堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)人椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)合成及軟骨調(diào)節(jié)素表達(dá)的影響①

李想，王以朋，洪毅，唐和虎，張軍衛(wèi)，白金柱，姜樹(shù)東，王方永

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)人椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)合成及軟骨調(diào)節(jié)素表達(dá)的影響①

李想1,2，王以朋3，洪毅1,2，唐和虎1,2，張軍衛(wèi)1,2，白金柱1,2，姜樹(shù)東1,2，王方永1,2

目的 研究堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)對(duì)人椎間盤(pán)細(xì)胞基質(zhì)合成能力以及血管生長(zhǎng)抑制因子軟骨調(diào)節(jié)素-1(ChM-1)表達(dá)的影響，為椎間盤(pán)退變的生物學(xué)治療提供可供參考的生長(zhǎng)因子。方法取4例因腰椎間盤(pán)退變性疾病而于本院行腰椎間盤(pán)切除手術(shù)患者的椎間盤(pán)組織，分別進(jìn)行髓核和纖維環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)及表型鑒定。取傳代細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)1周后，向培養(yǎng)基中加入不同濃度的bFGF(0,0.1 ng/ml,1 ng/ml和10 ng/ml)，72 h后收集細(xì)胞。采用Real-time RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)情況；同時(shí)利用Real-time RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)bFGF對(duì)ChM-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果bFGF可明顯抑制人椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)成分Aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)(P＜0.05)。Real-time RT-PCR和Western blot方法均提示bFGF可抑制ChM-1的表達(dá)水平(P＜0.05)，并具有劑量依賴性。結(jié)論bFGF在發(fā)揮分解代謝功能的同時(shí)還具有潛在的促進(jìn)血管生長(zhǎng)作用。

椎間盤(pán)；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；軟骨調(diào)節(jié)素；退變；人

椎間盤(pán)退變的生物學(xué)機(jī)制較為復(fù)雜，一般認(rèn)為椎間盤(pán)細(xì)胞活性的改變以及血管的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)在椎間盤(pán)退變的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。生物學(xué)治療被認(rèn)為是最有可能恢復(fù)椎間盤(pán)組織生物學(xué)功能的方法[2]。局部生長(zhǎng)因子注射是近年來(lái)生物學(xué)治療取得的最重要的進(jìn)展。但如何選擇合適的生長(zhǎng)因子一直是有待解決的重要問(wèn)題[2]。本研究擬通過(guò)觀察堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)對(duì)人椎間盤(pán)細(xì)胞基質(zhì)合成能力以及血管生長(zhǎng)抑制因子軟骨調(diào)節(jié)素-1(ChM-1)表達(dá)的影響，為椎間盤(pán)退變的生物學(xué)治療提供可供參考的生長(zhǎng)因子。

1 材料和方法

1.1 試劑及設(shè)備 5%FBS：GIBCO，美國(guó)；1×P/S：GIBCO，美國(guó)；DMEM/F12培養(yǎng)基：四環(huán)陽(yáng)生，北京；Ⅱ型膠原酶：SIGMA，美國(guó)；5%CO2培養(yǎng)箱：Thermo，美國(guó)；Ⅱ型膠原抗體：兔抗人多克隆抗體，武漢博士德公司；bFGF：PeproTech，美國(guó)；TRIzol： Invitrogen， 美 國(guó) ； TaKaRa SYBR?Premix Ex Taq? II(Perfect Real Time)試劑盒(日本)；ChM-1一抗：ABCOM，鼠抗人LECT-1，美國(guó)；微量加樣器：Eppendorf德國(guó)；定量PCR儀：ABI7500，美國(guó)。

1.2 細(xì)胞準(zhǔn)備及培養(yǎng) 腰椎間盤(pán)取材于4例因腰椎間盤(pán)退變性疾病而在本院脊柱外科行椎間盤(pán)切除手術(shù)的患者，患者30～57歲，平均45歲，術(shù)前均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。細(xì)胞培養(yǎng)按Kluba等[3]的方法，具體如下：

椎間盤(pán)切除后放入裝有生理鹽水的無(wú)菌離心管中，冰盒內(nèi)保存，立即帶回實(shí)驗(yàn)室。在嚴(yán)格無(wú)菌條件下將椎間盤(pán)組織中的膠凍樣結(jié)構(gòu)與纖維樣結(jié)構(gòu)分開(kāi)，利用Hank's液清洗3遍。分別將髓核和纖維環(huán)組織剪成約1 mm3小塊后轉(zhuǎn)移到50 ml離心管中。在離心管中加入含1×P/S、5%FBS、Ⅱ型膠原酶(消化髓核組織的濃度為0.025%，消化纖維環(huán)的濃度為0.04%)的DMEM/F12培養(yǎng)基50 ml，于37℃振蕩消化過(guò)夜。消化后的液體經(jīng)75 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，除去組織殘?jiān)＿^(guò)濾后的液體以1000 r/min的速度離心5 min，棄上清，加入含1×P/S、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打均勻后以5×103/cm2的密度將細(xì)胞轉(zhuǎn)到25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning)中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。纖維環(huán)細(xì)胞約3 d可大部分貼壁，髓核細(xì)胞需5 d方可大部分貼壁。貼壁后每周換液2次。

1.3 椎間盤(pán)細(xì)胞表型鑒定 將細(xì)胞制成細(xì)胞爬片，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)將細(xì)胞爬片取出，4%多聚甲醛室溫固定20 min，漂洗后用3%雙氧水室溫30

m

in以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；每片滴加正常山羊封閉血清30 μl，37℃孵育30 min；滴加Ⅱ型膠原多克隆抗體(1∶100)4℃過(guò)夜；PBS沖洗后滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育20 min；PBS沖洗后滴加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉素，室溫孵育20 min；PBS沖洗5 min，共3次，顯色劑(DAB)顯色，自來(lái)水沖洗，37℃烘干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。鏡下觀察染色結(jié)果。

1.4 bFGF對(duì)椎間盤(pán)髓核細(xì)胞及纖維環(huán)細(xì)胞的刺激 在細(xì)胞初次培養(yǎng)2周后，利用0.25%的胰酶將細(xì)胞自25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中消化下來(lái)，以低密度轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中，每孔加入含1×P/S、10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合(約1周時(shí)間)后用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后分成2組：對(duì)照組1孔，實(shí)驗(yàn)組3孔。對(duì)照組僅加入含0.5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組3孔除加入上述培養(yǎng)液外還分別加入不同濃度(0.1 ng/ml,1 ng/ml和10 ng/ml)的bFGF進(jìn)行刺激。72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.5 Real-Time RT-PCR檢測(cè) RT-PCR檢測(cè)基質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。按照TRIzol說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。采用TaKaRa SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒，構(gòu)建25 μl PCR反應(yīng)體系，參照說(shuō)明書(shū)推薦的反應(yīng)條件，進(jìn)行兩步法Real-time PCR檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參。具體為：94℃5 min預(yù)變性，94℃30 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，降溫至4℃，用于瓊脂糖電泳或-20℃保存。見(jiàn)表1。Real-Time RT-PCR結(jié)果分析采用2ΔΔCT相對(duì)定量分析方法。最終結(jié)果表示為相對(duì)于對(duì)照組(其表達(dá)量作為100%)表達(dá)水平的百分比，即實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于對(duì)照組目的基因的表達(dá)倍數(shù)。

表1 引物序列

1.6 Western blot 用細(xì)胞裂解液溶解(2%SDS,2 mmol/L EDTA,2 mmol/L phenylmethylsulphony,50 mmol/L Tris-HCl,pH 6.8)處理細(xì)胞，使用改進(jìn)的Lowry法測(cè)定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后煮沸4 min，取50 μg蛋白樣品在含0.1%SDS的13%聚丙烯酰胺膠中進(jìn)行電

泳

，將樣品通過(guò)電轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，膜用含5%低脂奶粉的TBS-Tween溶液洗滌封閉，加入ChM-1一抗(1∶50)，加入HRP偶聯(lián)的二抗(Santa Cruz Biotechnology)，曝光，保存。用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算條帶的灰度×面積值。各組ChM-1條帶值同相應(yīng)的β-actin條帶值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，各組間先進(jìn)行方差齊性分析，符合方差齊性后再采用t檢驗(yàn)

進(jìn)行兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

圖1 椎間盤(pán)細(xì)胞體外培養(yǎng)及表型鑒定

2.1 椎間盤(pán)細(xì)胞體外培養(yǎng)及表型鑒定 鏡下見(jiàn)細(xì)胞主要呈現(xiàn)兩種表現(xiàn)，多角形和梭形。其中髓核細(xì)胞以多角形多見(jiàn)，而纖維環(huán)細(xì)胞以梭形多見(jiàn)，但兩組細(xì)胞在整體上形態(tài)差別不大。Ⅱ型膠原免疫染色結(jié)果顯示，髓核和纖維環(huán)細(xì)胞均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，胞漿呈棕黃色，胞核藍(lán)色，髓核細(xì)胞較纖維環(huán)細(xì)胞染色稍深，但兩者在整體上差別不大。見(jiàn)圖1。

2.2 bFGF對(duì)Aggrecan、ChM-1和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)水平的影響 bFGF作用于椎間盤(pán)細(xì)胞可使細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的空泡樣改變，這種變化在高濃度bFGF中表現(xiàn)尤為明顯。說(shuō)明高濃度bFGF可使細(xì)胞出現(xiàn)明顯空泡樣改變。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度bFGF刺激后的椎間盤(pán)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(100×)

Real-Time RT-PCR結(jié)果顯示，在利用不同濃度的bFGF作用于椎間盤(pán)細(xì)胞后可明顯下調(diào)Aggrecan、ChM-1和Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，且具有濃度依賴性。見(jiàn)表2。

2.3 bFGF對(duì)ChM-1蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果顯示，各組細(xì)胞內(nèi)均可發(fā)現(xiàn)ChM-1蛋白表達(dá)。在利用不同濃度的bFGF作用于椎間盤(pán)細(xì)胞后可明顯下調(diào)椎間盤(pán)細(xì)胞中ChM-1蛋白表達(dá)水平，且具有濃度依賴性(P＜0.05)。見(jiàn)圖3和表3。

圖3 bFGF對(duì)ChM-1蛋白表達(dá)影響的Western blot結(jié)果

表2 不同濃度bFGF對(duì)椎間盤(pán)基質(zhì)相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)影響的Real-Time RT-PCR結(jié)果

表3 bFGF對(duì)ChM-1蛋白表達(dá)影響的Western blot結(jié)果

3 討論

雖然椎間盤(pán)退變的病理過(guò)程較為復(fù)雜，但一般認(rèn)為椎間盤(pán)細(xì)胞增殖下降以及血管的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)在椎間盤(pán)的病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[1]。

bFGF是一種肝素結(jié)合多肽，廣泛存在于各種組織中。其在軟骨以及椎間盤(pán)退變中所發(fā)揮的作用歷來(lái)受到重視。Tolonen等利用免疫組化方法研究16例椎間盤(pán)源性腰痛患者中各種生長(zhǎng)因子的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常椎間盤(pán)組織相比，bFGF表達(dá)明顯增高，且其主要分布在纖維環(huán)前層軟骨樣細(xì)胞內(nèi)[4]。Peng等通過(guò)對(duì)椎間盤(pán)源性腰痛患者的椎間盤(pán)組織進(jìn)行研究后返現(xiàn)，與正常椎間盤(pán)組織相比，椎間盤(pán)源性腰痛患者椎間盤(pán)組織中可見(jiàn)新生血管肉芽組織子纖維環(huán)外層向髓核組織生長(zhǎng)[5]。在肉芽生長(zhǎng)區(qū)可見(jiàn)大量的巨噬細(xì)胞，并可見(jiàn)bFGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1以及其受體的明顯表達(dá)，而非肉芽生長(zhǎng)區(qū)上述表現(xiàn)并不明顯，提示bFGF和TGF-β1以及其受體以及巨噬細(xì)胞可能參與纖維環(huán)損傷后的組織修復(fù)及繼發(fā)的退變過(guò)程。局部產(chǎn)生的bFGF可刺激血管的生長(zhǎng)和炎癥因子的產(chǎn)生，加速基質(zhì)成分的降解和椎間盤(pán)退變的發(fā)生。Pratsinis等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2可通過(guò)激活ERK和Akt信號(hào)通路刺激椎間盤(pán)細(xì)胞的增殖[6]。Li等研究發(fā)現(xiàn)，與正常椎間盤(pán)組織相比，F(xiàn)GF2及其受體水平在椎間盤(pán)退變后表達(dá)升高，單層培養(yǎng)的髓核細(xì)胞在給予FGF2刺激后可刺激MMP-13 mRNA和蛋白的表達(dá)，具有劑量依賴性[7]。而在三維體系中培養(yǎng)的髓核細(xì)胞在給予FGF2刺激后可下調(diào)蛋白多糖的表達(dá)。進(jìn)一步的研究顯示FGF2可通過(guò)核因子(NF)-κB途徑和有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑上調(diào)noggin，拮抗BMP7引起的蛋白多糖的合成。

本研究也得出了類似的結(jié)果，利用不同濃度的bFGF作用于單層培養(yǎng)的椎間盤(pán)髓核和纖維環(huán)細(xì)胞后可明顯抑制基質(zhì)相關(guān)蛋白Aggrecan和Ⅱ型膠原的合成。Aggrecan是細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖的主要組成成分，具有維持椎間盤(pán)組織含水量，抑制血管、神經(jīng)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的作用[8]。其表達(dá)下降可為血管、神經(jīng)的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)提供的環(huán)境，與患者椎間盤(pán)退變后腰部疼痛癥狀密切相關(guān)。椎間盤(pán)髓核組織中Ⅱ型膠原含量要明顯高于Ⅰ型膠原，其表達(dá)下降可降低髓核組織的生物力學(xué)性能，影響椎間盤(pán)內(nèi)部應(yīng)力的分布，加重椎間盤(pán)退變[9]。由此可見(jiàn)bFGF在椎間盤(pán)退變過(guò)程中主要發(fā)揮抗合成代謝的作用。

除了椎間盤(pán)細(xì)胞活性下降外，血管的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)在椎間盤(pán)退變過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。伴隨著血管的生長(zhǎng)，局部會(huì)產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)，如IL-1、IL-6、TNF-α、CTGF等，加速椎間盤(pán)細(xì)胞的分解代謝，引起基質(zhì)成分降解加速[10]。同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)感覺(jué)神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)具有趨化和引導(dǎo)作用，導(dǎo)致退變后椎間盤(pán)組織內(nèi)神經(jīng)纖維的過(guò)度生長(zhǎng)，與椎間盤(pán)源性腰痛患者的臨床癥狀密切相關(guān)[11]。但也有研究顯示，對(duì)于突出或脫出的椎間盤(pán)，血管的過(guò)度生長(zhǎng)有利于椎間盤(pán)組織的吸收，減輕神經(jīng)根的壓迫[12-13]。

本研究雖未對(duì)bFGF的促血管生長(zhǎng)作用進(jìn)行直接研究，但發(fā)現(xiàn)bFGF可明顯抑制椎間盤(pán)細(xì)胞中ChM-1的表達(dá)。ChM-1是一種Ⅱ型糖蛋白，其主要具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，在維持軟骨、椎間盤(pán)、角膜等無(wú)血管組織的正常生物學(xué)功能方面發(fā)揮重要作用[14]。李想等利用免疫組化方法研究不同退變程度的椎間盤(pán)組織中ChM-1的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ChM-1在椎間盤(pán)退變后表達(dá)明顯升高?？紤]到血管生長(zhǎng)在椎間盤(pán)退變中的作用，推測(cè)ChM-1可能作為一種防御機(jī)制參與了椎間盤(pán)退變的病理過(guò)程[15]。本研究結(jié)果顯示，bFGF可明顯抑制退變椎間盤(pán)細(xì)胞中ChM-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，并具有劑量依賴性。提示bFGF在椎間盤(pán)組織中促進(jìn)血管生長(zhǎng)的作用可能與其抑制ChM-1的表達(dá)有關(guān)。

椎間盤(pán)退變是一種復(fù)雜的病理過(guò)程，參與其中的細(xì)胞因子眾多，同時(shí)細(xì)胞因子之間的作用也是廣泛而復(fù)雜。本研究結(jié)果僅說(shuō)明bFGF和ChM-1之間可能存在某種程度的相互制約，而不能反應(yīng)體內(nèi)細(xì)胞因子間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)環(huán)境下的真實(shí)情況。有關(guān)bFGF在椎間盤(pán)退變中的真正作用還需進(jìn)行更為深入的研究。

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Effect of Basic Fibroblast Growth Factor on Synthesis of Extracellular Matrixc and Expression of Chondromodulin in Human Inter-vertebral Disc Cells

LI Xiang,WANG Yi-peng,HONG Yi,et al.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Department of Spine and Spinal Cord Surgery,Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China

ObjectiveTo investigate the effect of basic fibroblast growth factor(bFGF)on the synthesis of extracellular matrixc(ECM)and expression of chondromodulin in human intervertebral disc cells.Methods4 intervertebral discs(IVDs)obtained from patients in the treatment of disc degenerative disease were used for cell culture.The secondary generation of intervertebral disc cells were cultured for 7 days,then different concentration of bFGF(0,0.1 ng/ml,1 ng/ml,10 ng/ml)were added to the medium and treated for 72 hours.Real-time RT-PCR was used to detect the change of Aggrecan and typeⅡcollagen mRNA expression.The effect of FGF on the expression of ChM-1,a cartilage derived anti-angiogenic factor,was also used by means of Real-time RT-PCR and Western blot.ResultsReal-time RT-PCR showed that bFGF can significantly inhibit the expression of Aggrecan and typeⅡcollagen mRNA.Both Real-time RT-PCR and Western blot showed that the expression of ChM-1 was down-regulated by administration of bFGF with dose-dependent way.ConclusionbFGF serves primarily as a catabolic factor and induce the angiogenesis in the process of intervertebral disc degeneration.

intervertebral disc;basic fibroblast growth factor;chondromodulin;degeneration;human

[本文著錄格式]李想，王以朋，洪毅，等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)人椎間盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)合成及軟骨調(diào)節(jié)素表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(6):539-543.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.06.012

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市100068；2.中國(guó)康復(fù)研究中心北京博愛(ài)醫(yī)院脊柱脊髓外科，北京市100068；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京市100730。作者簡(jiǎn)介：李想(1977-)，男，遼寧葫蘆島市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：脊柱外科、脊柱脊髓損傷。

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1006-9771(2012)06-0539-05

2012-02-27

2012-05-21)

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