds of ganoderma powder on cytotoxicity of NK cells

圖5 三種靈芝粉對T、B細胞增殖功能的影響Fig.5 The effects of three kinds of ganoderma powder on proliferation of T and B lymphocytes

圖6 三種靈芝粉對CD4+T及CD8+T細胞比例的影響Fig.6 The effects of three kinds of ganoderma powder on the percentage of CD4+and CD8+T lymphocytes

3 討論

臨床研究和現代藥理證明，靈芝具有多種生理活性和藥理作用[5-7]。它能夠影響天然和獲得性免疫系統(tǒng)中的多種細胞的功能，如巨噬細胞、NK細胞和淋巴細胞[8，10，11]等。此外，研究發(fā)現靈芝多糖能夠結合到淋巴細胞表面與特異性受體或相似的蛋白結合導致巨噬細胞、輔助性T細胞、NK細胞和其它效應細胞活性的改變。這也許能夠解釋為什么靈芝的免疫調節(jié)功能如此廣泛[12]。

關于靈芝的研究，以往多采用腫瘤模型鼠探討其抗腫瘤作用。而本研究則以免疫抑制模型鼠為對象，結果顯示赤靈芝孢子粉和破壁孢子粉可增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，而赤靈芝精粉無明顯作用。這與李怡嵐等[13]研究顯示破壁孢子粉可增強S180腫瘤小鼠巨噬細胞吞噬功能，而靈芝精粉無明顯變化的結果一致，但其并未對孢子粉的作用進行研究，而本研究顯示在三種靈芝粉中孢子粉的作用最為顯著，這可能是由于影響巨噬細胞作用的有效成分主要存在于靈芝孢子中，而破壁可能會使其部分活性成分降低，其具體原因還有待于進一步研究證明。此外，本研究結果顯示三種靈芝粉對NK細胞功能影響均不明顯，相反另一報道則顯示靈芝精粉和破壁孢子粉均具有提高S180荷瘤小鼠NK細胞殺傷功能，且以破壁孢子粉作用較強[13]。這可能是由于不同動物疾病模型對藥物的敏感性不同，或給藥方式和劑量的不同所致。

在本研究中，三種靈芝粉對免疫抑制模型小鼠脾淋巴細胞的增殖均無明顯影響。盡管有報道顯示，靈芝孢子粉可促進ConA誘導的NIH小鼠脾淋巴細胞增殖，從破壁的靈芝孢子粉中分離得到多糖SP及其降解片段SP21，腹腔注射給藥后均可促進ConA及LPS誘導的ICR小鼠脾淋巴細胞增殖[14，15]。而另一些研究顯示，一種從靈芝破壁孢子粉中分離純化的多糖組分PGL卻能明顯抑制ConA和LPS誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖[16]。因此關于靈芝對脾淋巴細胞增殖的作用還存在爭議，這可能是由于不同的提取方法所獲成分不同，而不同的成分又具有不同的生物學活性。

本研究顯示，不同的靈芝粉對免疫功能具有不同的調節(jié)作用。對天然免疫功能的調節(jié)作用，如對巨噬細胞吞噬功能的影響以赤靈芝孢子粉最為顯著，而對適應性免疫功能的調節(jié)作用則是赤靈芝精粉的作用最強，特別是對CD4+和CD8+T細胞的影響。有研究顯示腹腔注射靈芝孢子粉可明顯提高荷HAC肝癌小鼠CD3+、CD4+及CD8+T細胞的百分率[17]，破壁孢子粉可增加S180荷瘤小鼠CD4+及CD8+T細胞的數量，但與靈芝精粉之間的作用比較卻未見報道。靈芝粉中另一重要活性成分為腺苷，它也是冬蟲夏草的主要活性成分，不同的靈芝提取物其腺苷含量不同，靈芝精粉的含量較高可達0.2%左右，而孢子粉及破壁孢子粉的含量僅為0.01%左右，這也可能是靈芝精粉作用較強的原因[18]。

傳統(tǒng)認為CD4+T細胞主要為輔助性T細胞，分為Th1和Th2型兩種，能夠分泌產生多種細胞因子，進而在輔助CD8+T細胞介導的細胞免疫應答和B細胞介導的體液免疫應答中發(fā)揮重要作用，因此是參與免疫應答中至關重要的一類細胞，其功能的高低直接影響機體免疫功能的強弱，本研究發(fā)現赤靈芝精粉對CD4+T細胞具有顯著的調節(jié)作用，提示可能通過增加CD4+T細胞的數量，從而對適應性免疫應答的整體功能發(fā)揮調節(jié)作用，通過提高機體免疫功能，有助于機體抵抗感染、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

不同類型的靈芝制劑對免疫功能調節(jié)作用的不同，可能是由于提取工藝不同導致其有效成分的組成及含量不同，從而導致對不同免疫細胞的影響存在差異。但這還有待于進一步研究證實?？傊?，本研究提示不斷完善靈芝制劑的加工提取工藝，針對不同疾病需要選擇其相應的更為有效的靈芝制劑，為臨床應用靈芝治療疾病提供了實驗依據。

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[收稿2012-03-02 修回2012-05-14]

(編輯 倪 鵬)

The role of three kinds of ganoderma lucidum powder on regulation of immune functions of immunosuppressive mice model

FU Hai-Ying，JIA Ting，ZHANG Ying-Lin，Fumimaru Mayuzumi，Eri Obokata，LI Hang，CAI Yun，LI Jing-Xuan，YANG Wei.Department of Immunology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China

Objective:In order to explore the mechanism of ganoderma powder on regulating immune functions，and find out a kind of ganoderma powder for improving immune functions effectively.In this study，the role of three kinds of ganoderma lucidum powder on regulation of immune functions of immunosuppressive mice model was investigated.MethodsThe mice were divided into five groups(Ⅰ-Ⅴ)randomly，mice in group Ⅱ-Ⅴ were injected intraperitoneally with cyclophosphamide(CTX)70 mg·kg－1·bw－1every other day for four times to establish the animal model.Mice in group Ⅰ were injected with normal saline equally.Group Ⅲ-Ⅴmice were treated respectively with wall-broken spores of ganoderma lucidum(D1)，ganoderma lucidum spore powder(D2)and ganoderma lucidum powder(D3)(1 g·kg－1·bw－1)at the following day of CTX injection and for eleven days after the last time of CTX injection.The body weights of mice were measured at certain time.The spleens were removed sterilely and weighted to calculate the spleen index.The phagocytic ability of macrophage was detected with mouse peritoneal macrophage phagocytosis of chicken red cell test.The function of NK cells was detected with NK cells mediated cytotoxicity assay.The functions of T and B lymphocytes were analyzed with lymphocyte proliferation assay.The percentage of CD4+and CD8+T lymphocytes were analyzed with FACS.ResultsCompare to the immunosuppressive mice，the body weight of mice treated with three kinds of ganoderma lucidum powder increased(P ＜0.05)，the spleen index in group D3 decreased，the phagocytosis index in group D1 and D2 mice were higher than immunosuppressive mice(P ＜0.05).There were no significant changes of NK cell activity in ganoderma-treated mice.There were no obvious changes of the proliferation ability of T and B lymphocytes between ganoderma-treated mice and CTX mice.The percentage of CD4+and CD8+T lymphocytes in spleen of group D3 mice were significantly increased than those in immunosuppressive mice，especially the the percentage of CD4+T in group D3 mice was most significantly increased and even was higher than those in normal control mice(P ＜0.05).ConclusionThree kinds of ganoderma lucidum could regulate the immune functions of immunosuppressive mice，especially the ganoderma lucidum powder is able to increase the number of CD4+T lymphocytes，which provide the experimental basis for its clinical application.

Ganoderma powder;Immune suppression;Immunoregulation

R392

A

1000-484X(2012)08-0712-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.008

付海英(1977年－)，女，博士，講師，主要從事免疫調節(jié)方面研究，E-mail:fuhaiying612@yahoo.com.cn。

·獸醫(yī)免疫學·