中藥補腎方對心力衰竭大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和琥珀酸脫氫酶的作用研究①

史文靜，周華，戎靖楓，苑春元

中藥補腎方對心力衰竭大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和琥珀酸脫氫酶的作用研究①

史文靜，周華，戎靖楓，苑春元

目的 研究補腎方對心力衰竭大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和琥珀酸脫氫酶(SDH)的作用。方法60只大鼠隨機分為模型組、假手術組、曲美他嗪組、補腎低、中、高劑量組，每組10只。采用結扎冠狀動脈前降支法制備心力衰竭大鼠模型，術后2周開始灌胃，分別給予藥物干預8周。8周后通過頸動脈插管記錄大鼠血流動力學改變，包括左室收縮壓(LVSP)、左室舒張壓(LVEDP)、左室內壓上升下降最大速率(±LVdp/dtmax)；采用分光光度計檢測心力衰竭大鼠心肌Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶以及SDH水平。結果模型組大鼠心肌LVSP和+LVdp/dtmax較假手術組明顯降低(P＜0.01)，而LVEDP和-LVdp/dtmax明顯升高(P＜0.05)；補腎方干預后，中、高劑量大鼠心肌收縮、舒張功能明顯優(yōu)于模型組(P＜0.01)，以高劑量補腎方改善心力衰竭大鼠心功能明顯。補腎方干預后，Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力高于模型組，但低于假手術組，且隨補腎方劑量增加，Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力逐漸增強。結論補腎方可改善心力衰竭大鼠的心功能，可能與Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶以及SDH活力增強相關。

補腎方；血流動力學；Na+-K+ATP酶；Ca2+-Mg2+ATP酶；琥珀酸脫氫酶；心力衰竭；大鼠

心力衰竭是一種臨床綜合征，絕大多數情況下是指心肌收縮能力下降，組織、器官灌注不足，導致肺循環(huán)和(或)體循環(huán)淤血的臨床表現。目前，現代醫(yī)學雖已提出減輕容量負荷、抗心肌重構以及降低心肌氧耗等為基石的標準化治療方案，但心力衰竭患者的生存率仍較低，5年生存率接近于惡性腫瘤。而中醫(yī)藥治療心力衰竭有其特點和優(yōu)勢，值得進一步研究。在臨床實踐中我們發(fā)現補腎方(鹿角片、仙靈脾、生黃芪、黨參)可以改善心力衰竭患者臨床癥狀。本研究旨在探討補腎方對心力衰竭大鼠的作用。

1 材料與儀器

1.1 動物分組 清潔級雄性SD大鼠60只，體重250～300 g，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(滬)2008-0016。動物喂養(yǎng)標準合成飼料，實驗前適應性飼養(yǎng)7 d。隨機分為：假手術組，模型組，曲美他嗪組，補腎高、中、低劑量組。每組10只。

1.2 藥品和試劑

1.2.1 藥品 溫補腎陽方(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院制劑室提供)為鹿角片、仙靈脾、生黃芪、黨參，按 12∶15∶30∶30 組方，將 13.05 kg 生藥水煎兩次，每次1 h，再加10倍量水混勻，藥液過100目不銹鋼篩，90℃濃縮為凈重8.1 kg、相對密度為1.226浸膏。曲美他嗪(片劑)(施維雅制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20055465)，過100目篩后置于雙蒸水，制成1 mg/ml濃度的曲美他嗪混懸液。

1.2.2 試劑 大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶檢測試劑盒：南京建成科技有限公司，產品批號：2011126；SDH測試劑盒：南京建成科技有限公司，產品批號：20111229。

1.3 儀器 電子天平：METTLER TOLEDO公司；勻漿機：IKA公司；PowerLab 8/30生物信號處理和分析系統：ADinstruments公司；Agilent 1200 Series HPLC：Agilent公司；IKA-werkeTyp VX2E震蕩器：IKA公司；Direct-Q3純水系統：Millipore公司；分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 模型制備 冠狀動脈前降支結扎術略加改進制備心力衰竭大鼠模型[1]。具體步驟如下：取清潔級雄性SD大鼠，術前常規(guī)禁食禁水12 h，置于浸有乙醚棉球的密閉容器內麻醉，仰臥位固定在手術臺上，暴露胸部手術視野區(qū)，常規(guī)消毒，于心間搏動最強處稍上(第4、5肋間)與胸骨平行處作一長約2～3 cm的橫向切口，鈍性分離胸大肌(術中可能存在大鼠因乙醚揮發(fā)而清醒，予吸入少量乙醚)，左手持鈍頭剪緊靠胸骨左緣插入肋間肌，同時擴大胸腔切口，暴露心臟，剪開心包膜，雙手擠壓胸部，使心臟自行跳出胸腔外，迅速于左冠狀動脈前降支起始點下約2 mm處結扎，以鈍性剪刀擴大胸腔切口，使心臟回復至胸腔，隨即縫合皮膚。術后以標準導聯Ⅱ(紙速50 mm/s)心電圖ST段弓背抬高為急性心肌梗死形成。假手術組不結扎冠脈，余操作同前。各組于10周時測定大鼠血流動力學，并開胸留取心肌組織于-80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 給藥方法 術后2周開始灌胃，以假手術組為空白對照組，曲美他嗪為陽性藥物對照組，分別予藥物干預8周。模型組、假手術組：蒸餾水1.0 ml/kg?d灌胃；曲美他嗪組：曲美他嗪混懸液1.0 mg/kg?d灌胃；補腎高劑量組17.4 g/kg?d；補腎中劑量組8.7 g/kg?d；補腎低劑量組4.4 g/kg?d。

2.3 血流動力學測定 灌胃結束后大鼠禁食禁水24 h，術前稱取大鼠體重，以肝素鈉(1200 U/kg)抗凝30 min，用25%烏拉坦(2.0 mg/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于大鼠手術臺上，分離右側頸總動脈，插入鏈接壓力換能器的PE250型聚乙烯心導管，穩(wěn)定5 min后插入左心室，通過PowerLab8/30型生物信號處理和分析系統記錄大鼠左室收縮壓(LVSP)、左室舒張壓(LVEDP)以及左室內壓最大上升下降速率(±LVdp/dtmax)等參數。

2.4 大鼠心肌ATP酶測定 大鼠心肌ATP酶測定包括Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶。左室重量稱取后取非梗死區(qū)心肌100 mg，-80℃保存。應用分光光度計分別測定心肌中Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活力值，嚴格按說明書操作。

2.5 大鼠心肌SDH測定 左室重量稱取后取非梗死區(qū)心肌100 mg，-80℃保存。應用分光光度計分別測定心肌中SDH活力值，嚴格按說明書操作。

2.6 統計學分析 采用SPSS 19.0分析軟件，組間比較采用ANOVA分析，顯著性水平α=0.05。

3 結果

假手術組于造模后7 d死亡1只；曲美他嗪組于2周后死亡1只，補腎中、高劑量組各死亡1只，故進入后續(xù)實驗的大鼠為56只。

3.1 血流動力學 模型組大鼠心肌LVSP和+LVdp/dtmax明顯低于假手術組(P＜0.01)，而LVEDP和-LVdp/dtmax明顯高于假手術組(P＜0.01)；中、高劑量大鼠心肌收縮、舒張功能明顯優(yōu)于模型組(P＜0.01)，以高劑量補腎方改善心力衰竭大鼠心功能明顯。補腎高劑量組LVSP、LVEDP和±LVdp/dtmax與中、低劑量組有顯著性差異(P＜0.05)。補腎中劑量組LVSP與低劑量有顯著性差異(P＜0.05)，而 LVEDP、±LVdp/dtmax無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 補腎方對心力衰竭大鼠血流動力學的影響

3.2 Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力 大鼠心肌的Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力值，在補腎高、中、低劑量組以及假手術組明顯高于模型組(P＜0.01)，補腎高、中、低劑量組則低于假手術組(P＜0.05)；曲美他嗪組明顯高于補腎低劑量組(P＜0.01)，而與高劑量無統計學差異(P＞0.05)；補腎高劑量組明顯高于中、低劑量組(P＜0.01)，中劑量明顯高于低劑量組(P＜0.01)。見表2。

表2 補腎方對心力衰竭大鼠心肌Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和SDH活力的影響

4 討論

本課題自擬補腎方，研究“補腎以治心”中藥方的作用。方中鹿角溫補肝腎、補益精血，臨床研究顯示，鹿角方改善冠脈血流，增加心肌收縮力，改善心功能[2]；仙靈脾溫腎壯陽，可增加冠脈血流，降低缺血心肌損傷，抑制脂肪酸代謝[3-5]，改善心功能；黃芪為補氣之要藥，有強心、改善心肌重構的作用[6-9]，還可降低心肌以及心肌線粒體氧自由基水平、拮抗心肌再灌注損傷、減輕線粒體鈣超載，從而保護心肌、改善心肌收縮功能；黨參益氣養(yǎng)血，補而不燥，在本方中含“陰中求陽”之意，有強心、改善心肌能量代謝的作用[10-11]。本方諸藥強調心腎相交、心本乎腎，以溫腎求強心。

血流動力學是評估藥物干預對心血管作用的常用方法。LVSP是收縮期左心室壓力的最大值，一定程度上反映心肌收縮力；+LVdp/dtmax反映心肌收縮成分的縮短最大速度，反應心肌收縮性能；-LVdp/dtmax反映心肌舒張時心肌纖維延長的最大速度，是評價心室舒張功能的指標之一；LVEDP是臨床上常用來估計左室前負荷，可間接反映左室功能。本實驗中，模型組大鼠心肌LVSP和+LVdp/dtmax較假手術組明顯降低，而LVEDP和-LVdp/dtmax明顯升高，提示冠脈結扎術后大鼠心肌收縮、舒張功能明顯下降，表明冠脈結扎后心力衰竭模型制備成功。補腎方干預后，中高劑量大鼠心肌收縮、舒張功能接近假手術組和曲美他嗪組大鼠，以高劑量改善心力衰竭大鼠心功能明顯。由此，補腎方可以改善心力衰竭大鼠心肌收縮、舒張功能，且隨劑量升高，作用逐漸增強。

細胞質中Ca2+濃度的變化是心肌收縮、舒張的決定因素。正常情況下，Ca2+通過于肌質網釋放和細胞外流入細胞內，引起心肌收縮；Ca2+通過肌質網、Na+-Ca2+交換體(Na+-Ca2+exchanger,NCX)和肌膜上Ca2+-Mg2+ATP酶攝取，引起心肌舒張。因此，任何引起Ca2+濃度波動的因素必然會引起心肌收縮、舒張的變化。心力衰竭時，由于Ca2+轉運、釋放、攝取功能障礙，導致心肌細胞收縮和舒張功能失常，加重心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，而影響Ca2+濃度的因素包括多種酶、離子通道以及線粒體調節(jié)。研究表明[12-13]，心肌細胞中Na+-K+ATP酶、Ca2+-ATP酶和NCX的含量和活性是維持細胞內Ca2+濃度穩(wěn)定的決定性因素。而NCX主要通過Na+-K+ATP酶以及膜電位形成的電-化學梯度驅動，因此本實驗研究Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶的表達水平。補腎方干預后，Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活力高于模型組，但低于假手術組，而高劑量與曲美他嗪大鼠間無明顯差異，且隨補腎方劑量增加，Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活力逐漸增強。由此，補腎方可通過增加肌漿網中Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶表達水平，改善心力衰竭大鼠心肌收縮、舒張功能，提示“補腎以治心”法可以改善心力衰竭大鼠心功能。

SDH是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，是線粒體的一種標志酶。作為參與三羧酸循環(huán)的關鍵酶，SDH是反映線粒體功能的標志酶之一，其活性是三羧酸循環(huán)運行的評價指標。心力衰竭時，SDH活性受抑制，氧化磷酸化電子傳遞功能障礙，氧化過程受阻，能量無法轉化成ATP為心臟所利用，影響心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展和轉歸。有學者通過心復康口服液對心梗后心衰大鼠的實驗研究指出，“益氣溫陽、活血化瘀”法能提高線粒體呼吸酶復合物活性，尤以琥珀酸脫氫酶、細胞色素C氧化酶最為明顯[14-15]。本實驗中，補腎陽方干預后，SDH活力明顯高于模型組，但低于假手術組，中、高劑量心力衰竭大鼠心肌SDH活力優(yōu)于曲美他嗪，而隨劑量增加，補腎方改善心力衰竭大鼠SDH活力作用越顯著?？梢?，“補腎以治心”法可增加SDH活力，改善心力衰竭大鼠心功能。

綜上可見，補腎方改善心力衰竭大鼠心功能的作用可能與增加肌漿網中Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶表達水平，改善SDH活力，從而提高線粒體功能，促進ATP合成相關。

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Effect of Bushen Decoction on Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and Succinate Dehydrogenase in Rats with Heart Failure

SHI Wen-jing,ZHOU Hua,RONG Jing-feng,et al.Department of Cardiology of Shuguang Hospital,Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

ObjectiveTo explore the effect of Bushen decoction on Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and succinate dehydrogenase(SDH)in rats with heart failure.Methods60 heart failure rats were established by ligating left anterial descending coronary artery.They were randomly divided into model group,sham operation group,trimetazidine group,Bushen low-dose group,Bushen middle-dose group and Bushen high-dose group with 10 rats in each group.They were gavaged 2 weeks after modeling for 8 weeks,hemodynamic changes including left ventricular systolic pressure(LVSP),left ventricular diastolic pressure(LVEDP),and the maximum rate left ventricular pressure rised or decreased(±LVdp/dtmax)were recorded as well as the level of Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and SDH through the spectrophotometer.ResultsCompared with the sham operation group,the LVSP and+LVdp/dtmaxof rats in model group decreased(P＜0.05),LVEDP and-LVdp/dtmaxincreased(P＜0.05).After Bushen intervention,contractility and diastolic function of myocardial of rats in middle and high dose group were better than model group(P＜0.01),especially in high dose group.Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and SDH activity were higher in Bushen groups than the model group,but lower than the sham operation group.With the increase of the doses,Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and SDH activity gradually increased.ConclusionBushen decoction can improve the cardiac function of rats with heart failure that may be associated with Na+-K+ATPase,Ca2+-Mg2+ATPase and SDH activity.

Bushen decoction;hemodynamics;Na+-K+ATPase;Ca2+-Mg2+ATPase;succinate dehydrogenase;heart failure;rats

[本文著錄格式]史文靜，周華，戎靖楓，等.中藥補腎方對心力衰竭大鼠Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶和琥珀酸脫氫酶的作用研究[J].中國康復理論與實踐,2012,18(6):544-547.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.06.013

上海市教委創(chuàng)新項目(11ZZ111)。

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院心內科，上海市201203。作者簡介：史文靜(1984-)，女，河南武陟縣人，碩士研究生，主要研究方向：中西醫(yī)結合防治心血管疾病。通訊作者：周華。

R541.6

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1006-9771(2012)06-0544-04

2012-04-12

2012-04-25)