D-二聚體單克隆抗體制備及其在免疫熒光快速定量檢測中的應用

康可人，吳培鈿，盧艷華，張健，唐時幸，王繼華

D-二聚體單克隆抗體制備及其在免疫熒光快速定量檢測中的應用

康可人，吳培鈿，盧艷華，張健，唐時幸，王繼華

D-二聚體（D-dimer，D-D）是纖維蛋白單體經活化因子 XIII 作用后形成的交聯纖維蛋白凝塊，再經纖溶酶水解所產生的一種特異性降解產物，醫(yī)學應用上將它作為一個特異性的纖溶過程標記物，反映纖維蛋白溶解功能[1]。與纖維蛋白破壞有關的疾病，如深靜脈血栓形成（DVT）、肺栓塞（PE）和彌漫性血管內凝血（DIC）等，均可導致體內 D-D水平升高[2-6]。近年來 D-D 的臨床應用范圍越來越廣，除了以上提及的疾病外，在惡性腫瘤、糖尿病、肝臟疾病、膿毒血癥的診斷以及溶栓治療監(jiān)測方面均具有重要的參考價值[7-9]。

目前 D-D 蛋白檢測方法主要有膠體金法、酶聯免疫吸附法（ELISA）和第二代膠乳凝集法（免疫比濁法）[10]。膠體金法快速簡單，但無法實現定量檢測；ELISA 法可精確定量，但操作步驟繁瑣；免疫比濁法敏感性高，檢測結果準確，但試劑以進口為主[11]。熒光免疫定量檢測技術，屬于即時檢測（point-of-care testing，POCT）[12]領域的新興技術，能快速、靈敏、簡便地實現指標的定量檢測，免疫熒光定量檢測技術經過一定階段的發(fā)展，目前主要在感染性指標（如C 反應蛋白）和心臟標志物指標的應用上較為多見，廠家以歐美、韓為主。本研究利用雜交瘤技術制備篩選能穩(wěn)定分泌特異性抗 D-D 抗體的細胞株，初步應用于免疫熒光定量檢測平臺，實現對 D-D 快速定量檢測，為臨床相關疾病的診斷、治療、監(jiān)測提供有效工具與手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及動物 人源 D-二聚體蛋白購自英國 Abcam公司；纖維蛋白原購自北京博潤萊特科技公司；人纖溶酶、弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA）、小鼠單克隆抗體亞型檢測試劑盒均購自美國 Sigma 公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、HAT、HT、聚乙二醇（PEG）（Mw 4000）均為美國 Gibco 公司產品；羊抗鼠 IgG-HRP酶購自北京中杉金橋公司；纖維蛋白原降解物（纖維蛋白解復合物、D 和 E 片段）由本室制備保存；小鼠骨髓瘤細胞系（SP2/0）為本實驗室傳代保存；實驗室用水為超純水；所用化學試劑均為國產分析純。SPF 級 BALB/c 純系小鼠，鼠齡 6 ～ 8 周，體重 18 ～ 22 g，由中山大學實驗動物中心提供。

1.1.2 儀器 Multiskan MK3 酶標儀、BB15 型 CO2培養(yǎng)箱為美國 Thermo 公司產品；SDS-PAGE 電泳儀購自北京六一公司；飛測免疫熒光定量檢測儀由廣州萬孚生物技術有限公司研制；高速冷凍離心機為日本 Hitachi 公司產品；ACL TOP 血凝分析儀為美國 Beckman 公司儀器，D-D 檢測試劑為西班牙 Werfen Group 產品。

1.1.3 臨床樣品來源 自 2011年1月至 6月期間，收集江門市五邑中醫(yī)院門診病人血漿（枸櫞酸鈉抗凝血，離心收集血漿），共 106 例。D-二聚體含量均經血凝儀定值。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細胞株的建立 取 6 ～ 8 周齡的 BALB/c小鼠，首次免疫將福氏完全佐劑與等體積的 D-D 蛋白乳化后于小鼠皮下、足墊處注射，50 μg/只，經 3 次加強免疫后，尾靜脈采血，間接 ELISA 法檢測小鼠血清效價，效價大于104的小鼠，腹腔沖擊免疫 1 次，3 d 后取其脾細胞制備雜交瘤。細胞融合按照常規(guī)半固體法進行。將離心好的融合細胞，依次加入 FBS、飼養(yǎng)細胞、HAT 溶液、半固體培養(yǎng)基，定容至 40 ml，置于混勻儀上混勻 30 min 后，分別倒入30 個培養(yǎng)皿中，確保半固體均勻貼皿底，裝入濕盒，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 ～ 7 d 后，挑選大小適中的單集落克隆，轉入 96 孔板培養(yǎng)，細胞長至培養(yǎng)孔面積 50% 后，用間接法檢測細胞上清，篩選高效價的細胞株進行多次亞克隆，確保細胞株在體外連續(xù)傳代 3 個月和多次凍存后再復蘇仍能穩(wěn)定分泌抗體。經定株后常規(guī)制備腹水，采用小鼠體內誘生法制備腹水，經正辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，制備單克隆抗體。

1.2.2 單克隆抗體的鑒定

1.2.2.1 效價測定 單克隆抗體的效價采用間接 ELISA法測定。用 D-二聚體蛋白（1 μg/ml）包被 ELISA 板，將抗體稀釋到 1 mg/ml 后，從 1∶1000 濃度開始做 10 倍稀釋，加入板中，37 ℃ 孵育 1 h，洗滌后加二抗 HRP 標記的羊抗鼠-IgG 反應，洗滌后加入 TMB 底物顯色，設陰性（N）、陽性（P）對照。效價以 P/N ＞ 2.1 為陽性標準。

1.2.2.2 Ig 類和亞類的鑒定 采用小鼠 mAb 分型試劑盒測定抗 D-D 單抗的 Ig 亞類。依照試劑盒說明書操作。

1.2.3 mAb 特異性鑒定

1.2.3.1 抗體交叉反應性研究 用間接 ELISA 法測定。將 D-D、纖維蛋白原、纖維蛋白原降解物、D 片段、E 片段包被于 ELISA 微孔板，加入抗體，再加入二抗 HRP 標記的羊抗鼠-IgG，進行顯色反應。

1.2.3.2 免疫印跡法測定單抗特異性 天然狀態(tài)的 D-D為二聚體，且與纖維蛋白原有同源性，故采用非還原蛋白、還原蛋白、纖維蛋白原及其降解片段進行檢測。D-D 分子量約為 200 kD，纖維蛋白原分子量約為 340 kD，降解后片段約 47 ～ 150 kD 不等。因此，為確保纖維蛋白原各片段均轉移到硝酸纖維素膜上，經預實驗，選取 5% 濃縮膠，8%分離膠進行 SDS-PAGE 電泳，上樣量 1 μg，并以預染marker 作示蹤。待 50 kD 條帶達到分離膠下緣約 3 cm 左右處，停止電泳，進行濕轉印。轉印條件為 300 mA，4 ℃，恒流轉印 2 h，于轉印后用麗春紅 S 染色，確認轉印效果。以 3% BSA封閉，放置 4 ℃ 封閉過夜。室溫下加一抗孵育 1 h，一抗?jié)舛葹?1 μg/ml，用 PBST 洗滌 4 次，每次10 min；室溫下加二抗，二抗稀釋比例為 1∶20 000，用 PBST洗滌 4 次，每次 10 min，以增強型化學發(fā)光（ECL）為底物，進行顯影。

1.2.3.3 mAb 親和力測定 采用非競爭酶免疫試驗，參照David Beatty 方法[13]，按公式Ka = (n-1)/2(n[Ab′]t － [Ab]t)計算親和常數Ka 值。分別以每孔 0.5、0.25、0.125 μg/ml 的D-D 蛋白包被 ELISA 板，加入倍比稀釋的 mAb，37 ℃作用 30 min 后，加入 1∶20 000 稀釋的 HRP 標記羊抗鼠-IgG，37 ℃ 反應 30 min，TMB 顯色，測 450 nmOD值。以 mAb 濃度對數為橫坐標，以OD值為縱坐標，得到OD值對抗體濃度的對數作圖，以每條曲線上部平坦段的OD值作為 100%，在曲線上查出 50% 的OD值所對應的mAb 濃度，然后按公式計算出親和常數。n = [Ag′]t/[Ag]t，[Ag′]t 和 [Ag]t 為不同包被抗原的濃度；[Ab′]t、[Ab]t 是對應不同包被抗原的濃度條件下，將抗體梯度稀釋得到最大吸光度一半處的抗體濃度。

1.2.4 免疫熒光定量方法的建立及臨床應用

1.2.4.1 標準曲線建立 將 D-D 蛋白稀釋到 10、5、1、0.5、0.2 和 0.1 μg/ml 濃度，以血凝儀檢測各定標點得到實際濃度，使用定值后的系列梯度蛋白溶液作為實驗標準品。根據檢測標準品的定標濃度及測得的熒光值確定數據處理方法，繪制標準曲線，得到方程。

1.2.4.2 臨床初步應用 使用篩選到的抗 D-D 配對抗體建立雙抗體夾心法，利用“飛測”免疫熒光定量檢測儀檢測臨床樣本熒光信號，將測得的熒光值代入方程，反求出樣本實際濃度，并將樣本測得的濃度與醫(yī)院檢測濃度對比，計算相關系數。

1.3 統計學處理

采用直線相關與統計學方法進行分析。以 Pearson 乘積矩相關系數定量表述線性相關的程度。P＜ 0.05 為差異顯著。

2 結果

2.1 雜交瘤細胞株的建立

經過 4 次細胞融合，采用間接 ELISA 法進行反復篩選，3 ～ 5 次亞克隆，最終獲得 7 株穩(wěn)定分泌特異性抗 D-D抗體的細胞株，對其進行亞克隆建株保存。后經 ELISA 抗體配對實驗，篩選出 2 株配對效果好的抗體，命名為 2-6D、4-4C，進行以下抗體鑒定分析及臨床應用評價。

2.2 抗 D-二聚體單抗的鑒定

2.2.1 效價測定 mAb 的效價采用間接 ELISA 法測定。結果顯示，2 株抗體 2-6D 和 4-4C 的效價分別為 0.321 ×10-6和 0.372 × 10-6。效價均大于 1∶105。

2.2.2 Ig 類和亞類的鑒定 經小鼠 mAb 分型試劑盒測定，所獲得的兩株抗 D-D mAb 為 IgG2a 亞類。

2.2.3 mAb 特異性鑒定

2.2.3.1 抗體交叉反應性研究 結果顯示，兩株單克隆抗體與纖維蛋白原及其降解物，D 片段和 E 片段不發(fā)生反應，與 D 單體有反應。

2.2.3.2 免疫印跡法測定單抗特異性。如圖 1A、圖 1B 所示，兩株 mAb 與非還原的 D-D 蛋白呈陽性反應，與其他蛋白包括還原 D-D 均不反應。

圖 1 4-4C（A）與 2-6D（B）抗體免疫印跡分析

2.2.4 mAb 親和力測定 采用非競爭酶免疫試驗，參照David Beatty 方法測定。兩株單抗與 3 個不同包被濃度的D-D 蛋白均特異性結合，經 Beatty 推導公式，計算親和常數，結果顯示單克隆抗體 2-6D 和 4-4C 的親和常數分別為9.84 × 10-7和 1.46 × 10-6。結果見圖 2。

2.3 免疫熒光定量方法的建立及臨床樣本檢測結果

2.3.1 標準曲線建立 將 D-D 蛋白稀釋到 10、5、1、0.5、0.2、0.1 μg/ml 濃度，血凝儀檢測各定標點，得到實際濃度分別為 10、5.03、1.03、0.53、0.32、0.11 μg/ml。以此系列梯度蛋白溶液作為實驗標準品，D-D 濃度值為橫坐標，熒光檢測值為縱坐標，繪制標準曲線。由標準曲線可以得出，檢測濃度的線性范圍在 0.1 ～ 10 μg/ml，熒光信號強度與濃度之間的線性關系表達式是 y = 0.0016x3－ 0.0367x2+0.5177x + 0.7892（y 表示熒光信號強度，x 表示 D-D 濃度）。根據公式計算r2 = 0.9996。結果見圖 3。

圖 2 2-6D（A）與 4-4C（B）親和常數測定

2.3.2 臨床初步應用 將 2-6D 作為包被抗體，4-4C 為標記抗體，采用雙抗體夾心法，檢測臨床樣本熒光信號，結果如圖 4。將測得的熒光值代入方程，反求出樣本實際濃度，根據臨床檢測標準，大于 0.5 μg/ml 判為陽性。將樣本測得的濃度與醫(yī)院檢測濃度對比，繪制散點圖，見圖 5。得出方程 y = 0.7199x + 0.0379。計算出r2 = 0.9596，P＞ 0.05，兩種方法無顯著差異。

圖 4 ACL TOP 血凝儀與免疫熒光定量儀（2-6D/4-4C）測定 106 份臨床樣品 D-D 值

圖 3 應用配對抗體 2-6D/4-4C 建立的標準曲線

3 討論

人體纖溶系統是最重要的抗凝系統，它對保持血管壁的正常通透性，維持血液的流動狀態(tài)和組織修復起著重要作用。D-D 是纖溶過程中纖維蛋白降解產物的重要成分，纖溶酶不僅使非交聯的纖維蛋白單體裂解成肽段，還可使交聯纖維蛋白降解，釋放出 D、E 碎片，并生成 DD、DD/E、YD/DY、YY/DD 等復合物，這些碎片進一步降解為最小的片段 D-D[1]。

D-D 是交聯纖維蛋白特異性降解產物，其生成和增高反映了纖溶系統的激活，因此 D-D 交聯碎片可反映血栓形成后的溶栓活性。在臨床上已作為血液高凝狀態(tài)和繼發(fā)性纖溶亢進的特異性指標應用[2-9]。如 D-D 檢測陰性，可以排除急性靜脈血栓栓塞癥，D-D 陽性結合臨床表現可診斷急性 VTE。此外，D-D 的監(jiān)測還可反映急性靜脈血栓栓塞癥藥物抗凝溶栓治療的效果以及評價復發(fā)的危險程度及預后。在嚴重感染、惡性腫瘤、糖尿病、貧血等疾病進展中，均可出現血漿 D-D 水平變化。

圖 5 ACL TOP 法與免疫熒光定量法（2-6D/4-4C）測定結果相關性分析

臨床將 D-D 檢測指標作為體內血栓前狀態(tài)及血栓形成的指標之一，應用越來越廣泛。但是到目前為止，商品化的 D-D 檢測手段尚存在一定局限性，試劑質量參差不齊，主要以 ELISA 方法和膠乳凝集法為主，市面上的主流產品均以進口為主，而其主要生物原材料，即單克隆抗體基本依靠國外進口[14]。本研究采用血漿提取的 D-D 蛋白為免疫原，利用雜交瘤技術制備篩選出穩(wěn)定分泌特異性抗體的細胞株，獲得 7 株穩(wěn)定分泌特異性抗 D-D 抗體的細胞株，經鑒定，其中兩株抗體 2-6D 和 4-4C 配對效果好，其抗體親和力分別為 9.84 × 10-7和 1.46 × 10-6，說明其應用于診斷試劑的可行性。在特異性鑒定方面，兩株單抗經免疫印跡檢測，與非還原的 D-D 呈陽性反應，與其他蛋白均無交叉，提示應用于診斷試劑中，兩株抗體滿足靈敏度前提下，能較好地實現 D-D 指標檢測的特異性。

熒光免疫定量檢測技術，屬于 POCT 檢驗領域新興技術，能快速、靈敏、簡便地實現指標的定量檢測。POCT 在20 世紀 90年代得到快速發(fā)展，隨著各種檢測技術的興起及檢測儀器的創(chuàng)新，POCT 的應用日益廣泛。免疫熒光技術屬于以微粒為載體的精確定量免疫分析方法，國外已有一些公司開發(fā)了適用于此平臺的檢測試劑及儀器，如 Response公司的 RAMP 檢測儀，Biosite 公司的 Triage 檢測儀。開展的項目包括心肌梗死，感染類標志物等。鑒于這些儀器及試劑售價昂貴，在中國實際需要檢測的項目不一定有產品，因此其應用受到一定限制。目前，國內自主研發(fā)的免疫熒光定量檢測方法的試劑及配套儀器為數不多，檢測指標則更為局限，目前應用較為普遍的是“飛測”免疫熒光檢測儀，該系統是由一個熒光讀數儀和檢測板組成，檢測板使用的是層析法，樣本中的目標物在移動過程中與標記抗體形成免疫復合物，通過檢測區(qū)域、質控區(qū)域的值與目標物不同的濃度獲得定標曲線，檢測樣本中的濃度，現階段尚未有成功應用于臨床的 D-D 免疫熒光定量檢測試劑上市。本研究利用國內已上市的飛測熒光免疫定量檢測儀器平臺基礎，研制 D-D免疫熒光定量檢測試劑。本研究嘗試建立 D-D 的免疫熒光定量檢測方法，其一，可實現關鍵生物原材料自主提供，其二，也是更為關鍵的，可填補國內免疫熒光定量檢測 D-D方法學的空白，為臨床相關疾病的診斷、治療、監(jiān)測提供有效工具與手段。

本研究篩選的 2 株單抗具有靈敏度高，特異性強的特點，可以用于免疫熒光定量方法學及 ELISA、Western blot中。通過檢測臨床樣品發(fā)現我們開發(fā)的 D-D 檢測試劑分析靈敏度可達到 0.1 μg/ml，與對照方法比較，r2= 0.95，兩者相關性好。在檢測 106 例臨床樣品中，我們建立的免疫熒光定量方法與對照方法（比濁法）比較，存在高值偏低現象，考慮是與膠乳標記工藝相關，因此在后續(xù)實驗中，將調整膠乳標記蛋白的工藝，期望獲得改善。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.013

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2011ZX09506-001）

510640 廣州，華南理工大學生物科學與工程學院（康可人、盧艷華）；510663 廣州萬孚生物技術有限公司國家地方聯合自檢型快速檢測工程實驗室（康可人、吳培鈿、張健、唐時幸、王繼華）

康可人，Email：keren_kang@hotmail.com

2012-02-16