骨組織工程研究的新進展：修復(fù)骨缺損的完美技術(shù)

李凱（綜述） 王玉學(xué)（審校）

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科，黑龍江哈爾濱 150081

臨床上由于各種原因?qū)е碌墓侨睋p很常見，然而修復(fù)骨缺損的惟一方法是通過骨移植來實現(xiàn)。傳統(tǒng)的骨移植方法都存在一定的弊端。骨組織工程自20世紀80年代誕生以來為廣大骨缺損患者的治療帶來新的選擇。組織工程骨是一種人工制備的含有活體細胞的骨替代材料，它能形成新的功能性骨組織，可以修復(fù)大塊骨缺損，它還可按需塑形及大量制備，是理想的骨修復(fù)材料。應(yīng)用骨組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損已在在動物實驗和部分臨床研究中獲得較好效果，但是距離組織工程骨在臨床中正式使用尚有一定距離。本文就國內(nèi)外骨組織工程研究的目前狀況作一綜述。

1 骨組織工程種子細胞的研究

成骨細胞作為直接成骨的細胞是骨組織工程中經(jīng)典種子細胞來源。人工骨的最終歸宿是被成骨細胞所形成的自然骨所替代，因而成骨細胞的分離培養(yǎng)、擴增以及功能調(diào)控是骨組織工程研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在人體內(nèi)，成骨細胞分布廣泛，其可以從骨膜、骨小梁以及骨髓中直接分離培養(yǎng)。成骨細胞的主要功能是合成、分泌骨基質(zhì)，促進基質(zhì)礦化并形成骨組織。骨膜來源成骨細胞的特點是體外培養(yǎng)容易成活、分裂增殖能力強，其成骨能力高于骨髓基質(zhì)干細胞和牙槽骨細胞[1]。但是骨膜細胞來源有限，且取材不方便，增添新的創(chuàng)傷，限制了其廣泛應(yīng)用。從胚胎與新生動物顱骨中分離培養(yǎng)亦可得到成骨細胞。傅德皓等[2]通過改良的組織塊培養(yǎng)法可在較短時間內(nèi)獲得大量成骨細胞，所培養(yǎng)的細胞具有典型的成骨細胞形態(tài)和功能。骨組織來源的成骨細胞具有易定向成骨分化的優(yōu)點，但缺點是造成供區(qū)損傷及來源有限。骨髓是由造血系統(tǒng)和基質(zhì)系統(tǒng)兩部分組成，其中具有成骨作用的細胞是骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）。它的優(yōu)點是取材方便，對機體損傷小，體外培養(yǎng)擴增后細胞數(shù)量充足，進行自體移植而不存在免疫排斥問題，目前在臨床中應(yīng)用廣泛，被認為是骨組織工程中較理想的種子細胞[3]。

近年來，國內(nèi)外科學(xué)家在皮膚、脂肪、肌肉等組織內(nèi)和外周血中均分離出具有成骨潛能的成體干細胞，它們在成骨誘導(dǎo)因子的作用下能定向分化為成骨細胞。下面就常見骨外組織來源的成骨細胞作一分述：①外周血單核細胞：實驗證實外周血中含有少量的間充質(zhì)干細胞，且細胞表型與BMSCs相似[4]。利用外周血作為種子細胞來源的優(yōu)點是對供體侵襲小，而且造血系統(tǒng)還可不斷地提供造血細胞。②臍血間充質(zhì)干細胞：臍血中含有大量的造血干細胞，同時還含有豐富的造血基質(zhì)細胞。臍血間充質(zhì)干細胞是造血基質(zhì)細胞的一種，鄭德宇等[5]從人臍血中培養(yǎng)出單個核細胞，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后具有骨細胞特性，且與β-磷酸三鈣具有良好的生物相容性。但是由于其分離培養(yǎng)成功率較低，制約了廣泛應(yīng)用。③脂肪間充質(zhì)干細胞：具有來源廣泛、細胞含量多、易獲取、培養(yǎng)條件簡單且擴增能力強等優(yōu)點。目前體外或體內(nèi)實驗雖然證明了脂肪干細胞的成骨潛力，但其分化成骨效能仍有待進一步提高[6]。盡管如此，隨著研究的進一步深入其仍將可能成為繼BMSCs之后最具前景的骨組織工程種子細胞。④胚胎干細胞：它是由胚胎內(nèi)細胞團或原始生殖細胞分離出來的具有多向分化潛能的細胞系，具有發(fā)育全能性、分裂增殖能力強的特點。Tielens等[7]在可降解大孔微載體上添加了白血病抑制因子后進行小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)，14 d后觀察到細胞仍具有多向分化潛能，將胚胎干細胞在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2周后便可觀察到成骨性分化。從理論上講，胚胎干細胞是骨組織工程中最佳的種子細胞，但是由于獲得細胞不易，運用人胚胎干細胞還涉及到倫理問題，從現(xiàn)階段看，胚胎干細胞應(yīng)用于骨組織工程還不現(xiàn)實。

總的來看，在種子細胞領(lǐng)域，自體體細胞來源的誘導(dǎo)多能干細胞成為目前的研究熱點。從臨床適用的角度看，如何能在盡可能短的時間內(nèi)分離培養(yǎng)出大量純的干細胞，并且成骨誘導(dǎo)后能夠穩(wěn)定表達成骨細胞表型是現(xiàn)階段主要解決的問題。

2 骨組織工程支架材料的研究

傳統(tǒng)的支架材料往往是單一的有機物，或是無機物。這些材料各有優(yōu)缺點，現(xiàn)將具有代表性的支架材料分述如下：①人工合成的有機高分子聚合物主要為α聚酯類，其中以聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）及聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）為代表，優(yōu)點是可降解，容易塑型；但其缺點是強度較差，降解時間不能精確計算。該類材料的研究目前主要集中于材料的改性、表面修飾和復(fù)合其它材料等方面。②膠原是目前常用的天然衍生物，它在組織內(nèi)是細胞附著的支架，并通過介導(dǎo)各種理化刺激來調(diào)節(jié)細胞的分化，對種子細胞的早期黏附、隨后的分化增殖以及發(fā)揮成骨功能都具有促進作用。此種支架材料具有良好的細胞相容性和生物降解性，但其生物強度較低。③甲殼素及其衍生物殼聚糖，是一種資源豐富、生物學(xué)性能優(yōu)良的材料，其活性基團、內(nèi)在抗菌活性和良好的賦形性等特性以及與動物體內(nèi)糖胺多糖相似的結(jié)構(gòu)，使其在骨組織工程支架方面有著重要的研究意義。缺點是機械性能差，溶解性能差，因此有待進一步研究以拓寬其應(yīng)用范圍。④脫鈣骨基質(zhì)來源于骨組織，是一種可降解的抗原滅活的異種或同種異體骨基質(zhì)，具有良好的生物相容性和生物降解性，保留了膠原支架的立體多孔狀結(jié)構(gòu)，附著在膠原上的骨形態(tài)發(fā)生蛋白在骨的形成中具有重要作用。目前已在臨床中有廣泛應(yīng)用。⑤人工合成的無機材料，其中羥基磷灰石、磷酸三鈣（TCP）等材料較為常用，它具有較好的生物強度和骨傳導(dǎo)性，但其塑形難、脆性大、生物降解與組織形成速度不匹配，因而應(yīng)用受到了一定的限制。通過以上敘述可以看出，單一材料都存在各自的缺陷。因此，發(fā)揮不同材料的優(yōu)勢，彌補單一材料的不足，研究制造各種復(fù)合材料勢在必行。Saito等[8]制備的熱敏感的聚乳酸-聚乙烯/人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白聚合物在較高溫度下是液體，注射到體內(nèi)后該液態(tài)復(fù)合物會隨著體溫逐漸冷卻而變成半固體狀，可以作為骨形成的支架材料，并且在局部可逐漸釋放人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白。這種可注射支架材料修復(fù)骨缺損，具有組織損傷小、操作簡便、手術(shù)并發(fā)癥少等優(yōu)點，具有良好的應(yīng)用前景。劉浩懷等[9]研制出具有藥物緩釋功能的骨組織工程支架，該載藥微球支架具有良好的藥物緩釋功能和抑菌性能，是一種集骨修復(fù)和治療于一體的新型組織工程支架材料。

納米材料可形成仿生化的微環(huán)境，能影響細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的相互作用，調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)行為。其最大特點是高比表面積和空隙率，因此有利于種子細胞的接種、遷移和增殖。納米羥基磷灰石與膠原的復(fù)合材料便是基于上述仿生觀念制成的骨替代材料。宋坤修等[10]使用納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料作為支架材料，將血管內(nèi)皮生長因子加入到該材料中使其緩慢釋放，實驗證實該復(fù)合骨具有良好的骨修復(fù)作用，可作為一種新型復(fù)合人工骨修復(fù)骨缺損。清華大學(xué)的崔福齋[11]提出從生物學(xué)角度來說，對細胞與材料相互作用的理解越深刻，在支架材料的設(shè)計上才會有更加明確的標準。因此，模仿天然骨的成分及結(jié)構(gòu)特征，運用仿生學(xué)原理和納米自組裝技術(shù)，研制新一代具有特定功能的智能化仿生支架材料是當今骨組織工程學(xué)研究的前沿課題。

關(guān)于支架材料的選擇，目前已由天然提取成分構(gòu)建的簡單材料發(fā)展為人工合成的高分子聚合物材料；由單一的支架材料發(fā)展成各種具有良好性能的復(fù)合支架材料及其表面修飾材料[12]。在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，仿生思想尤為重要，如何模仿天然骨的成分及結(jié)構(gòu)特征制造骨移植替代材料，使其為細胞提供與天然骨相類似的微環(huán)境是目前的主要研究方向。

3 構(gòu)建組織工程化人工骨的研究

構(gòu)建組織工程化人工骨的基本戰(zhàn)略有兩種：一種是支架材料與成骨因子在體外組裝后植入體內(nèi)，通過成骨誘導(dǎo)因子的作用，使體內(nèi)細胞成骨分化并生成新骨；另一種是利用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)獲得足夠數(shù)量的成骨性細胞，在體外與支架材料復(fù)合，然后植入骨缺損部位進而生成新骨。

既往多采用細胞懸液滴入支架材料的靜置接種法進行組織構(gòu)建。然而實際上，人體內(nèi)幾乎所有的細胞都會受到生物力學(xué)因素的影響。應(yīng)力刺激會影響成骨細胞的代謝、細胞形態(tài)、基因表達、生長因子分泌等多個方面，導(dǎo)致細胞生物學(xué)行為發(fā)生變化。通過模擬體內(nèi)細胞生長所處微環(huán)境的動力特征，科學(xué)家們發(fā)明了動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，即生物反應(yīng)器。它可為細胞組織的體外培養(yǎng)提供仿生化的微環(huán)境，滿足了不同細胞組織培養(yǎng)所需的條件，為體外組織培養(yǎng)提供了新方法。例如旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器，具有剪切力低、培養(yǎng)的細胞之間有三維聯(lián)系的機會、極高的溶氧效率、營養(yǎng)物質(zhì)濃度梯度極低，營養(yǎng)及代謝更新快等特點，再加上其本身的可調(diào)控性和高效性，是目前應(yīng)用最廣的一種。部分研究者使用流動灌注生物反應(yīng)器直接培育大塊組織工程骨，這種儀器增加了支架材料內(nèi)部氧氣和養(yǎng)料的交換，可用于細胞與生物材料的三維立體培養(yǎng)，顯示出較好的培養(yǎng)效果?？梢钥闯錾锓磻?yīng)器在骨組織工程中有很好的應(yīng)用前景[13]。

誘導(dǎo)成骨因子，其主要功能是誘導(dǎo)成骨、促進細胞增殖及合成膠原、促進成骨和血管生成，并在骨吸收重建方面也具有重要作用。因此在構(gòu)建組織工程骨時，對誘導(dǎo)成骨因子合理使用或調(diào)控其適時適量表達就顯得格外重要。隨著分子生物學(xué)和細胞學(xué)的進展，諸多生長因子如血小板源性生長因子、成纖維細胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等已可純化和克隆，使生長因子和細胞結(jié)合成為可能。因而將基因技術(shù)和骨組織工程相結(jié)合的基因增強骨組織工程技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)在常用的基因技術(shù)有基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和基因敲出技術(shù)兩種，其中基因轉(zhuǎn)移技術(shù)最常使用，它把具有成骨作用的基因轉(zhuǎn)染到靶細胞，由靶細胞轉(zhuǎn)錄成mRNA并且翻譯成具有成骨作用的蛋白質(zhì)，通過靶細胞的持續(xù)自分泌促進自身成骨。郝偉等[14]采用重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2及堿性成纖維細胞生長因子雙基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，實驗證實能夠有效促進BMSCs成骨分化，與支架材料復(fù)合所構(gòu)建的組織工程骨體現(xiàn)出良好的體內(nèi)外成骨活力。

目前研制的各種特定組織型生物反應(yīng)器為工程化骨組織的體外培養(yǎng)提供了穩(wěn)定的微環(huán)境，但是要模仿人的生理環(huán)境，其各種控制條件還有待進一步完善。此外體內(nèi)組織工程骨的血管化問題也有待解決。促進組織工程骨的血管化是體內(nèi)組織工程骨成活的關(guān)鍵，它可及時為種子細胞提供其成活所必需的營養(yǎng)，以及排泄代謝廢物。目前促進血管化的方法主要是細胞復(fù)合培養(yǎng)、促血管化生長因子的應(yīng)用和顯微外科手段，但是究竟采用何種方法能取得最佳的修復(fù)效果還不確定。就目前現(xiàn)狀而言，應(yīng)用顯微外科技術(shù)臨床效果較好[15]。

4 組織工程骨臨床應(yīng)用的研究

在人體內(nèi)進行骨組織構(gòu)建并修復(fù)骨缺損是骨組織工程研究的最終目標。本世紀初，國內(nèi)外在積極進行骨組織工程基礎(chǔ)研究的同時，也謹慎開始了部分臨床實驗研究。國際上，比較經(jīng)典的是Vacanti等[16]應(yīng)用自體骨膜成骨細胞與天然珊瑚復(fù)合，對1例36歲患者左手拇指指骨進行修復(fù)，效果良好，術(shù)后3個月可日常工作和生活，術(shù)后28個月恢復(fù)正常拇指長度和力量。楊志明等[17]采用同種異體骨膜來源的成骨細胞與生物衍生骨支架材料構(gòu)建組織工程骨，對52例患者各種類型的骨缺損進行修復(fù)，經(jīng)隨訪初步證實具有良好的成骨能力，尚未發(fā)現(xiàn)明顯排斥反應(yīng)及其它并發(fā)癥。還有Morishita等[18]將骨髓基質(zhì)干細胞與羥基磷灰石支架材料復(fù)合，植入3例行骨腫瘤切除后所形成的骨缺損區(qū)內(nèi)，3個月后具有較好骨修復(fù)效果。

近年來，Huang等[19]利用PLGA與納米羥基磷灰石經(jīng)過材料表面改性后，再復(fù)合骨髓基質(zhì)干細胞用來修復(fù)兔下頜骨缺損，結(jié)果顯示該材料具有良好的骨修復(fù)作用。Wang等[20]以β-TCP為支架材料復(fù)合自體骨髓基質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程骨，通過流動灌注生物反應(yīng)器培育后修復(fù)羊脛骨大段骨缺損，結(jié)果顯示術(shù)后24周成骨能力強于空白對照組，證明該方法可用于臨床試驗。Pirraco等[21]利用細胞膜片技術(shù)進行大鼠的異位成骨實驗，結(jié)果顯示術(shù)后7 d有新骨形成，術(shù)后6周出現(xiàn)血管化的骨髓，并進一步形成成熟的骨組織。目前世界各地的科學(xué)家們正在抓緊進行著各項實驗研究，相信隨著大量體內(nèi)實驗和臨床研究的成功，可為即將來臨的大規(guī)模的臨床應(yīng)用奠定良好基礎(chǔ)?？傊?，骨組織工程的研究目前仍面臨著巨大挑戰(zhàn)，但是筆者堅信通過組織工程研究者們的共同努力、通力協(xié)作，在不久的將來其必將取得突破性進展，組織工程骨產(chǎn)品最終會在臨床中應(yīng)用，造福廣大患者。

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