HPLC法測定鹽酸伊立替康的有關(guān)物質(zhì)

張建義，吳燕嬌，韓繼永，賈 佳

(江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司，江蘇南京211112)

鹽酸伊立替康(irinotecan hydrochloride，CPT－11)是日本第一制藥和Yakuh Honsha公司于1994年開發(fā)上市的抗腫瘤藥［1］，是一種半合成的可溶性喜樹堿類衍生物，主要用于細(xì)胞周期的S期，通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ，干擾DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，1998年獲得FDA批準(zhǔn)，用于標(biāo)準(zhǔn)化療方案治療后轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌復(fù)發(fā)和惡化的治療，與氟尿嘧啶、亞葉酸聯(lián)合用于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌的一線治療，本品單用或與其他藥物聯(lián)合用藥也可用于小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、惡性腦瘤、胃癌、胰腺癌、子宮頸癌等其他腫瘤的治療［2～4］。該藥于2001年3月在中國上市，國內(nèi)關(guān)于本品的有關(guān)物質(zhì)報(bào)道相對較少，而鹽酸伊立替康國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中的有關(guān)物質(zhì)檢查法未對已知雜質(zhì)進(jìn)行規(guī)定，我們根據(jù)生產(chǎn)工藝，對本品的已知雜質(zhì)的檢查方法進(jìn)行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC－20A高效液相色譜儀，SPD－20A紫外檢測器，日本島津公司;BP211D電子分析天平，德國塞多利斯公司;Seven－Multi型精密pH計(jì)，瑞士梅特勒－托多利儀器有限公司。

1.2 試藥 鹽酸伊立替康、雜質(zhì)A(10－羥基喜樹堿)、雜質(zhì)B(7－乙基－10－羥基喜樹堿)、雜質(zhì)C(4－甲基－4－羥基鹽酸伊立替康)、雜質(zhì)D(鹽酸伊立替康R－異構(gòu)體)、雜質(zhì)E (喜樹堿)、雜質(zhì)F(7－乙基喜樹堿)均為自制。磷酸二氫鉀、磷酸為分析純;乙腈、甲醇為色譜純;蒸餾水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠(島津VP－ODS，4.6 mm×250 mm，5 μm)流動(dòng)相A:2.72 g磷酸二氫鉀溶于1 L水中，用稀磷酸調(diào)pH至4.0;流動(dòng)相B:乙腈－甲醇(3∶2)。進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相B的變化時(shí)間表為(0～40 min，20%→70%;40～45 min，70%→70%;45～50 min，70%→20%;50～55 min，20%→20%)，流速為1.0 mL·min－1;檢測波長220 nm;進(jìn)樣體積:10 μL。

2.2 雜質(zhì)的定位及系統(tǒng)適用性研究 取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F分別制成每1 mL中約含雜質(zhì)C 1.0 μg、雜質(zhì)A、B、E、F各1.5 μg的溶液，精密量取10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

2.3 方法專屬性研究 平行取本品5份各20 mg，置20 mL量瓶中，分別進(jìn)行酸、堿、氧化、加熱及光照破壞試驗(yàn)，經(jīng)過適當(dāng)處理后，再用稀釋液稀釋至刻度，搖勻后，濾過，精密量取上述溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍，鹽酸伊立替康主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離良好，分離度均在1.5以上。

2.4 校正因子的計(jì)算 取鹽酸伊立替康和雜質(zhì)A、B、C、E、F適量，精密稱定，置同一量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋制成每1 mL中約含鹽酸伊立替康、雜質(zhì)A、B、E、F各1.5 μg、雜質(zhì)C 1.0 μg的溶液，作為供試品溶液;精密量取10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)測定5次，以鹽酸伊立替康為參照，計(jì)算校正因子，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸伊立替康有關(guān)物質(zhì)檢查雜質(zhì)校正因子研究結(jié)果

2.5 雜質(zhì)回收率實(shí)驗(yàn) 取本品約10 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，平行9份，平均分成3組，分別精密加入限度濃度量的50%、100%、150%的雜質(zhì)A、B、C、E、F，用稀釋液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液;精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。分別進(jìn)樣10 μL，根據(jù)上述校正因子研究結(jié)果，按加校正因子的主成分自身對照法，計(jì)算各雜質(zhì)的含量，雜質(zhì)A、雜質(zhì) B、雜質(zhì) C、雜質(zhì) E、雜質(zhì) F的平均回收率分別為110.1%(RSD 6.74%)、115.1%(RSD 8.06%)、86.5%(RSD 7.44%)、95.1%(RSD 7.32%)、92.8%(RSD 9.71%)，表明本法的準(zhǔn)確度良好。

2.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積。主峰峰面積與總雜峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.11%與0.54%，表明本法進(jìn)樣精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品適量，平行6份，加稀釋液制成每1 mL中約含鹽酸伊立替康1 mg的供試品溶液，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度作為對照溶液。分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。按加校正因子的自身對照法計(jì)算，結(jié)果表明:雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F的RSD分別為:6.71%、7.61%、4.42%、4.54%、4.71%。本品雜質(zhì)含量小于0.5%，參照《中國藥典》2010版(二部)附錄ⅤD高效液相色譜法中規(guī)定，RSD應(yīng)小于10.0%，結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性 取進(jìn)樣精密度試驗(yàn)項(xiàng)下的供試品溶液，室溫下自然放置，分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣10 μL，考察各雜質(zhì)峰面積的變化情況，主峰峰面積、總雜峰面積、最大單雜峰面積RSD分別為:0.19%、1.38%、0.20%。結(jié)果表明，本品測試溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 樣品有關(guān)物質(zhì)測定 取本品，加稀釋液溶解并稀釋制成每1 mL中約含伊立替康1 mg的溶液，作為供試品溶液;精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取對照溶液10 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的10%;再精密量取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰，各已知雜質(zhì)峰按加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 鹽酸伊立替康有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果(單位:%)

3 討論

本品為喜樹堿的半合成衍生物，雜質(zhì)種類較多，采用本方法可以測定鹽酸伊立替康原料中的有關(guān)物質(zhì)。通過對精密度及回收率等方法學(xué)研究表明，本法簡便、靈敏、準(zhǔn)確。對比國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1－(X329)－2003Z，本方法對已知雜質(zhì)的限度及校正因子進(jìn)行了詳細(xì)的考察，而國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中未予以考察，說明本方法對鹽酸伊立替康的研究更為細(xì)致、深入，所得到的研究結(jié)果可信度也更高，所以本方法適用于鹽酸伊立替康有關(guān)物質(zhì)的檢測。目前鹽酸伊立替康國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中對有關(guān)物質(zhì)的規(guī)定指標(biāo)較低，本法為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考。本方法亦可用于其體內(nèi)代謝產(chǎn)物的測定，可以用于其在臨床藥物動(dòng)力學(xué)方面的研究。

［1］ Wiseman L，Markham A.Irinotecan－A review of its pharmacological properties and clinical efficacy in the management of advanced colorectal cancer［J］.J drugs，1996，52 (4):606－623.

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［4］ 黃建國，陸建偉.周劑量伊立替康二線治療晚期轉(zhuǎn)移性胃腸癌療效觀察［J］.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2009，22(2): 125－127.