慢性淋巴細(xì)胞白血病患者外周血p53基因突變觀察

朱家斌，周立濤，王曉煒，徐 衛(wèi)，于 亮，李建勇

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院，江蘇淮安223300;2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)臨床進(jìn)程異質(zhì)性較大，一些患者初診時即有臟器腫大、貧血等癥狀，需立即開始治療;另一些患者在整個疾病過程中無任何癥狀或體征，壽命與同年齡的健康人群類似。因此，對其相關(guān)預(yù)后指標(biāo)的研究顯得極其重要。由于CLL的Binet或Rai 分期不能預(yù)測疾病早期是否進(jìn)展，一些新的預(yù)測指標(biāo)不斷被發(fā)現(xiàn)，如淋巴細(xì)胞倍增時間、乳酸脫氫酶、血清 β2-微球蛋白、可溶性CD23、胸苷激酶、分子遺傳學(xué)異常、CD38、ZAP-70、p53基因異常及免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IgVH)基因突變等［1～4］，其中位于 17p的 p53基因的突變與 CLL的病程及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。本研究對CLL患者的p53基因突變情況進(jìn)行了觀察?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2004年10月～2012年1月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院和南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院初診的CLL患者80例，男53例，女27例;年齡31～86歲，中位年齡65歲;符合張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》中的CLL診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。Binet分期［3］A 期 54 例，B 期 6 例，C 期 20例。隨機選擇南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心各項指標(biāo)檢查均正常的健康體檢者10例作為對照。

1.2 p53基因檢測方法 取兩組外周血標(biāo)本5 mL，EDTA抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞(MNC)，應(yīng)用DNA提取試劑盒(挪威Dynal公司)提取DNA，置于－20℃保存?zhèn)溆谩53基因有11個外顯子(exon)，其中exon 1不編碼。起始密碼子位于exon 2，終止密碼子位于exon 11。針對p53基因exon 2～11用Primer Premier 5引物設(shè)計軟件設(shè)計引物。因exon 2和exon 3之間的內(nèi)含子序列較短，故設(shè)計引物時將上游引物置于exon 2的上游，下游引物置于exon 3的下游，同時擴增exon 2和exon 3，依此類推，exon 5和 exon 6、exon 8和 exon 9亦同時擴增。p53基因11個exon的引物序列及產(chǎn)物長度，由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，見表1。PCR反應(yīng)體系:DNA 25 ng，10 mmol/L的上、下游引物各1 μL，Master Mix(北京天根科技有限公司)12.5 μL，加去離子水至終體積 25 μL。exon 10擴增循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性7 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存;其余外顯子退火溫度為60℃，其他循環(huán)參數(shù)相同。從每個反應(yīng)中取5 μL PCR產(chǎn)物加樣于1.5%的含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液中，90 V電泳30 min;陽性條帶回收、純化，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果與野生型p53基因序列比對(野生型序列見http://p53.iarc.fr/TP53sequenceX54156.html)，判斷p53基因突變情況。

1.3 治療及療效評價方法 本組中25例應(yīng)用FC方案(氟達(dá)拉濱25 mg/m2，環(huán)磷酰胺250 mg/m2，第1～3天靜滴)化療，28d為1個療程，應(yīng)用2～6個療程。療效評價依據(jù)美國國家癌癥研究所(NCI)工作組推薦的標(biāo)準(zhǔn)。完全緩解(CR):癥狀消失，無淋巴結(jié)、肝、脾等臟器腫大，血象正常，包括中性粒細(xì)胞＞1.5×109/L、淋巴細(xì)胞 ＜4 ×109/L、血紅蛋白 ＞110 g/L、血小板＞100×109/L，骨髓涂片淋巴細(xì)胞＜30%。上述改善需維持2個月。部分緩解(PR):腫大的淋巴結(jié)、肝、脾縮小≥50%;下列幾項中至少滿足1項:中性粒細(xì)胞 ＞1.5×109/L，血紅蛋白 ＞110g/L、血小板＞100×109/L，無輸血情況下中性粒細(xì)胞、血紅蛋白、血小板數(shù)較治療前上升50%。上述狀癥改善持續(xù)2個月?？偡磻?yīng)率(OR)為CR、PR例數(shù)之和占總例數(shù)的百分比。

表1 p53基因11個exon的PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較行χ2檢驗及 Fisher's確切概率法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p53基因突變情況 80例CLL患者中12例(15.0%)檢測到p53基因突變，其中11例為錯義突變、1例為無義突變，未檢測到插入和缺失;突變位點均發(fā)生在exon 5～9，其中發(fā)生在exon 5 2例、exon 6 3例、exon 7 1例、exon 8 5例、exon 9 1例，exon 2～4、exon 10、exon 11未檢測到突變。健康體檢者外周血中均未檢測到p53基因突變。二者p53基因突變率比較，P ＜0.05。

2.2 p53基因突變與CLL臨床病理參數(shù)的關(guān)系 p53基因突變與CLL患者外周血白細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白水平和血小板計數(shù)均無關(guān)(P均＞0.05)，與 Binet分期、p53 基因缺失、IgVH 突變有關(guān)(P均＜0.05)。見表2。

表2 p53基因突變與CLL臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 p53基因突變CLL患者的FC方案化療效果本組80例患者中25例行FC方案化療，結(jié)果CR 5例，PR 11例，OR為64.0%。p53基因突變者(7例)，無1例達(dá)CR，PR 1例，OR 為14.3%;p53基因無突變者(18例)CR 5例，PR 10例，OR為83.3%。二者 OR 比較，P ＜0.05。

3 討論

在人類腫瘤中，p53基因的改變是迄今為止發(fā)現(xiàn)的變化頻率最高的一種分子異常，涉及一半以上的腫瘤［5］。p53基因是一種抑癌基因，定位于人類染色體17p13.1，編碼的蛋白質(zhì)為53 kD。野生型p53作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可以激活p21基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，而p21蛋白可抑制人周期素依賴性激酶(CDK)的活性，從而阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)程;p53蛋白亦可通過上調(diào)noxa、puma和bax等促凋亡基因，以及下調(diào)bcl-2和mcl-1等抗凋亡基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。

突變的p53蛋白喪失了野生型p53蛋白的功能，同時其表達(dá)水平增高、半衰期延長，與野生型p53蛋白形成異源寡聚體使之失活，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖及耐藥［7］。已發(fā)現(xiàn)，p53基因exon 5～8是突變熱點區(qū)域，不同組織器官腫瘤的p53突變譜有差異，但約有90%的突變集中在此區(qū)域［8］。p53基因突變在CLL并不常見，見于10% ～15%的初治CLL患者［9，10］。本研究中80例 CLL中12例存在 p53突變，突變率為15%，與國外報道類似［9，10］。其中 11例突變位點均位于突變熱點區(qū)域exon 5～8，1例位于exon 9，其他外顯子未檢測到突變。

研究［11］表明，p53突變與CLL臨床分期關(guān)系密切。Sturm等［10］發(fā)現(xiàn)，p53的突變率與患者初診時的年齡、性別、外周血白細(xì)胞計數(shù)等無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，p53突變與CLL患者外周血白細(xì)胞計數(shù)、外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白水平和血小板計數(shù)均無關(guān)(P 均 ＞0.05)，而與 Binet分期有關(guān)(P ＜0.05)，表明p53突變患者往往處于病程晚期，預(yù)后差。

p53基因缺失與突變存在相關(guān)性，缺失往往伴隨另一條等位基因的突變。Saddler等［12］檢測了106例CLL患者p53基因的缺失和突變情況，15例p53缺失者中12例(80.0%)同時有p53突變，而91例無p53缺失者僅4例(4.4%)伴突變(P＜0.05)，表明p53基因缺失往往與突變伴隨。一個p53等位基因的缺失導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物mRNA和蛋白水平下降，即單倍不足［13］;若另一個等位基因亦發(fā)生突變則產(chǎn)生了突變的p53蛋白，失去了抑制腫瘤增殖的作用;同時，突變的p53蛋白與野生型p53蛋白相結(jié)合，抑制其功能，使得一些癌基因轉(zhuǎn)錄失控導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［7］。本研究結(jié)果顯示，12例突變者中5例伴有p53基因缺失，68例無突變者中僅4例伴有p53基因缺失，表明p53突變和缺失往往同時存在，兩者的共同作用可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

Zenz等［14］研究發(fā)現(xiàn)，p53缺失伴突變、單獨缺失和單獨突變患者的生存期分別為 7.6、5.4、5.5 個月，均明顯短于無p53異常者的69個月。p53突變和缺失均為CLL的獨立預(yù)后因素，無論是p53缺失伴突變、單獨缺失還是單獨突變，患者的預(yù)后都很差。由于本研究中p53異常患者例數(shù)較少，且隨訪時間較短(中位隨訪24個月)，目前僅1例死亡，因而未能進(jìn)行生存分析。

IgVH基因突變被認(rèn)為是CLL最可靠的預(yù)后因素，無突變者預(yù)后較差［15］。已有研究［9］證實，p53突變與IgVH無突變有明顯相關(guān)性，p53突變者往往不伴隨IgVH突變，該類患者生存期短。我們亦發(fā)現(xiàn)，p53突變者中IgVH無突變率明顯高于p53無突變者(P ＜0.05)。

研究表明，p53突變的CLL患者對化療耐藥，且是有選擇的對烷化劑以及嘌呤類似物耐藥，提示烷化劑和嘌呤類似物通過p53途徑發(fā)揮作用［10］。對于p53突變者，應(yīng)選用其他不涉及p53信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的藥物，如大劑量甲強龍［16］、阿侖單抗［17］等。本研究發(fā)現(xiàn)，p53突變的CLL患者采用FC方案化療OR明顯低于無突變者。因此，對于p53突變的CLL患者，應(yīng)避免選擇涉及p53信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的藥物如環(huán)磷酰胺、氟達(dá)拉濱等。

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