Lewis肺癌細胞TLR4對Foxp3表達的調(diào)控

歷 春 楊 巍 張英林 蓋曉東 李 一 付海英

(吉林大學白求恩醫(yī)學院免疫學系，長春130021)

Lewis肺癌細胞TLR4對Foxp3表達的調(diào)控

歷 春①楊 巍 張英林 蓋曉東①李 一 付海英

(吉林大學白求恩醫(yī)學院免疫學系，長春130021)

目的:探討小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer，LLC)細胞中TLR4對Foxp3表達的調(diào)控作用。方法:選擇LPS為配體活化TLR4，采用RT-PCR方法檢測LPS在不同濃度(0，1，10 μg/ml)和不同時間點(12，24，36，48小時)Foxp3 mRNA的表達量的變化，流式細胞術(shù)檢測有效濃度LPS 10 μg/ml和最佳作用時間點24小時Foxp3蛋白和TLR4蛋白表達量的變化，RT-PCR和流式細胞術(shù)檢測anti-TLR4/MD2抗體阻斷TLR4后再用LPS刺激LLC細胞Foxp3表達量的變化。結(jié)果:LPS在10 μg/ml濃度作用LLC細胞后可顯著上調(diào)Foxp3 mRNA的表達量，與未刺激組相比差異顯著(P ＜0.05);LPS最佳作用時間為24小時;LPS在10 μg/ml濃度作用LLC細胞24小時后可顯著上調(diào)Foxp3蛋白和TLR4蛋白的表達量，與對照組相比差異顯著(P ＜0.05);阻斷TLR4后再用LPS刺激LLC細胞，F(xiàn)oxp3的表達量較未阻斷組明顯降低(P ＜0.05)。結(jié)論:LLC細胞TLR4蛋白參與對Foxp3的表達調(diào)控，TLR4可能是Foxp3的上游信號分子。

叉頭蛋白3;Lewis肺癌;Toll樣受體4;脂多糖

叉頭蛋白3(Forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)是叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個成員，是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細胞(regulatory T cells，Tregs)特異的分子標記[1]。研究證實，腫瘤微環(huán)境中Foxp3作為Tregs發(fā)育和行使功能的決定因素，抑制局部免疫應(yīng)答，促進腫瘤的免疫逃逸[2-4]。最近研究發(fā)現(xiàn)Foxp3在腫瘤細胞也有表達[5-8]，本課題組已報道小鼠lewis肺癌細胞表達Foxp3，而且Foxp3可模擬Tregs發(fā)揮免疫抑制作用參與肺癌細胞的免疫逃逸[9]，但肺癌細胞 Foxp3的表達調(diào)控機制尚不明確。TLR4是Toll樣受體家族(Toll like receptors，TLRs)重要成員之一，最初發(fā)現(xiàn)于免疫細胞，通過識別某些外源性或內(nèi)源性配體引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用[10，11]。近年來研究發(fā)現(xiàn) TLR4在很多腫瘤細胞系和腫瘤組織中也有表達，腫瘤細胞通過TLR4信號通路釋放炎性細胞因子和免疫抑制因子誘導(dǎo)免疫微環(huán)境的免疫耐受，從而促進腫瘤的免疫逃逸[12-14]。有文獻報道TLR4與Tregs關(guān)系密切，LPS活化TLR4后可增強Tregs的生存、增殖和抑制功能[15，16]，因此我們推測 TLR4 可能參與對肺癌細胞Foxp3的表達調(diào)控。

為了探討TLR4對肺癌細胞Foxp3表達的調(diào)控作用，本研究以小鼠Lewis肺腺癌(Lewis lung cancer，LLC)細胞為研究對象，選用LPS活化TLR4和anti-TLR4/MD2抗體阻斷 TLR4，檢測活化和阻斷TLR4對 Foxp3表達量的影響，以探討肺癌細胞Foxp3表達的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及細胞培養(yǎng) LLC細胞系為本實驗室保存，貼壁生長在含10%新鮮小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.2 試劑 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和Ex Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司;Anti-mouseTLR4/MD2抗體(MTS510)購自eBioscience公司;兔抗鼠Foxp3及TLR4多克隆抗體購自武漢博士得生物公司，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物公司。1.3 RT-PCR檢測目的基因表達 Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，PCR儀擴增目的基因片段。Foxp3引物為:上游:5′-CAG CTG CCT ACA GTG CCC CTA G-3′;下游:5′-CAT TTG CCA GCA GTG GGT AG-3′。擴增條件:預(yù)變性94℃ 2分鐘，(變性94℃ 30秒，退火60℃ 30秒，延伸72℃ 1分鐘)，共進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物為382 bp。內(nèi)參β-actin引物為:上游:5′-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3′;下游 5′-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3′。擴增條件:預(yù)變性94℃ 2分鐘，(變性94℃ 30秒，退火 52℃ 30秒，延伸 72℃ 1分鐘)，共進行25個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物為320 bp。引物由上海生工有限公司合成。所有實驗均重復(fù)3次。

1.4 流式細胞術(shù)檢測 采用間接免疫熒光法檢測:收集細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106ml-1;PBS洗滌細胞1次，1 500 r/min離心5分鐘，棄上清液;加入4%多聚甲醛200 μl固定細胞，4℃孵育20分鐘; 1 500 r/min離心5分鐘，棄上清液。PBS清洗后離心，棄上清;用破膜劑稀釋兔抗鼠Foxp3多克隆抗體(1∶100)或 PBS稀釋兔抗鼠 TLR4多克隆抗體(1∶100)，4℃孵育 40分鐘;1 500 r/min離心 5 分鐘，棄上清液。再用PBS洗滌細胞1次，1 500 r/min離心5分鐘，棄上清液;加入FITC標記的山羊抗兔IgG(稀釋濃度1∶100)，4℃避光染色30分鐘;1 500 r/min離心5分鐘，棄上清液。用PBS清洗后離心，棄上清;加0.5 ml PBS重懸細胞后上流式細胞儀檢測細胞內(nèi)平均熒光強度(MFI)，所有實驗均重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，樣本均數(shù)比較采用多因素方差分析，P ＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LPS刺激LLC細胞24小時 Foxp3 mRNA表達量的變化 首先采用RT-PCR方法檢測不同濃度 LPS(0、1、10 μg/ml)作用 LLC 細胞 24 小時后Foxp3 mRNA表達量的變化。結(jié)果顯示在1 μg/ml和 10 μg/ml的 LPS 作用下，F(xiàn)oxp3 mRNA 表達量均有上調(diào)，但以10 μg/ml的LPS最為顯著，與未刺激組比較有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖1。2.2 不同時間點LPS刺激LLC細胞Foxp3 mRNA表達量的變化 進一步采用RT-PCR方法取有效濃度10 μg/ml的LPS作用LLC細胞，檢測不同時間點(12、24、36、48 小時)Foxp3 mRNA 表達量的變化。結(jié)果顯示在不同時間點Foxp3 mRNA的表達量均有上調(diào)，但以24小時時間點Foxp3 mRNA表達量最高(P ＜0.05)，見圖2。結(jié)果表明LPS活化LLC細胞

圖1 不同濃度LPS作用LLC細胞Foxp3 mRNA表達量的變化Fig.1 The mRNA level of Foxp3 after LPS treatment at different concentration in LLC cells by RT-PCR

TLR4后Foxp3表達上調(diào)的最佳作用時間為24小時。

2.3 LPS刺激LLC細胞Foxp3蛋白表達量的變化為進一步驗證TLR4對Foxp3的表達調(diào)控作用，采用流式細胞術(shù)選用有效濃度10 μg/ml和最佳作用時間24小時檢測LPS刺激LLC細胞后Foxp3在蛋白水平的表達變化。結(jié)果顯示，LPS刺激組Foxp3的MFI(5.11 ±0.56)較未刺激組 MFI(3.67± 0.42)顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)，見圖3。此結(jié)果進一步證實了LLC細胞TLR4活化后可誘導(dǎo)Foxp3的表達。

2.4 LPS刺激LLC細胞TLR4蛋白表達量的變化TLR4蛋白是LPS信號向胞內(nèi)傳導(dǎo)的門戶蛋白。因此，采用流式細胞術(shù)檢測不同濃度 LPS(0、1、10 μg/ml)刺激LLC細胞24小時時間點TLR4蛋白量的表達變化。結(jié)果顯示，隨著 LPS濃度的增加，TLR4蛋白的表達量也隨之增強，以LPS 10 μg/ml最為顯著，與LPS活化TLR4后Foxp3的表達有一致性。LPS 10 μg/ml組 TLR4 的 MFI(12.9 ±1.62)較 LPS 0 μg/ml組 MFI(9.8 ±1.25)顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖4。結(jié)果表明，LPS活化LLC細胞TLR4后TLR4蛋白表達上調(diào)。

圖2 不同時間LPS作用LLC細胞Foxp3 mRNA表達量的變化Fig.2 The mRNA level of Foxp3 after LPS treatment at different time in LLC cells by RTPCR

2.5 阻斷TLR4后LLC細胞Foxp3 mRNA表達量的變化 前面研究顯示LPS活化TLR4后可誘導(dǎo)Foxp3的表達，為進一步驗證TLR4對Foxp3表達的調(diào)控作用，我們先用20 μg/ml的anti-TLR4/MD2抗體阻斷 TLR4，再用10 μg/ml LPS刺激 LLC細胞，RT-PCR方法檢測Foxp3 mRNA表達量的變化。結(jié)果顯示阻斷組Foxp3 mRNA的表達量較未阻斷組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖5，表明阻斷TLR4后可抑制Foxp3的表達上調(diào)。

圖3 LPS作用下LLC細胞Foxp3蛋白表達量的變化Fig.3 The protein level of Foxp3 after LPS treatment in LLC cells by FCM

圖4 LPS刺激LLC細胞后TLR4蛋白表達量的變化Fig.4 The protein level of TLR4 after LPS treatment in LLC cells by FCM

圖5 阻斷TLR4后對Foxp3 mRNA表達量的影響Fig.5 The mRNA level of Foxp3 after TLR4 blockade in LLC cells by RT-PCR

2.6 阻斷TLR4后LLC細胞Foxp3蛋白表達量的變化 為進一步驗證阻斷LLC細胞TLR4后Foxp3在蛋白水平的表達變化，先用 20 μg/ml的 anti-TLR4/MD2 抗體阻斷 TLR4，再用 10 μg/ml LPS 刺激LLC細胞，采用流式細胞術(shù)檢測Foxp3蛋白量的變化。結(jié)果顯示，阻斷組 Foxp3的 MFI(1.75± 0.19)較未阻斷組 MFI(2.04 ±0.23)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，與其mRNA檢測的結(jié)果相符，見圖6。此結(jié)果進一步證實TLR4參與對Foxp3的表達調(diào)控。

3 討論

圖6 阻斷TLR4后對Foxp3蛋白表達量的影響Fig.6 The protein level of Foxp3 after TLR4 blockade in LLC cells by FCM

Foxp3是Tregs特異的標志物及細胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因[1]。Tregs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過發(fā)揮免疫抑制作用促進腫瘤的免疫逃逸[2-4]。最近研究發(fā)現(xiàn)Foxp3在腫瘤細胞也有表達，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要的作用[5-9]，但腫瘤細胞Foxp3的表達調(diào)控機制尚不明確。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞表面表達的TLR4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[17-19]。TLR4通過識別某些外源性及內(nèi)源性配體引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)腫瘤細胞生成大量的免疫抑制性因子誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境的免疫耐受促進腫瘤的免疫逃逸[12-14]。此外，TLR4與Tregs有著密切的聯(lián)系[15，16]。LPS 刺激 TLR4 后可誘導(dǎo) Tregs的活化，增強Tregs細胞的生存和增殖。更重要的是LPS刺激后，Tregs的抑制效率提高了10倍，表明TLR4活化后可增強Tregs的抑制功能[15]。另有研究表明，在LPS單獨作用下，Tregs中Foxp3表達無明顯變化，但在LPS和IL-2共同作用后，Tregs中Foxp3的表達較IL-2單獨作用顯著上調(diào)，Tregs的免疫抑制功能也相應(yīng)增強，而且阻斷TLR4下游NF-κB途徑抑制了Foxp3的表達上調(diào)，表明TLR4可能間接參與Tregs中Foxp3的表達調(diào)控[16]。

結(jié)合以上文獻報道，我們推測TLR4可能參與對肺癌細胞Foxp3的表達調(diào)控。為證實此推測，首先檢測LPS活化LLC細胞TLR4后Foxp3的表達情況，結(jié)果顯示LPS刺激LLC細胞后Foxp3表達在基因和蛋白水平均顯著上調(diào)，初步表明 LLC細胞TLR4活化后可誘導(dǎo)Foxp3的表達。TLR4蛋白是LPS信號向胞內(nèi)傳導(dǎo)的門戶蛋白，為進一步探討TLR4蛋白在LPS誘導(dǎo)LLC細胞Foxp3表達中的作用，我們檢測了LPS刺激LLC細胞后TLR4蛋白的表達情況。實驗結(jié)果顯示TLR4蛋白的表達在LPS刺激LLC細胞后明顯上調(diào)，與LPS誘導(dǎo)Foxp3的表達上調(diào)有一致性，提示LPS活化TLR4后TLR4蛋白是功能性表達上調(diào)。

雖然TLR4是識別LPS的關(guān)鍵受體，但TLR4必需有 MD-2 協(xié)助才能識別 LPS[20，21]，TLR4 與 MD-2相互作用形成復(fù)合物TLR4/MD2將LPS信號傳遞入細胞內(nèi)，激活下游途徑從而引起炎癥因子的大量釋放。因此為進一步驗證TLR4對Foxp3的表達調(diào)控，先用anti-TLR4/MD2抗體阻斷LLC細胞TLR4，再用LPS刺激，觀察Foxp3的表達變化。結(jié)果顯示阻斷TLR4后Foxp3的表達較未阻斷組明顯降低，進一步證實了TLR4對Foxp3的表達調(diào)控作用。本研究中LLC細胞TLR4對Foxp3的表達調(diào)控不同于Tregs，Tregs在LPS單獨作用下Foxp3表達無明顯變化，但在LPS和IL-2共同作用下，Tregs中Foxp3表達明顯上調(diào)[16]，而我們的研究顯示在LPS單獨作用LLC細胞后Foxp3表達明顯上調(diào)，表明TLR4可直接調(diào)控LLC細胞Foxp3的表達，TLR4可能是Foxp3的上游信號分子。

綜合以上結(jié)果，肺癌細胞TLR4在LPS刺激活化后TLR4蛋白表達上調(diào)，進一步通過誘導(dǎo)Foxp3的表達促進腫瘤的免疫逃逸。TLR4下游信號通路包括MyD88依賴性和非依賴兩條途徑，而其對肺癌細胞Foxp3的調(diào)控作用具體是通過哪條途徑還需進一步的深入研究。

1 Fontenot J D，Rasmussen J P，Williams L M et al.Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor Foxp3[J].Immunity，2005;22:329-341.

2 Li B，Samanta A，Song X et al.FOXP3 ensembles in T-cell regulation[J].Immunol Rev，2006;212:99-113.

3 Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J].Science，2003;299: 1057-1061.

4 Woo E Y，Yeh H，Chu C S et al.Cutting edge:Regulatory T cells from lung cancer patients directly inhibit autologous T cell proliferation[J].J Immunol，2002;168(9):4272-4276.

5 Hinz S，Pagerols-Raluy L，Oberg H H et al.Foxp3 expression in pancreatic carcinoma cells as a novel mechanism of immune evasion in cancer[J].Cancer Res，2007;67:8344-8350.

6 Zuo T，Liu R，Zhang H et al.FOXP3 is a novel transcriptional repressor for the breast cancer oncogene SΚP2 [J].J Clin Invest， 2007;117:3765-3773.

7 Merlo A，Casalini P，Carcangiu M L et al.FOXP3 expression and overall survival in breast cancer[J].J Clin Oncol，2009;27:1746-1752.

8 Wang L H，Su L，Wang J T.Correlation between elevated FOXP3 expression and increased lymph node metastasis of gastric cancer[J].Chinese Med J，2010;123:3545-3549.

9 歷 春，蓋曉東，賈 婷et al.小鼠Lewis肺癌細胞Foxp3的表達對T淋巴細胞增殖的影響及機制[J].中國免疫學雜志，2010; 26(11):986-991.

10 O’Neill L A.When signaling pathways collide:positive and negative regulation of toll-like receptor signal transduction [J].Immunity，2008;29(1):12-20.

11 Kawai T，Akira S.The role of pattern recognition receptors in innate immunity:Update on Toll like receptors[J].Nat Immunol，2010; 11(5):373-384.

12 Huang B，Zhao J，Li H et al.Toll-like receptors on tumor cells facilitate evasion of immune surveillance[J].Cancer Res，2005;65 (12):5009-5014.

13 Goto Y，Arigami T，Kitago M et al.Activation of Toll-like receptors 2，3，and 4 on human melanoma cells induces inflammatory factors[J].Mol Cancer Ther，2008;7(11):3642-3653.

14 He W，Liu Q，Wang L et al.TLR4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance[J].Molecular Immunology，2007; 44(11):2850-2859.

15 Caramalho I，Lopes-Carvalho T，Ostler D et al.Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are activated by lipopolysaccharide[J].J Exp Med，2003;197(4):403-411.

16 Milkova L，Voelcker V，F(xiàn)orstreuter I et al.The NF-kappaB signalling pathway is involved in the LPS/IL-2-induced upregulation of FoxP3 expression in human CD4+CD25highregulatory T cells[J].Exp Dermatol，2010;19(1):29-37.

17 Schmausser B，Andrulis M，Endrich S et al.Toll-like receptors TLR4，TLR5 and TLR9 on gastric carcinoma cells:an implication for interaction with Helicobacter pylori[J].Int J Med Microbiol，2005;295(3):179-185.

18 Wang E L，Qian Z R，Nakasono M et al.High expression of Tolllike receptor 4/myeloid differentiation factor 88 signals correlates with poor prognosis in colorectal cancer[J].Br J Cancer，2010; 102(5):908-915.

19 Zhang J J，Wu HS，Wang L et al.Expression and significance of TLR4 and HIF-1α in pancreatic ductal adenocarcinom[J].World J Gastroenterol，2010;16(23):2881-2888.

20 Huber M，Kalis C，Keck S et al.R-form LPS，the master key to the activation of TLR4/MD-2-positive cells[J].Eur J Immunol，2006; 36(3):701-711.

21 Shimura H，Nitahara A，Ito A et al.Up-regulation of cell surface Toll-like receptor 4-MD2 expression on dendritic epidermal T cells after the emigration from epidermis during cutaneous inflammation[J].J Dermatol Sci，2005;37(2):101-110.

[收稿2012-04-26 修回2012-05-04]
(編輯 倪 鵬)

Regulation of Foxp3 expression by TLR4 in Lewis lung cancer cells

LI Chun，YANG Wei，ZHANG Ying-Lin，GAI Xiao-Dong，LI Yi，F(xiàn)U Hai-Ying.Department of Immunology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China

Objective:To investigate whether the expression of Foxp3 in Lewis lung cancer(LLC)cells could be regulated by TLR4 activation.MethodsLipopolysaccharide(LPS)was employed as exogenous ligands to activate TLR4.The mRNA level of Foxp3 was detected by RT-PCR at different time points(12，24，36，48 h)upon LPS stimulation(0，1，10 μg/ml).The protein level of Foxp3 and TLR4 was detected by FCM at 24 h time point upon 10 μg/ml LPS stimulation.Foxp3 mRNA and protein were detected by RTPCR and FCM respectively after LPS activation following blockade of TLR4 by anti-TLR4/MD2 antibody.ResultsThe mRNA level of Foxp3 was significantly increased by 10 μg/ml LPS stimulation at 24 hours(P ＜ 0.05).The protein level of Foxp3 and TLR4 were significantly up-regulated at 24 h time point upon 10 μg/ml LPS stimulation(P ＜ 0.05).The expression of Foxp3 protein was significantly decreased in LLC cells with TLR4 blockade followed by LPS stimulation than that of without TLR4 blocking ones(P ＜ 0.05).ConclusionThese results indicate that TLR4 could be involved in the regulation of Foxp3 expression in LLC cells and TLR4 might be the upstream signaling molecules of Foxp3.

Foxp3;Lewis lung cancer;Toll like receptor 4;Lipopolysaccharide

R730.3

A

1000-484X(2012)08-0701-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.006

①北華大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫教研室，吉林132013

歷 春(1972年-)，女，吉林大學白求恩醫(yī)學院免疫學博士，講師，主要從事腫瘤免疫研究，E-mail:lichunjl@126.com;

及指導(dǎo)教師:付海英(1977年-)，女，博士，講師，主要從事免疫耐受研究，E-mail:fuhaiying612@yahoo.com.cn;

李 一(1961年-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事免疫耐受研究，E-mail:yilili19@yahoo.com.cn。

·腫瘤免疫學·