TLR4活化對(duì)肝癌細(xì)胞H7402生物學(xué)特征的影響①

張譽(yù)藝 屈 靜 張 建 (山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥理與免疫治療學(xué)研究所，濟(jì)南250012)

TLR4活化對(duì)肝癌細(xì)胞H7402生物學(xué)特征的影響①

張譽(yù)藝 屈 靜 張 建 (山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥理與免疫治療學(xué)研究所，濟(jì)南250012)

目的:分析TLR4在肝癌細(xì)胞H7402的表達(dá)水平，研究其活化對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能、炎癥應(yīng)答以及對(duì)化療藥物治療的影響。方法:RT-PCR方法檢測肝癌細(xì)胞TLR4基因、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)水平。LPS作用于肝癌細(xì)胞后，利用MTT法檢測細(xì)胞增殖，AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，熒光定量PCR法檢測腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞表面淋巴細(xì)胞受體的配體及CyclinD1表達(dá)，Western blot檢測Bcl-xl表達(dá)水平。結(jié)果:TLR4在人肝癌細(xì)胞系HepG2、H7402、PLC/PRF/5中都有表達(dá)，LPS能促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的增殖，抵抗順鉑的抗腫瘤作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，LPS能上調(diào)肝癌細(xì)胞周期相關(guān)分子CyclinD1、凋亡相關(guān)分子Bcl-xl的表達(dá)，并下調(diào)Fas的表達(dá)、上調(diào)腫瘤相關(guān)的炎癥因子的表達(dá)。結(jié)論:LPS誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞H7402表達(dá)炎癥因子、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥順鉑產(chǎn)生抵抗作用。

肝癌;TLR4;順鉑;增殖;炎癥因子

Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)是一種模式識(shí)別受體，主要表達(dá)在免疫細(xì)胞上，特別是抗原遞呈細(xì)胞，包括B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等[1]。近些年來人們發(fā)現(xiàn)，TLRs也表達(dá)在一些非免疫細(xì)胞上，其中包括腫瘤細(xì)胞，例如肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等[2-4]，表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上的TLRs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，TLR激動(dòng)劑在激活免疫系統(tǒng)的同時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞也起著一定的作用。某些TLR激動(dòng)劑能夠抑制腫瘤生長，例如，用鞭毛蛋白活化乳腺癌細(xì)胞的TLR5后能夠抑制細(xì)胞增殖從而抑制腫瘤的生長[5];但是，也有很多TLR激動(dòng)劑對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定的促進(jìn)作用，例如，人頭頸部鱗癌細(xì)胞系上的TLR4被激活后能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，并保護(hù)腫瘤細(xì)胞逃逸免疫攻擊[6]。另外，表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的TLRs被激活后，腫瘤細(xì)胞通過分泌免疫抑制因子抑制抗原遞呈細(xì)胞的功能，并分泌促炎因子誘導(dǎo)慢性炎癥;同時(shí)通過誘導(dǎo)抗凋亡蛋白表達(dá)，對(duì)化療藥產(chǎn)生抗藥性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自身的生長[7]。因此，TLR激動(dòng)劑被稱為“雙刃劍”。研究TLR激動(dòng)劑對(duì)腫瘤的直接作用，對(duì)于TLR激動(dòng)劑的應(yīng)用具有很重要的意義。

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，在中國每年肝癌死亡人數(shù)達(dá)160萬人，由肝癌引起的死亡率位居第三，對(duì)人類健康和生存產(chǎn)生了巨大的威脅，因此急需尋找有效的治療方式。目前，由于肝癌的惡性程度高，手術(shù)切除率低，預(yù)后極差，藥物治療是主要的姑息治療手段。TLR4在肝癌細(xì)胞上表達(dá)水平、其活化對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的改變以及對(duì)化療藥物的治療是否產(chǎn)生影響，是本文主要探究的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞系HepG2、H7402、PLC/ PRF/5均購自中國科學(xué)研究院(上海，中國)，并在本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 RPMI1640購于Gibco公司;胰酶購自上海生工生物工程有限公司;新生牛血清購自杭州四季青公司;MTT、LPS購于Sigma公司;DMSO購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Trizol、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自美國 Invitrogen公司; SYRB Green Mix購自日本TOYOBO公司;Easy Taq DNA Polymerase購自TRANSGEN公司;流式抗體MICA/B、ULBP2、ULBP4、CD54、Fas、CyclinD1 等抗體購自美國BD公司;Western blot抗體Bcl-xl購自Bioworld公司;三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等其他試劑為國產(chǎn)分析純，引物由北京華大基因有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞干預(yù) 細(xì)胞系 HepG2、H7402、PLC/PRF/5以含有10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的條件下。將細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞貼壁后，換取無血清培養(yǎng)基使其饑餓12小時(shí)，再換取有血清培養(yǎng)基并加入10 μg/ml LPS刺激6～24小時(shí)，然后進(jìn)行下一步檢測。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖。將0.5×104個(gè)肝癌細(xì)胞接種于96孔板，用不同濃度的LPS刺激24小時(shí)，終止培養(yǎng)前每孔加入20 μl MTT(10 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，棄去上清，每孔加入200 μl DMSO混勻，使甲瓚顆粒溶解。用酶標(biāo)儀(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)在570/630 nm的波長下測其吸光度。

1.2.3 順鉑對(duì)LPS處理的腫瘤細(xì)胞的作用 將H7402細(xì)胞接種于96孔板，每孔0.5 ×104個(gè)，100 μl，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入 100 μl(20 μg/ml)的LPS，使其作用的終濃度達(dá)到10 μg/ml，同時(shí)設(shè)培養(yǎng)基對(duì)照組，待其作用12小時(shí)后，加入5～20 μg/ml順鉑，繼續(xù)作用48小時(shí)，MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖情況。

1.2.4 AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 將1× 105個(gè)H7402細(xì)胞接種于12孔板，以10 μg/ml濃度的LPS作用12小時(shí)，加入10 μg/ml順鉑，繼續(xù)作用10小時(shí);各組收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5分鐘;用預(yù)冷的PBS洗一遍，棄去上清;用200 μl結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸，每管加2 μl Annexin-V/FITC室溫避光孵育15分鐘，再加入5 μl 20 μg/ml PI溶液室溫避光孵育5分鐘;上機(jī)檢測。

1.2.5 RT-PCR Trizol法提取細(xì)胞總 RNA，方法參照Trizol說明書。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并參照之前的方法進(jìn)行PCR[8]。將PCR獲得的產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，用AlphaEaseFC儀拍照并進(jìn)行光密度分析。PCR所用到的引物的序列及產(chǎn)物大小見表1。

1.2.6 熒光定量 PCR 炎癥相關(guān)基因 TNF-α、IL-6、IL-8、VEGF、免疫抑制因子 TGF-β 的表達(dá)情況采用熒光定量PCR的方法檢測。該方法使用SYBR Green Master Mix染色，iCycleriQ real-time PCR儀進(jìn)行檢測。所用到的引物序列見表2。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子表達(dá) 收集細(xì)胞，1×PBS清洗一遍。200 μl PBS重懸細(xì)胞，混勻，加入1 μl抗體，陰性對(duì)照管加入IgG，室溫避光孵育1小時(shí)。1×PBS清洗一遍，200 μl PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.2.8 Western blot檢測Bcl-xl表達(dá) 收集細(xì)胞加入蛋白裂解液提取總蛋白，BSA法繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定提取的蛋白濃度。按照30 μg蛋白/泳道上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移90分鐘至PVDF濾膜，5%脫脂奶粉封閉3小時(shí);加入兔源抗Bcl-xl一抗(1∶500)，37℃孵育2小時(shí);TBST漂洗3次，加羊抗兔二抗(1∶2 000)，37℃孵育1小時(shí);TBST漂洗3次，每次10分鐘;化化學(xué)發(fā)光法顯色后用Bio-Rad成像系統(tǒng)成像。

表1 PCR擴(kuò)增所用的引物及其序列Tab.1 The primer sequences used for the PCR amplification

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 兩組數(shù)據(jù)間比較采用成對(duì)t檢驗(yàn)。P ＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 TLR4在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 通常TLR表達(dá)在免疫細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，然而TLR在其他種類的細(xì)胞中也可能發(fā)揮作用。為了研究

圖1 TLR4在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 The expression of TLR4 on hepatocellular carcinoma cells

圖2 LPS對(duì)肝癌細(xì)胞的促增殖作用Fig.2 LPS promoted the proliferation of hepatocellular carcinoma cells

TLR4在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們采用RT-PCT的方法檢測肝癌細(xì)胞系HepG2、H7402、PLC/PRF/5中TLR4的基因表達(dá)水平。圖1顯示，所檢測的三種肝癌細(xì)胞均有TLR4基因表達(dá)。

2.2 TLR4激動(dòng)劑LPS能肝癌細(xì)胞增殖 為了研究TLR4活化后對(duì)肝癌細(xì)胞的影響，我們選用了TLR4激動(dòng)劑LPS。首先，用MTT比色法檢測LPS對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。將不同濃度的(0.312 5～20 μg/ml)LPS加入到肝癌細(xì)胞中作用24小時(shí)，檢測吸光度計(jì)算增殖率。如圖2所示，LPS對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2及H7402都有顯著的促增殖作用，其中對(duì)H7402細(xì)胞的促增殖作用更為顯著，當(dāng)LPS劑量為20 μg/ml時(shí)，其增殖率達(dá)到 122.43%。

2.3 TLR4活化對(duì)順鉑抗肝癌效應(yīng)的影響 順鉑通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖。為了闡明肝癌細(xì)胞TLR4的活化對(duì)順鉑的治療作用是否有影響，我們首先用10 μg/ml的LPS預(yù)刺激肝癌細(xì)胞系H7402 12小時(shí)，再加入5～20 μg/ml的順鉑作用48小時(shí)，MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖水平。圖3A顯示，經(jīng)LPS預(yù)刺激的細(xì)胞再加入順鉑，其OD值要高于順鉑單獨(dú)作用組。進(jìn)一步用AnnexinV/PI雙染法在H7402細(xì)胞中檢測到LPS預(yù)處理能削弱順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用(圖3B)，順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡率下降了近50%，說明LPS能抵抗順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。

圖3 LPS對(duì)順鉑誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖抑制的影響Fig.3 The influence of LPS on Cisplatin induced the proliferation inhibition of hepatocellular carcinoma cells

2.4 LPS對(duì)腫瘤細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)基因的調(diào)節(jié)為了研究LPS促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們利用RT-PCR的方法檢測LPS刺激后周期相關(guān)分子CyclinE1、CyclinD1、C-myc 及凋亡相關(guān)分子 Bcl-xl、Mcl-1的表達(dá)。圖4A顯示，H7402細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后，CyclinD1、Bcl-xl的表達(dá)水平顯著上調(diào)，CyclinE1、C-myc、Mcl-1沒有明顯變化;進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot方法分別驗(yàn)證了CyclinD1、Bcl-xl的蛋白表達(dá)水平也在LPS作用后上調(diào)(圖4B)。

2.5 LPS對(duì)腫瘤細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的調(diào)節(jié) 在腫瘤微環(huán)境中，炎癥因子能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展;免疫抑制細(xì)胞因子則抑制免疫細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。為了研究LPS作用于肝癌細(xì)胞后對(duì)炎癥因子的表達(dá)是否有影響，我們采用熒光定量PCR的方法檢測H7402細(xì)胞經(jīng)LPS刺激12小時(shí)后TNF-α、IL-6、IL-8、VEGF、TGF-β 的表達(dá)水平。圖 5顯示，LPS作用于 H7402 細(xì)胞后，TNF-α、IL-6、IL-8、VEGF等炎癥相關(guān)基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組均有所上調(diào)，免疫抑制因子TGF-β的表達(dá)也有所上調(diào)。與對(duì)照組相比，上述基因的表達(dá)上調(diào)倍數(shù)分別為1.434、1.322、3.949、2.249 以及 1.506 倍。圖 5 是三次以上平行實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

圖4 LPS對(duì)腫瘤細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)基因的調(diào)節(jié)Fig.4 LPS regulated the expression of molecules associated with cell apoptosis and cell cycle

圖5 LPS對(duì)腫瘤細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的調(diào)節(jié)Fig.5 LPS regulated the expression of genes related to inflammation

圖6 LPS對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)淋巴細(xì)胞受體配體的調(diào)節(jié)Fig.6 LPS regulated the expression of ligands of lymphocyte receptors

2.6 LPS對(duì)腫瘤細(xì)胞表達(dá)淋巴細(xì)胞受體配體的調(diào)節(jié) 活化性受體NKG2D和凋亡相關(guān)分子FasL的活化能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞，如CTL和NK細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。與其相對(duì)應(yīng)的是，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的相應(yīng)受體的配體水平也影響著腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞殺傷的敏感性。我們采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測LPS作用于肝癌細(xì)胞H7402 24小時(shí)后NKG2D的配體 MICA/B、ULBP2、ULBP4，F(xiàn)asL 的受體 Fas，以及粘附分子CD54的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)LPS作用于肝癌細(xì)胞 H7402 后 MICA/B、ULBP2、ULBP4、CD54的表達(dá)均不受影響，而FasL的受體Fas在LPS作用后其表達(dá)顯著下調(diào)，由78.44%下調(diào)到63.07%，見圖6提示LPS能下調(diào)腫瘤細(xì)胞Fas的表達(dá)，有利于腫瘤細(xì)胞逃逸淋巴細(xì)胞的監(jiān)視作用。

3 討論

目前已發(fā)現(xiàn)多種 TLRs，其中在人類發(fā)現(xiàn)了TLR1-TLR11，在小鼠中發(fā)現(xiàn)了 TLR1-TLR13[3]。在TLRs中，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和 TLR10表達(dá)在細(xì)胞膜表面;TLR7、TLR8和TLR9表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體上;而TLR3在細(xì)胞表面及內(nèi)體都有表達(dá)。TLRs能夠識(shí)別不同病原微生物高度保守的病原相關(guān)分子模式(PAMP)[4，9]，其功能主要表現(xiàn)在活化天然免疫，啟動(dòng)抗感染免疫應(yīng)答。例如，巨噬細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞借助TLRs識(shí)別PAMP而被激活，繼而分泌炎性因子、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并發(fā)揮殺菌效應(yīng)。同時(shí)，TLRs也能活化適應(yīng)性免疫。TLRs與PAMP結(jié)合可激活A(yù)PC，使之表達(dá)多種共刺激分子和細(xì)胞因子，從而參與T細(xì)胞的激活與增殖[4]。

TLRs不僅表達(dá)在免疫細(xì)胞上，在腫瘤細(xì)胞上也有表達(dá)，并且對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。一方面，腫瘤細(xì)胞上的TLRs被激活后，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖;另一方面，它也能誘導(dǎo)慢性炎癥的發(fā)生從而促進(jìn)腫瘤的生長。因此，研究表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上的不同TLRs的功能具有非常重要的意義。

對(duì)TLR4的很多研究都是基于TLR4對(duì)免疫細(xì)胞的作用，證明TLR4活化后能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟，這對(duì)于機(jī)體是有利的一面，并且已有報(bào)道認(rèn)為表達(dá)在炎癥細(xì)胞上的TLR4能抑制腫瘤的生長[10]。但是，表達(dá)在腫瘤細(xì)胞上的TLR4作用卻不盡相同。例如，結(jié)腸癌上的TLR4活化能抑制NK細(xì)胞和效應(yīng)性T細(xì)胞的活化從而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展[11];在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞上的TLR4活化能誘導(dǎo)慢性炎癥[12]。

由于肝臟生理環(huán)境所決定，難以避免與細(xì)菌內(nèi)毒素LPS的接觸。我們的研究表明，TLR4在三種肝癌細(xì)胞系中都有表達(dá)，TLR4的激動(dòng)劑LPS對(duì)肝癌細(xì)胞系有顯著的促增殖作用;同時(shí)，LPS處理的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的抗腫瘤效應(yīng)產(chǎn)生明顯的抵抗作用。雖然LPS的受體不僅限于TLR4，TLR2也可以識(shí)別 LPS[13]，但是在我們其他的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LPS對(duì)于不表達(dá)TLR4的腫瘤細(xì)胞不具有促進(jìn)其增殖的作用，說明LPS對(duì)消化系統(tǒng)相關(guān)腫瘤的刺激作用依賴于TLR4的表達(dá)。

進(jìn)一步研究表明，LPS作用于腫瘤細(xì)胞后周期相關(guān)的基因CyclinD1表達(dá)上調(diào)，是引發(fā)LPS促增殖作用的關(guān)鍵分子;而凋亡相關(guān)分子Bcl-xl表達(dá)的上調(diào)，使腫瘤細(xì)胞抗凋亡的能力增強(qiáng)。另外，我們還發(fā)現(xiàn)LPS能促進(jìn)肝癌細(xì)胞H7402炎性因子(IL-6、IL-8、TNF-α)、VEGF等的表達(dá)上調(diào)。這些因子不僅能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，同樣還能促進(jìn)髓系誘導(dǎo)的抑制性細(xì)胞(MDSC)的生長[14-19]。反過來，MDSC又能誘導(dǎo)慢性炎癥，活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而產(chǎn)生免疫抑制作用[20]。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞Fas表達(dá)量的下調(diào)，有利于腫瘤細(xì)胞逃逸CTL或NK細(xì)胞的殺傷。

以上研究結(jié)果提示，LPS持續(xù)活化TLR4可能是導(dǎo)致肝癌發(fā)展、抵抗化療藥的原因之一。本研究為闡明TLR4在肝癌中的意義和尋找有效的腫瘤的生物治療策略提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Kumagai Y，Takeuchi O，Akira S.Pathogen recognition by innate receptors[J].J Infect Chemother，2008;14:86-92.

2 Curtin J F，Liu N，Candolfi M et al.HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression[J].PLoS Med，2009; 6:e10.

3 Fukata M，Chen A，Vamadevan A S et al.Toll-like receptor-4 promotes the development of colitis-associated colorectal tumors[J].Gastroenterology，2007;133:1869-1881.

4 Goto Y，Arigami T，Kitago M et al.Activation of Toll-like receptors 2，3，and 4 on human melanoma cells induces inflammatory factors[J].Mol Cancer Ther，2008;7:3642-3653.

5 Cai Z，Sanchez A，Shi Z et al.Activation of Toll-like receptor 5 on breast cancer cells by flagellin suppresses cell proliferation and tumor growth[J].Cancer Res，2011;71(7):2466-2475.

6 Szczepanski M J，Czystowska M，Szajnik M et al.Triggering of tolllike receptor 4 expressed on human head and neck squamous cell carcinoma promotes tumor development and protects the tumor from immune attack [J].Cancer Res，2009;69:3105-3113.

7 Sato Y，Goto Y，Narita N et al.Cancer cells expressing toll-like receptors and the tumor microenvironment[J].Cancer Microenviron，2009;2(Suppl 1):205-214.

8 Sun X，Zhang J，Wang L et al.Growth inhibition of human hepatocellular carcinoma cells by blocking STAT3 activation with decoy-ODN[J].Cancer Lett，2008;262(2):201-213.

9 Seth Rakoff-Nahoum，Ruslan Medzhitov.Toll-like receptors and cancer[J].Nature Reviews Cancer，2009;9:57-63.

10 Apetoh L，Ghiringhelli F，Tesniere A et al.Toll-like receptor 4-dependent contribution of the immune system to anticancer chemotherapy and radiotherapy[J].Nat Med，2007;13:1050-059.

11 Huang B，Zhao J，Li H et al.Toll-like receptors on tumor cells facilitate evasion of immune surveillance[J].Cancer Res，2005;65: 5009-5014.

12 Chen R，Alvero A B，Silasi D A et al.Inflammation，cancer and chemoresistance:taking advantage of the toll-like receptor signaling pathway[J].Am J Reprod Immunol，2007;57:93-107.

13 Werts C，Tapping R I，Mathison J C et al.Leptospiral lipopolysaccharide activates cells through a TLR2-dependent mechanism[J].Nat Immunol，2001;2(4):346-352.

14 Toi M，Matsumoto T，Bando H.Vascular endothelial growth factor: its prognostic，predictive，and therapeutic implications[J].Lancet Oncol，2001;2:667-673.

15 Takahashi A，Kono K，Ichihara F et al.Vascular endothelial growth factor inhibits maturation of dendritic cells induced by lipopolysaccharide，but not by proinflammatory cytokines[J].Cancer Immunol Immunother，2004;53:543-550.

16 Abdollahi T，Robertson N M，Abdollahi A et al.Identification of interleukin 8 as an inhibitor of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis in the ovarian carcinoma cell line OVCAR3[J].Cancer Res，2003;63:4521-4526.

17 Nakashima J，Tachibana M，Horiguchi Y et al.Serum interleukin 6 as a prognostic factor in patients with prostate cancer[J].Clin Cancer Res，2000;6:2702-2706.

18 Vredevoe D L，Widawski M，F(xiàn)onarow G C et al.Interleukin-6(IL-6)expression and natural killer(NK)cell dysfunction and anergy in heart failure[J].Am J Cardiol，2004;93:1007-1011.

19 Bronte V，Chappell D B，Apolloni E et al.Unopposed production of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor by tumors inhibits CD8 T cell responses by dysregulating antigen-presenting cell maturation[J].J Immunol，1999;162:5728-5737.

20 Serafini P，Mgebroff S，Noonan K et al.Myeloid-derived suppressor cells promote cross-tolerance in B-cell lymphoma by expanding regulatory T cells[J].Cancer Res，2008;68:5439-5449.

[收稿2011-11-20 修回2012-03-16]
(編輯 許四平)

The effects of TLR4 activation on the characterizations of hepatocellular carcinoma cell line H7402

ZHANG Yu-Yi，QU Jing，ZHANG Jian.Institute of Immunopharmacology and Immunotherapy，School of Pharmaceutical Sciences，Shandong University，Jinan 250012，China

Objective:To analyze the expression levels of TLR4 expressed on hepatocellular carcinoma cell line H7402，and investigate the effect of LPS on the tumor characterizations，including proliferation ability，inflammatory response and sensitivity to chemotherapy.MethodsThe expression of TLR4，molecules associated with apoptosis and cell cycle on hepatocellular carcinoma cells was detected by RT-PCR.The proliferation of tumor cells was detected by MTT assay.Cell apoptosis was analyzed by AnnexinV/PI assay.The expression of inflammatory factors was determined by quantitative real-time PCR.FACS was used to detect the expression of the molecules expressed on cell surface and CyclinD1.The expression of Bcl-xl was detected by Western blot.ResultsTLR4 was expressed on human hepatocellular carcinoma cell line HepG2，H7402，PLC/PRF/5.LPS could promote the proliferation of hepatocellular carcinoma cells and protect tumor cells from chemotherapy drug.Further investigation indicated that the molecules associated with cell cycle and apoptosis，CyclinD1 and Bcl-xl，were up-regulated，whereas Fas was down-regulated.Additionally，the inflammatory cytokines were also up-regulated by LPS.ConclusionLPS could induce the expression of inflammatory cytokines，promote the proliferation of hepatocellular carcinoma cell H7402 and protect tumor cells from chemotherapy drug.

Hepatocellular carcinoma;TLR4;Cisplatin;Proliferation;Inflammatory cytokines

R735

A

1000-484X(2012)08-0695-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.005

①本文為國家自然科學(xué)基金(81172789，30972692)資助項(xiàng)目

張譽(yù)藝(1986年-)，女，在讀碩士，主要從事免疫藥理與免疫治療方向的研究，E-mail:yuyi0924@yahoo.com.cn;

及指導(dǎo)教師:張 建(1965年-)，女，博士生導(dǎo)師，主要從事免疫藥理與免疫治療學(xué)方面的研究，E-mail:zhangj65@sdu.edu.cn。