熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo t 5的克隆表達、純化及免疫學(xué)鑒定①

蔡俊龍 楊 彬 鄧宜紅 陳 實 羅慕俠 李 勤 付永鋒 程訓(xùn)佳

(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海200032)

熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo t 5的克隆表達、純化及免疫學(xué)鑒定①

蔡俊龍 楊 彬 鄧宜紅 陳 實 羅慕俠 李 勤 付永鋒 程訓(xùn)佳

(復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，上海200032)

目的:克隆熱帶剝爪螨主要變應(yīng)原Blo t 5基因，表達純化該蛋白，并檢測其免疫活性。方法:提取熱帶剝爪螨總RNA，采用RT-PCR的方法擴增Blo t 5編碼基因，將其連入原核表達載體pET-19b，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 Star (DE3)pLysS，IPTG誘導(dǎo)表達后，通過Ni2+親和層析純化重組變應(yīng)原Blo t 5。用Dot blot、Western blot和ELISA等方法檢測重組變應(yīng)原Blo t 5免疫活性。結(jié)果:Dot blot和Western blot結(jié)果表明重組變應(yīng)原Blo t 5和熱帶剝爪螨粗提液都能和Blo t 5鼠單克隆抗體結(jié)合。重組變應(yīng)原Blo t 5檢測69份熱帶剝爪螨過敏患者血清和21份戶塵螨過敏患者血清中的特異性IgE，陽性率分別為29.0%和33.3%。結(jié)論:表達和純化了具有與天然蛋白相似的免疫活性的重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo t 5，可用于熱帶剝爪螨變應(yīng)原的標(biāo)準化，為標(biāo)準化抗原的臨床特異性診斷與治療奠定基礎(chǔ)。

熱帶剝爪螨;重組變應(yīng)原;Blo t 5;蛋白表達;IgE

塵螨(Dust mites)普遍存在于人類居住和工作的室內(nèi)環(huán)境中，因此也稱屋塵螨(House dust mites，HDM)，其在世界范圍內(nèi)是過敏性疾病的主要危險因素之一[1]。流行病學(xué)資料顯示，在全球范圍內(nèi)，蚍螨科的戶塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和粉塵螨(Dermatophagoides farinae)是最常見的螨種，而在熱帶和亞熱帶地區(qū)，甘(食)螨科的熱帶剝爪螨(Blomia tropicalis)是主要的螨種[2]。熱帶剝爪螨含有多種變應(yīng)原，近年來，通過免疫印跡方法從熱帶剝爪螨中分離鑒別出至少25種變應(yīng)原[3]。已正式命名的有 Blo t 1、Blo t 3、Blo t 4、Blo t 5、Blo t 6、Blo t 10、Blo t 11、Blo t 12、Blo t 13、Blo t 19 和 Blo t 21 等11種[4-11]。Blo t 5是熱帶剝爪螨的主要變應(yīng)原，絕大多數(shù)熱帶剝爪螨過敏患者的血清IgE對它呈高反應(yīng)性[12，13]，也有報導(dǎo)認為 Blo t 21也是主要的變應(yīng)原[4]。至今，Blo t 5的生物學(xué)功能還不清楚。最近的研究發(fā)現(xiàn)Blo t 5主要存在于熱帶剝爪螨的中腸和后腸以及糞便中[4]。Naik等[14]用核磁共振的方法研究Blo t 5的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它的空間結(jié)構(gòu)有兩個很靠近的表位，分別有完整的抗體互補決定區(qū)(Complementarity-determining regions，CDRs)，有很好的抗原抗體結(jié)合性。本研究從培養(yǎng)的熱帶剝爪螨獲得Blo t 5基因并在大腸桿菌中進行表達，建立大量制備并純化具有天然免疫活性的重組變應(yīng)原Blo t 5的方法，為特異性診斷與免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 熱帶剝爪螨 本室分離并培養(yǎng)，培養(yǎng)采用封閉式容器，溫度(25±2)℃，相對濕度75%。

1.1.2 質(zhì)粒載體和表達菌 質(zhì)粒載體pET-19b購自美國Novagen公司;大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞購自大連TaKaRa公司;大腸桿菌BL21 Star(DE3) pLysS購自美國Invitrogen公司。

1.1.3 主要實驗材料 Rneasy Total RNA kit購自德國Qiagen公司;GeneAmp RNA PCR Kit購自美國Perkin-Elmer公司;His-結(jié)合樹脂購自 Novagen公司;Pyrobest DNA多聚酶、堿性磷酸酶(CIAP)、100 bp Ladder Maker、λHind Ⅲ DNA Markers、Ligation Kit、限制性內(nèi)切酶 NdeⅠ和 XhoⅠ等購自大連TaKaRa公司;辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗人IgE、HRP-山羊抗小鼠IgG購自Zymed公司;DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司;引物合成與測序由上海Invitrogen公司完成;抗Blo t 5鼠單克隆抗體1E1、6A11和1C10由本實驗室自制，4℃保存;熱帶剝爪螨過敏患者血清和戶塵螨過敏患者血清來自福建莆田人民醫(yī)院和海南省人民醫(yī)院，陰性血清取自健康志愿者，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 熱帶剝爪螨粗提液的制備 活體熱帶剝爪螨以丙酮脫脂3次，繼以乙醚脫脂4小時以上，離心棄上清，室溫揮發(fā)干燥。脫脂后的螨體以1∶25(W/ V)加入PBS，冰浴超聲后，4℃ 14 000 r/min離心20分鐘，取上清。

1.2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 挑取克隆化培養(yǎng)的熱帶剝爪螨，按照Rneasy Total RNA Kit的使用說明，提取總 RNA;以 GeneAmp RNA PCR Kit進行RT-PCR，獲得cDNA。根據(jù)GenBank公布的熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo t 5的mRNA序列(U59102.1)設(shè)計特異性引物，并在引物5′端加上限制性酶切位點。上 游 引 物:5′-CCCATATGAAGAAGGATGATTTCCGAA-3′，含 Nde Ⅰ酶切位點;下游引物:5′-CCCTCGAGTTATTGGGTTTGAATATC-3′，含 Xho Ⅰ酶切位點。以cDNA為模板，PCR擴增編碼熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo t 5成熟肽段的基因片段。經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物以NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，插入pET-19b載體中構(gòu)建表達質(zhì)粒。然后將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，將菌液涂布于LB瓊脂板(含氨芐青霉素50 μg/ml)，37℃過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定與測序鑒定。

1.2.3 重組變應(yīng)原 Blo t 5的表達 重組質(zhì)粒pET19b-Blo t 5轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 Star(DE3) pLysS后，挑取單菌落入400 ml LB培養(yǎng)液中(含氨芐青霉素 50 μg/ml)，37℃振搖培養(yǎng)至 OD600約為0.5時，加入1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃誘導(dǎo)3小時后，4℃ 10 000 r/min離心10分鐘，收集細菌沉淀。超聲后，12.5%SDS-PAGE電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 重組變應(yīng)原Blo t 5的純化 參照Novagen公司的Ni-NTA His-Bind Resin使用說明，細菌沉淀中，加入20 ml Binding buffer，冰上超聲后，加入200 μg/ml溶菌酶混勻，30℃振搖30分鐘后，冰上超聲，4℃ 14 000 r/min離心20分鐘，上清液用Ni2+親和層析法純化蛋白。以12.5%的SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度。以BCA Protein Assay試劑盒測定蛋白濃度后，4℃冰箱保存。

1.2.5 Dot blot檢測 參照楊柳等[15]法進行 Dot blot檢測。分別將 2 μg 重組變應(yīng)原 Blo t 5、5 μg 熱帶剝爪螨粗提液和2 μg重組隱孢子蟲子孢子表面蛋白P23(rP23)加樣于硝酸纖維素膜上，室溫干燥。以含3%脫脂奶的PBS濕盒內(nèi)室溫封閉1小時。分別加鼠單克隆抗體1E1、6A11和1C10，室溫孵育1小時。分別加HRP-goat Anti-mouse IgG抗體(1∶250稀釋)，室溫孵育1小時。以DAB底物顯色試劑盒顯色20分鐘。

1.2.6 Western blot檢測 參照楊柳等[15]方法進行 Western blot檢測。重組變應(yīng)原 Blo t 5 0.1 μg、熱帶剝爪螨粗抗原5 μg和BSA 0.1 μg每道進行還原SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)到醋酸纖維素膜上。以含3%脫脂奶的PBS于濕盒內(nèi)室溫封閉1小時。分別加單克隆抗體1E1、6A11和1C10，室溫孵育1小時。分別加HRP-goat Anti-mouse抗體(1∶250稀釋)，室溫孵育1小時。以DAB底物顯色試劑盒顯色，20分鐘后終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

1.2.7 ELISA 檢測 重組變應(yīng)原 Blo t 5以0.05 mol/L、pH9.6 的碳酸鹽緩沖液稀釋至 5 μg/ml，每孔用0.1 ml包被酶標(biāo)板，4℃過夜。以含1%脫脂奶的PBS于濕盒內(nèi)室溫封閉1小時。分別加熱帶剝爪螨、戶塵螨過敏患者血清和健康體檢者血清(1∶10稀釋)37℃ 孵育 2小時。HRP-goat-Anti-Human IgE抗體室溫孵育1小時。最終用OPD顯色，反應(yīng)30分鐘終止反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS軟件，采用成組t檢驗方法對熱帶剝爪螨、戶塵螨過敏患者血清和健康體檢者血清與重組變應(yīng)原Blo t 5反應(yīng)性進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR反應(yīng)擴增Blo t 5基因 以RNA提取試劑盒提取熱帶剝爪螨的總RNA，通過RT-PCR反應(yīng)擴增出Blo t 5蛋白編碼基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在350 bp左右處有明顯條帶，大小與理論值(355 bp)相符(圖1)。

2.2 重組表達載體的構(gòu)建與序列分析 經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物以 NdeⅠ和 XhoⅠ雙酶切后，插入pET19b表達載體中。表達載體pET19b-Blo t 5經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，電泳結(jié)果表明目標(biāo)條帶與Blo t 5基因片段的PCR產(chǎn)物大小一致。對Blo t 5基因片段進行測序鑒定，與GenBank中公布的序列(U59102.1)進行比對，結(jié)果表明Blo t 5基因片段與U59102.1 一致。

圖1 Blo t 5基因PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 2%argarose gel electrophoresis analysis of PCR production of Blo t 5 gene

2.3 重組變應(yīng)原 Blo t 5的表達 以重組質(zhì)粒pET19b-Blo t 5轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 Star(DE3) pLysS，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，進行誘導(dǎo)表達，菌體經(jīng)超聲破碎后，進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在分子量約為17 kD處有明顯條帶。重組蛋白主要以可溶形式表達，經(jīng)His-結(jié)合樹脂純化后純度可達99%以上(圖2)。使用BCA Protein Assay試劑盒檢測純化后蛋白的濃度，結(jié)果表明每升培養(yǎng)液能夠得到純化重組變應(yīng)原80 mg。

2.4 Dot blot檢測 重組變應(yīng)原Blo t 5蛋白和熱帶剝爪螨粗提液都可與單克隆抗體1E1、6A11和1C10特異性結(jié)合，而無關(guān)蛋白重組隱孢子蟲子孢子表面蛋白P23無反應(yīng)性(圖3)。

圖2 重組蛋白Blo t 5的SDS-PAGE分析圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant Blo t 5

圖3 目的蛋白Blo t 5的Dot blot鑒定Fig.3 Dot blot analysis of Blo t 5 protein

2.5 Western blot 經(jīng)過還原條件SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜后，用單克隆抗體1E1、6A11和1C10分別作用于重組蛋白和天然蛋白，重組蛋白在17 kD處有明顯條帶，天然蛋白在14 kD處有明顯條帶(圖4)?？笲lo t 5單克隆抗體可與重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo t 5蛋白特異性結(jié)合。

圖4 目的蛋白Blo t 5的Western blot鑒定Fig.4 Western blot analysis of Blo t 5 protein

圖5 熱帶剝爪螨過敏患者、戶塵螨過敏患者和健康體檢者的血清對純化后Blo t 5的反應(yīng)性Fig.5 IgE-binding capacity of purified Blo t 5 to sera from patients allergic to B.tropicalis or HDM and health control

2.6 ELISA檢測 用重組變應(yīng)原Blo t 5檢測69份熱帶剝爪螨過敏患者血清中的IgE，其中20份血清反應(yīng)成陽性，陽性率為29.0%，表明重組變應(yīng)原Blo t 5免疫活性良好。為了解重組變應(yīng)原Blo t 5戶塵螨過敏患者血清的反應(yīng)性，用ELISA檢測其IgE反應(yīng)性，陽性率為33.3%，反應(yīng)性略低于熱帶剝爪螨過敏的患者血清，差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖5)。

3 討論

在眾多的變應(yīng)原中螨類是最主要的變應(yīng)原，花粉、真菌次之。螨變應(yīng)原是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要病因之一，也是引起兒童變應(yīng)性哮喘的獨立且重要的危險因子。塵螨主要包括戶塵螨、粉塵螨和熱帶剝爪螨。在熱帶和亞熱帶地區(qū)熱帶剝爪螨為主要的螨種。陳實等[16，17]在海南進行的大規(guī)模人群的變應(yīng)原皮膚點刺檢測和過敏性哮喘患兒對螨類血清特異性IgE檢測，發(fā)現(xiàn)對熱帶剝爪螨的陽性率高于85%。因此，熱帶剝爪螨變應(yīng)原對于變態(tài)反應(yīng)性疾病的診斷與治療具有重要意義。但是粗提螨浸液成分復(fù)雜，含有不同比例的各種變應(yīng)原或者非變應(yīng)原，處理不當(dāng)可能含有內(nèi)毒素[18，19]，很難達到真正的標(biāo)準化生產(chǎn)，同時也限制了其安全使用，而應(yīng)用重組蛋白的技術(shù)可以解決這個問題。

免疫印跡法研究表明熱帶剝爪螨至少有25條與特異性IgE的結(jié)合條帶，目前正式命名的有11種[4]。剝爪螨變應(yīng)原Blo t 5是熱帶剝爪螨的主要變應(yīng)原蛋白，可被大部分熱帶剝爪螨過敏患者血清中的IgE抗體特異性結(jié)合[4]。本研究中69份對熱帶剝爪螨過敏患者血清有20份對重組變應(yīng)原Blo t 5反應(yīng)成陽性，陽性率29.0%。重組變應(yīng)原Blo t 5與熱帶剝爪螨過敏患者反應(yīng)陽性率的差異，可能是由于不同的檢測方法所導(dǎo)致。另外，對戶塵螨過敏的患者血清對重組變應(yīng)原Blo t 5的陽性率為33%，反應(yīng)的平均值略低于對熱帶剝爪螨過敏患者血清，而兩者間平均值差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。這提示重組變應(yīng)原Blo t 5與戶塵螨變應(yīng)原存在著交叉反應(yīng)性。而有報道指出Blo t 5與Der p 5之間的序列同源性為 43%，有中度的免疫交叉反應(yīng)性[20，21]。

本研究制備重組變應(yīng)原Blo t 5采用的表達載體是pET19b載體，由于其所表達的重組蛋白帶有His標(biāo)簽，在重組蛋白的N末端有10個組氨酸，便于蛋白的純化而對重組蛋白生物學(xué)活性影響不大，因此重組變應(yīng)原Blo t 5比天然蛋白分子量大2 kD左右。實驗結(jié)果表明，重組變應(yīng)原Blo t 5以可溶蛋白形式表達，表達量高，且通過Ni2+親和層析就可以得到純度很高的重組變應(yīng)原Blo t 5蛋白。Dot blot中，重組變應(yīng)原Blo t 5和天然蛋白都能被抗Blo t 5單克隆抗體特異性識別，證實重組變應(yīng)原和天然蛋白有相同的抗原活性。Western blot檢測顯示重組變應(yīng)原Blo t 5和天然Blo t 5具有相同的線性表位?？勺鳛閷釒冏︱^敏患者進行診斷和特異性免疫治療的候選分子。

與天然蛋白相比，制備重組蛋白有周期短、成本低等優(yōu)點。本研究從克隆化培養(yǎng)的熱帶剝爪螨中獲得Blo t 5基因并在大腸桿菌中進行表達，制備純化出具有天然免疫活性的重組熱帶剝爪螨變應(yīng)原Blo t 5，實現(xiàn)熱帶剝爪螨變應(yīng)原的標(biāo)準化，為特異性診斷與免疫治療打下了基礎(chǔ)。同時由于重組變應(yīng)原Blo t 5和戶塵螨之間存在一定的交叉反應(yīng)性，因而本研究也為熱帶剝爪螨與其他過敏原的交叉致敏反應(yīng)的研究奠定了基礎(chǔ)。戶塵螨和熱帶剝爪螨過敏的患者進行脫敏治療時，采用戶塵螨和熱帶剝爪螨聯(lián)合免疫治療的療效應(yīng)該優(yōu)于僅用戶塵螨免疫治療的療效。

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[收稿2012-03-28 修回2012-05-09]
(編輯 倪 鵬)

Blomia tropicalis allergen Blo t 5:cloning，expression，purification and identification

CAI Jun-Long，YANG Bin，DENG Yi-Hong，CHEN Shi，LUO Mu-Xia，LI Qin，F(xiàn)U Yong-Feng，CHENG Xun-Jia.Department of Medical Microbiology and Parasitology，Shanghai Medical College of Fudan University，Shanghai 200032，China

Objective:To clone，express and purify the gene of the major allergen Blo t 5 from Blomia tropicalis and to investigate its immunological activity.MethodsThe total RNA was acquired from B.tropicalis，then the Blo t 5 gene fragments amplified by RT-PCR were cloned into vector pET-19b and then transformed to E.coli BL21 Star(DE3)pLysS.After inducted by IPTG，the recombinant Blo t 5 was purified by Ni2+chelating affinity chromatography.The immunological activity was identified by Dot blot，Western blot and ELISA.ResultsThe results of Dot blot and Western bolt showed both recombinant Blo t 5 and B.tropicalis extract can specially react with monoclonal antibodies against Blo t 5.The IgE antibodies from serum of 69 B.tropicalis allergic patients and 21 Dermatophagoides pteronyssinus allergic patients were tested.The result showed the positive rates were 29.0%and 33.3%，respectively.ConclusionWe have successfully obtained the recombinant allergen Blo t 5 with immunological activity similar to its native counterpart，which could not only resolve the standardization of natural allergen extracts but also contribute to the design of better strategies for the diagnosis and treatment of allergic respiratory diseases.

Blomia tropicalis;Recombinant allergen;Blo t 5;Protein expression;IgE

R392.8

A

1000-484X(2012)08-0690-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.004①本文受國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2007AA02Z472)和衛(wèi)生行業(yè)科研專項項目(20082001)資助

蔡俊龍(1986年-)，男，在讀碩士，主要從事過敏性疾病診斷與防治研究;

及指導(dǎo)教師:付永鋒(1977年-)，男，博士，講師，主要從事過敏性疾病診斷、防治和醫(yī)學(xué)原蟲的致病機制與分子生物學(xué)研究，E-mail:yffu@fudan.edu.cn。