脊髓損傷后大鼠行為學(xué)改變及早期腓腸肌的變化

宋偉，蒲放

脊髓損傷后大鼠行為學(xué)改變及早期腓腸肌的變化

宋偉1,2，蒲放3

目的 探索脊髓損傷后大鼠行為學(xué)改變及早期腓腸肌變化。方法108只Wistar大鼠，其中38只為假手術(shù)組(n=38)，其余制作脊髓切除模型，分為損傷組(n=38)和康復(fù)訓(xùn)練組(n=32)。應(yīng)用BBB法評價大鼠脊髓損傷后不同時間點的行為學(xué)變化；通過免疫組織化學(xué)法觀察腓腸肌的變化。結(jié)果康復(fù)訓(xùn)練組BBB評分從術(shù)后3周開始高于損傷組，但兩組得分始終未超過10分。Dystrophin免疫熒光染色顯示，脊髓損傷后損傷組和康復(fù)訓(xùn)練組腓腸肌肌纖維橫截面積均減小，但康復(fù)訓(xùn)練組萎縮程度較輕。結(jié)論脊髓損傷后大鼠后肢運動功能可出現(xiàn)一定的自發(fā)性恢復(fù)，康復(fù)訓(xùn)練有利于脊髓損傷大鼠運動功能的恢復(fù)，并能減緩后肢肌肉萎縮。

脊髓損傷；康復(fù)訓(xùn)練；肌肉

脊髓損傷是造成癱瘓的主要原因。目前臨床尚無有效的治療辦法。一般認(rèn)為，哺乳動物(包括人在內(nèi))都是通過脊髓中樞模式發(fā)生器(central pattern generator,CPG)[1]控制步行運動，它誘導(dǎo)腿部執(zhí)行左右交替的步態(tài)，其所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)可使脊髓在完全失去下行運動支配和上行感覺傳入的情況下產(chǎn)生一些節(jié)律性運動，如游泳、行走、搔扒等，這些網(wǎng)絡(luò)的功能同時也可受上級中樞的支配及感覺傳入的調(diào)節(jié)，由于CPG網(wǎng)絡(luò)的邊界是靈活的，脊髓損傷后脊髓步行CPG可實現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)重組。研究顯示，減重步行平板訓(xùn)練(BWSTT)可使脊髓橫斷面完全恢復(fù)后肢步行能力。臨床也發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷患者可通過BWSTT提高步行能力，表明脊髓可能具有運動學(xué)習(xí)的能力[2]?？祻?fù)訓(xùn)練可以使CPG得到更好地引發(fā)和加強，進(jìn)而使脊髓損傷患者或模型動物運動功能得到更大程度的恢復(fù)。

本實驗旨在通過制作大鼠切割型脊髓損傷模型，在術(shù)后對切割模型動物進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練的情況下，使用BBB法對不同時間點大鼠的行為學(xué)變化進(jìn)行評價，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，研究大鼠脊髓損傷及康復(fù)訓(xùn)練后肌肉組織的病理變化，并對脊髓損傷及被動康復(fù)訓(xùn)練后早期肌肉組織的反應(yīng)性變化進(jìn)行分析，擬為脊髓損傷后的康復(fù)訓(xùn)練提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 Wistar成年大鼠108只，雌性，體重230～250 g，SPF級，首都醫(yī)科大學(xué)動物科學(xué)部提供。

1.2 方法

1.2.1 脊髓損傷模型制備 室溫條件下，6%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉(30 mg/kg體重)，常規(guī)備皮，固定于鼠板，外科消毒，鋪無菌巾；沿背正中線切開背部皮膚，銳性分離筋膜、椎旁肌肉，咬除T7椎板，暴露T9脊髓節(jié)段，在手術(shù)顯微鏡下，沿脊髓后正中線剪開硬脊膜，并固定在臨近肌肉組織上，使用顯微外科剪將一段長約3 mm脊髓全部切除，然后用吸引器于軟膜下吸斷未橫斷的脊髓組織，確認(rèn)此段無組織殘留[4]。

1.2.2 假手術(shù)組 同法暴露T9段脊髓而不造成脊髓損傷。

1.2.3 實驗動物分組 假手術(shù)組(n=38)，模型動物分為損傷組(n=38)和康復(fù)訓(xùn)練組(n=32)。

1.2.4 實驗動物存活時間 1周、2周、4周、8周、10周、20周、30周、50周。

1.2.5 脊髓損傷大鼠BBB開放空間運動評分法 實驗大鼠經(jīng)造模后每周采用雙人雙盲法進(jìn)行后肢行為學(xué)評價，將動物放置于直徑為2 m的圓形平臺上，觀察記錄其后肢的行走及肢體活動。評分包括三部分：第一部分為0～7分，評判動物后肢各關(guān)節(jié)運動及活動度；第二部分為8～13分，評判后肢的步態(tài)及前后肢協(xié)調(diào)功能；第三部分為14～21分，評判運動中足、趾及尾巴的精細(xì)動作，3項滿分為21分[3]。

1.2.6 康復(fù)訓(xùn)練

1.2.6.1 急性不穩(wěn)定期(術(shù)后2～4周) 為防止脊柱損傷后穩(wěn)定性被破壞，以基本護理為主：①每天人工排尿4次；②下肢被動活動(關(guān)節(jié)活動度運動和肌肉按摩訓(xùn)練)：每次5 min，每周5次。

1.2.6.2 急性穩(wěn)定期(術(shù)后5～8周) 脊柱穩(wěn)定性已恢復(fù)，損傷水平和程度基本確定：①下肢被動活動(同上)；②傾斜柵格爬行訓(xùn)練：每次5 min，每周5次；③滾筒式轉(zhuǎn)籠：每次5 min，每周5次；④感覺刺激：使用針灸針扎大鼠后肢或尾部，配合柵格爬行訓(xùn)練。

1.2.7 Dystrophin免疫熒光染色 將各組動物分別于手術(shù)后1周、2周、4周、8周進(jìn)行心臟灌殺固定，取脊髓損傷術(shù)后1周、2周、4周、8周大鼠的后肢腓腸肌，橫行連續(xù)冰凍切片，切片厚度：10 μm。使用0.1 M PBST浸洗切片2次，每次10 min；1N鹽酸修復(fù)抗原，室溫30 min；0.1 M PBST浸洗3遍，共10 min；4%H2O2清除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫15 min；0.1 M PBST浸洗切片3次，共10 min；5%山羊血清室溫孵育30 min，封閉非特異性抗原；小鼠來源抗大鼠Dystrophin單克隆抗體(1∶1000)，4℃，過夜；0.1 M PBS浸洗3遍，每次10 min；FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶200)；室溫孵育2 h；0.1 M PBS浸洗3遍，每次10 min；30%甘油PB封片，熒光顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 熒光顯微鏡下觀察并照相，應(yīng)用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行各組動物肌纖維橫截面積測量，SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗，相同時間點的組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分比較 評分采用雙人雙盲法對大鼠左右后肢分別進(jìn)行評價，然后取其均值。圖1顯示，損傷組和康復(fù)訓(xùn)練組大鼠仍存在后肢運動功能的自發(fā)性恢復(fù)，康復(fù)訓(xùn)練組大鼠BBB評分從術(shù)后3周開始高于損傷組，但兩組得分始終未超過10分，尚不能達(dá)到頻繁或持續(xù)負(fù)重的步行能力。

圖1 各組大鼠各時間點BBB評分比較

2.2 術(shù)后不同時間大鼠后肢腓腸肌肌纖維直徑變化

正常大鼠腓腸肌橫截面Dystrophin免疫熒光染色并用Heochst33342復(fù)染肌細(xì)胞核。熒光顯微鏡下顯示，腓腸肌肌纖維橫截面形態(tài)規(guī)則，肌細(xì)胞核緊貼于肌纖維的邊緣。損傷組肌纖維橫截面積顯著減小，康復(fù)訓(xùn)練組隨時間的延長也有不同程度的萎縮，但程度較輕。

應(yīng)用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)測量大鼠肌纖維橫截面積，發(fā)現(xiàn)損傷組術(shù)后1周肌纖維橫截面積開始減小，與正常時相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)；術(shù)后2周和4周，兩組肌纖維橫截面積繼續(xù)下降，且損傷組下降更為明顯，4周時損傷組與假手術(shù)組、康復(fù)訓(xùn)練組相比均有顯著性差異(P＜0.01)；術(shù)后10周康復(fù)訓(xùn)練組與假手術(shù)組相比橫截面積也發(fā)生明顯減少，且有顯著性差異(P＜0.01)。見圖2。

圖2 大鼠術(shù)后不同時間各組后肢腓腸肌肌纖維橫截面積比較

3 討論

通過行為學(xué)評價發(fā)現(xiàn)，由于CPG的存在，在大鼠胸髓完全橫斷未接受任何干預(yù)措施的情況下，仍存在后肢運動功能的自發(fā)性恢復(fù)，損傷組大鼠經(jīng)組織學(xué)觀察也表明其損傷處主要為瘢痕組織，無軸索結(jié)構(gòu)，雖然鍍銀染色和NF免疫組化染色表明有神經(jīng)纖維存在，但零星且結(jié)構(gòu)散亂，并無傳導(dǎo)功能。進(jìn)而表明，脊髓完全橫斷后的后肢運動功能恢復(fù)是損傷遠(yuǎn)段脊髓的自主功能所致，與損傷處是否有功能性修復(fù)或殘留纖維代償無關(guān)。

脊髓損傷后骨骼肌因為神經(jīng)營養(yǎng)作用的喪失及自身廢用而發(fā)生萎縮，并伴有結(jié)締組織的增生，這種改變將隨時間的延長而呈現(xiàn)進(jìn)行性加重，Dystrophin是一巨大桿狀蛋白(427 kDa)，位于骨胳肌與心肌細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面，其功能由4個結(jié)構(gòu)區(qū)域?qū)崿F(xiàn)，包括N端區(qū)、中央桿狀區(qū)、C端的Cysteine-rich(CR)區(qū)及C端區(qū)；它由Dystrophin相關(guān)蛋白(Dystrophin-associated protein,DAP)復(fù)合物錨定在胞膜上；中間桿狀區(qū)由24個桿狀重復(fù)和4個絞鏈區(qū)組成[5]?？缒そY(jié)構(gòu)Dystrophin起著穩(wěn)定肌細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架作用。通過對腓腸肌橫截面進(jìn)行Dystrophin免疫熒光染色可顯示腓腸肌的肌纖維膜。我們發(fā)現(xiàn)，正常腓腸肌肌纖維橫截面積較大，形態(tài)規(guī)則，肌細(xì)胞核緊貼于肌纖維的邊緣；損傷組肌纖維橫截面積顯著減小，康復(fù)訓(xùn)練組隨時間的延長也有不同程度的萎縮，但程度相對較輕。

本研究結(jié)果顯示，大鼠脊髓損傷后由于CPG的存在，后肢運動功能可出現(xiàn)一定的自發(fā)性恢復(fù)?？祻?fù)訓(xùn)練有助于脊髓損傷大鼠行為學(xué)的恢復(fù)，并能減緩后肢腓腸肌萎縮程度。

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[5]Pearson KG.Common principles of motor control in vertebrates and invertebrates[J].Ann Rev Neurosci,1993,16:265-297.

Change of Ethology and Gastronomies of Rats after Spinal Cord Injury

SONG Wei,PU Fang.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China

ObjectiveTo explore the alteration in ethology and change of muscle fibers of gastronomies of rats following spinal cord injury(SCI).Methods108 Wistar rats were divided into sham operation group(n=38)and SCI group(n=38)and rehabilitation group(n=32).The ethology was evaluated by Basso,Beattie,and Bresnahan Locomotor Rating Scale(BBB Scale),and the alteration of muscle tissue's reactivity was observed by immunohistochemistry staining.ResultsThe BBB scores of rehabilitation group were higher than SCI group 3 weeks after injury,but all was lower than 10.The cross section areas of gastrocnemius in both groups were getting smaller,but the rehabilitation group was slighter.ConclusionSpontaneous recovery occurred in some degree for rats'hind limb after spinal cord injury.Rehabilitation training is beneficial for the recovery of rats'motor function,and alleviates the atrophy of hind limb after spinal cord injury.

spinal cord injury;rehabilitation training;muscle

[本文著錄格式]宋偉，蒲放.脊髓損傷后大鼠行為學(xué)改變及早期腓腸肌的變化[J].中國康復(fù)理論與實踐,2012,18(6):548-550.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.06.014

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；2.中國康復(fù)研究中心康復(fù)工程研究所，北京市100068；3.北京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京市100191。作者簡介：宋偉(1963-)，女，吉林四平市人，高級工程師，主要研究方向：生物醫(yī)學(xué)工程、康復(fù)工程。

R651.2

A

1006-9771(2012)06-0548-03

2011-08-04)

·臨床研究·