普通白菜遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

陳泠先 崔麗潔 錢忠英 潘靜嫻 開國銀

（上海師范大學(xué)植物種質(zhì)資源研發(fā)中心生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

普通白菜（小白菜）〔Brassica campestrisL. ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕屬十字花科蕓薹屬，是我國長(zhǎng)江流域及南方各省普遍栽培的重要綠葉蔬菜之一，在蔬菜的周年生產(chǎn)、緩解淡季供應(yīng)中具有重要作用。但在普通白菜的生產(chǎn)中，迫切需要培育抗病、抗蟲、抗逆和具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的新品種。隨著組織培養(yǎng)和DNA重組技術(shù)的建立和不斷完善，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為改良作物農(nóng)藝性狀的重要手段（羅靜 等，2007）。目前，通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)來改良普通白菜的某些特性，如抗蟲性、抗病性、耐熱性，已經(jīng)成為比較熱門的研究方向。本文對(duì)普通白菜的再生體系、遺傳轉(zhuǎn)化方法和外源基因表達(dá)等研究進(jìn)展進(jìn)行了概述。

1 普通白菜再生體系

較之其他蕓薹屬植物，普通白菜的植株再生較為困難，這嚴(yán)重制約了其遺傳轉(zhuǎn)化的效率，因此，植株的高頻再生體系的建立成為重要的研究基礎(chǔ)。影響再生的因素很多，如外植體的基因型、類型、生理狀態(tài)及培養(yǎng)基成分等。

1.1 外植體

外植體的基因型不同，再生能力也不同。張鳳蘭等（2002）在對(duì)普通白菜再生體系的研究中證明了不同品種的再生能力差異顯著，再生頻率為 6.7%～97.5%。曹家樹等（2000）研究了上海青、矮抗青、杭州油冬兒等 6個(gè)普通白菜品種的離體培養(yǎng)植株的再生頻率，發(fā)現(xiàn)青梗類品種的植株再生頻率明顯高于白梗類品種，從而認(rèn)為青梗類品種更適宜離體培養(yǎng)。Memon等（2009）選取了 6個(gè)普通白菜栽培種進(jìn)行再生研究，發(fā)現(xiàn)不同品種間不定芽再生率明顯不同，其中柳川大縮緬再生率最高。可見，基因型對(duì)植株再生頻率的影響很大，基因型的選擇對(duì)普通白菜的遺傳轉(zhuǎn)化尤為重要。

不同類型外植體的再生頻率也有很大差別。蔡小寧等（1997）研究轉(zhuǎn)化了普通白菜的子葉、子葉柄和真葉，其再生頻率有顯著差異，矮腳黃的子葉、子葉柄、真葉的再生頻率分別為15.8%、6.1%和2.7%，子葉的再生頻率較高；陳敏敏和侯喜林（2008）研究表明，不同品種的普通白菜中，暑綠的帶柄子葉再生頻率高達(dá) 80%；而在呂艷艷等（2010）的報(bào)道中，下胚軸的再生頻率幾乎為 0，子葉柄產(chǎn)生不定芽的再生頻率達(dá) 59%，而以子葉作為外植體時(shí)，不定芽的再生頻率僅為 23%。帶柄子葉具有較高的再生頻率，可能是因?yàn)樽尤~—子葉柄帶有部分分化能力較強(qiáng)的原分生細(xì)胞，還可以得到來自子葉塊的營(yíng)養(yǎng)（主要是內(nèi)源激素），且子葉柄切面上的薄壁細(xì)胞具有廣泛的分裂活性，易受到農(nóng)桿菌侵染，而其他類型的外植體沒有帶柄子葉有優(yōu)勢(shì)。

外植體的苗齡對(duì)再生頻率也有很大影響。苗齡過大、過小對(duì)不定芽的形成均不利。謝建坤等（2000）報(bào)道5～9 d苗齡的外植體可以獲得較高的不定芽再生頻率；高紅亮等（2008）的試驗(yàn)結(jié)果表明4～7 d苗齡的外植體再生效果較好，其中二青以4 d苗齡為最好，不定芽分化率高達(dá)76.5%，而常州烏塌菜6 d苗齡時(shí)不定芽分化率達(dá)94.1%；但張智奇等（1998）、Zhang等（1998）的報(bào)道中，都以4 d苗齡的帶柄子葉為最佳外植體。一般地，4～7 d苗齡時(shí)外植體的再生能力較高，如果苗齡過大，子葉柄切面上的細(xì)胞難以脫分化，細(xì)胞的分裂能力會(huì)降低，從而降低外植體的再生能力。

1.2 培養(yǎng)基

在植物的再生培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)基及其成分也起著重要作用。培養(yǎng)基的瓊脂濃度影響再生頻率。Zhang等（1998）用不同瓊脂濃度的培養(yǎng)基處理外植體，發(fā)現(xiàn)瓊脂濃度為1.2%或1.6%的培養(yǎng)基比 0.8%的培養(yǎng)基芽再生率高 2～3倍，并且隨著瓊脂濃度的升高，培養(yǎng)基中的乙烯含量逐漸降低。這可能是高濃度的瓊脂含量影響培養(yǎng)基中水分的存在狀態(tài)，同時(shí)培養(yǎng)基中濕度下降，改變了離體再生的微環(huán)境而使再生頻率得以提高。

培養(yǎng)基中的激素種類及其配比是影響外植體分化最關(guān)鍵的因素之一。在徐淑平等（2002）的試驗(yàn)中，以2 ip 7.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1的配比最有利于普通白菜矮抗青下胚軸和子葉不定芽的分化，前者最高芽分化頻率達(dá)48%，后者達(dá)42%。而蘇軍等（2002）的研究表明，培養(yǎng)無菌苗時(shí)添加植物激素，特別是較高濃度的6-BA與NAA組合，對(duì)外植體的脫分化和不定芽的再生具有積極意義。

培養(yǎng)基中加入AgNO3可明顯提高轉(zhuǎn)化效率。培養(yǎng)基中添加AgNO3后，Ag+競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合位于細(xì)胞間膜的乙烯受體部位而抑制乙烯活性，并且干擾乙烯信號(hào)傳遞途徑，從而促進(jìn)器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。秦新民等（1997）研究表明，在含4 mg·L-1AgNO3的培養(yǎng)基上，雞毛菜、矮腳黃的不定芽分化率分別由原來的23.3%、36.7%提高到41.3%、61.3%；四月慢和白雪小白菜則在6 mg·L-1AgNO3時(shí)不定芽的分化率最高，分別是43.7%和53.8%。也有學(xué)者認(rèn)為AgNO3與ABA配合使用更能促進(jìn)不定芽的發(fā)生，如王火旭等（2001）認(rèn)為AgNO3與ABA具有協(xié)同增效作用，其中AgNO3是關(guān)鍵因子，ABA有促進(jìn)作用，能改善不定芽的質(zhì)量，減少玻璃芽的產(chǎn)生。但對(duì)某些基因型品種，添加AgNO3并沒有使其誘導(dǎo)出不定芽（Zhang et al.，1998），而且隨著AgNO3含量的提高，芽分化率有所降低，這可能是由于Ag+與培養(yǎng)基中的陰離子發(fā)生反應(yīng)，打破了離子平衡，改變了培養(yǎng)基的pH值。而且Ag+離子是重金屬，對(duì)植物體有毒害作用，因此培養(yǎng)基中AgNO3的含量不能過高（杜虹 等，2000）。

2 普通白菜轉(zhuǎn)基因方法

培養(yǎng)抗病、抗蟲、抗逆的普通白菜新品種一直是生產(chǎn)上亟待解決的難題。近年來發(fā)展起來的基因工程轉(zhuǎn)化技術(shù)為這一難題提供了新的解決途徑?；蚬こ淌窃谥亟MDNA技術(shù)上發(fā)展起來的一門新技術(shù)，即將外源目的基因經(jīng)過或不經(jīng)過修改，通過生物、物理或化學(xué)的方法導(dǎo)入植物體進(jìn)行重組，以改良植物體的性狀，得到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病蟲及抗逆性強(qiáng)的新品種。

植物基因轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、PEG法、電融合法、基因槍法、顯微注射法、激光束穿刺法、脂質(zhì)體法、轉(zhuǎn)化絲法等，在普通白菜上目前使用的主要是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和電融合法。

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是迄今植物基因工程中應(yīng)用最多、最理想、最簡(jiǎn)單的方法，已獲得的轉(zhuǎn)基因植物中 80%來自農(nóng)桿菌介導(dǎo)法（高麗 等，2010）。用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌有兩種：根癌農(nóng)桿菌（Marc et al.，1989）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Christey et al.，1997），其中根癌農(nóng)桿菌應(yīng)用較為廣泛。一般是取5～6 d苗齡的外植體預(yù)培養(yǎng)2 d后放入農(nóng)桿菌中侵染，然后將外植體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d，再將其轉(zhuǎn)移到含有抗生素和抑菌素的選擇分化培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出苗后將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，使其再生為植株。余小林等（2005）用農(nóng)桿菌菌株EHA105和LBA4404感染普通白菜和菜薹（菜心）的子葉柄和子葉外植體，得出在進(jìn)行白菜類作物遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)LBA4404感染效果較好；而范正琪（2002）用EHA105和LBA4404侵染普通白菜的結(jié)果顯示，EHA105轉(zhuǎn)化時(shí)gus瞬時(shí)表達(dá)頻率（52.0%）高于LBA4404（47.1%）。這可能與供試材料的基因型有關(guān)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的再生植株轉(zhuǎn)化效率不是很高，研究表明決定目的基因誘導(dǎo)的關(guān)鍵時(shí)期為共培養(yǎng)時(shí)期。注意共培養(yǎng)的幾個(gè)關(guān)鍵步驟可以使目的基因高效表達(dá)，進(jìn)而為后期的轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)：① 避免共培養(yǎng)基中含酵母提取物，通常把農(nóng)桿菌培養(yǎng)液離心，用MS液體培養(yǎng)基重懸農(nóng)桿菌沉淀（Jun et al.，1995；張鳳蘭，2004）；② 共培養(yǎng)基中要含有較高濃度的糖，蔗糖含量應(yīng)在30%以上（范正琪 等，2002；余小林 等，2005）；③ 培養(yǎng)基pH值介于5.0～5.6之間（Jun et al.，1995）；④ 共培養(yǎng)時(shí)的溫度低于 28 ℃，一般置于 25 ℃暗處進(jìn)行共培養(yǎng)（張鳳蘭，2004；余小林 等，2005）；⑤ 共培養(yǎng)時(shí)間通常以 2～3 d為好（張鳳蘭，2004；余小林 等，2005）。目前只有范正琪（2002）通過普通白菜帶柄子葉進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)5 d時(shí)轉(zhuǎn)化的頻率較高。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程中，為了抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，需要在共培養(yǎng)以后加入抗生素?？股氐囊志Ч苯佑绊戅D(zhuǎn)化效率。白菜類作物常用的抗生素有氨芐青霉素、羧芐青霉素、頭孢霉素、淡紫青霉素等。在有效抑菌濃度范圍內(nèi)，氨芐青霉素質(zhì)量濃度在500 mg·L-1以下時(shí)，對(duì)不定芽的再生有輕微的抑制作用，而羧芐青霉素則有促進(jìn)作用（250～500 mg·L-1），頭孢霉素對(duì)不定芽的再生有明顯抑制作用，易引起外植體傷口褐化死亡，也許與白菜類作物對(duì)頭孢霉素過于敏感有關(guān)（范正琪 等，2002）。張鳳蘭（2004）通過研究不同濃度的淡紫青霉素對(duì)大白菜子葉不定芽的影響，發(fā)現(xiàn)不定芽的再生幾乎不受淡紫青霉素的影響。目前在白菜類作物的遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用比較廣泛的仍是羧芐青霉素。

2.2 電融合法

電融合法是在強(qiáng)電場(chǎng)作用下，使生物組織細(xì)胞發(fā)生可逆的透性變化，產(chǎn)生直徑約為 30 nm的瞬時(shí)孔洞，促進(jìn)DNA分子進(jìn)入原生質(zhì)體，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的導(dǎo)入。電融合法使用的電壓梯度和脈沖持續(xù)時(shí)間與原生質(zhì)體的大小有關(guān)。電融合法也可與PEG法等結(jié)合起來，提高轉(zhuǎn)化頻率。電融合法具有 3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問題；二是融合效率高；三是融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便。在袁天華等（1994）的研究中，應(yīng)用了電融合法對(duì)煙草和普通白菜原生質(zhì)體進(jìn)行煙草花葉病毒TMV-RNA的導(dǎo)入試驗(yàn)；侯喜林等（2001）以普通白菜OuCMS 91H秋-100（不育系）和91H秋-21（保持系）為試材，研究了不同交流場(chǎng)強(qiáng)、交流頻率、直流脈沖場(chǎng)強(qiáng)、直流幅寬及脈沖次數(shù)對(duì)非對(duì)稱細(xì)胞融合效果的影響，進(jìn)而探索出合適的電融合條件。

3 普通白菜外源基因表達(dá)

隨著基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷進(jìn)步，在普通白菜中已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化的目的基因種類也越來越多。目前，導(dǎo)入普通白菜的基因按功能來分主要有抗病基因、抗蟲基因、改良品質(zhì)基因和雄性不育基因等。

3.1 抗病基因

病毒病是普通白菜最主要的病害之一，常給普通白菜生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。在植物抗病毒基因工程中，外殼蛋白（CP）基因策略是應(yīng)用最廣泛的一種方法。通過遺傳轉(zhuǎn)化將病毒外殼蛋白編碼基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中表達(dá)，這些病毒外殼蛋白在植物細(xì)胞中的積累，能夠抑制侵染病毒的復(fù)制，從而減輕癥狀或推遲病毒發(fā)生的時(shí)間（楊瑞環(huán) 等，2001）。Jun等（1995）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將引起普通白菜病毒病的煙草花葉病毒（TML-L）的CP基因轉(zhuǎn)入普通白菜spring flavor中，獲得6株轉(zhuǎn)基因植株，其中5株將TMV-CP基因遺傳到了下一代。為了獲得廣譜抗性，也有研究者將多價(jià)基因轉(zhuǎn)入到普通白菜中去。陳敏敏（2007）將由AFP2、TAP、Metch和BuforinⅡ4個(gè)基因構(gòu)成的融合基因InBING轉(zhuǎn)入普通白菜蘇州青，獲得了較好的抗病毒病的效果。

3.2 抗蟲基因

十字花科蔬菜是品種最多、栽培面積最大的一類蔬菜，其害蟲的類別也最多，危害也最大（吳鉅文，1997）。由于自然界缺乏抗蟲種質(zhì)資源，用常規(guī)育種方法開展普通白菜的抗蟲育種工作難以奏效，轉(zhuǎn)基因作為一種很有效的方法使抗蟲育種有了很大進(jìn)展。蔡小寧等（1997）將豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）基因?qū)肫胀ò撞似贩N矮腳黃和蘇州青，獲得卡那霉素抗性苗；佘建明等（2000）將CpTI基因?qū)肫胀ò撞?，獲得具有較高抗蟲性的轉(zhuǎn)基因單株；張智奇等（1999）將慈姑蛋白酶抑制劑（AP1）基因?qū)肫胀ò撞似謻|矮箕菜和矮抗青，轉(zhuǎn)化植株對(duì)菜青蟲的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的抑制作用；徐淑平等（2002）通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Bt殺蟲基因以及CpTI基因轉(zhuǎn)化普通白菜，分別獲得了帶Bt基因以及CpTI基因的轉(zhuǎn)基因普通白菜純合系植株。這些抗蟲基因的成功轉(zhuǎn)化為應(yīng)用基因工程培育抗蟲普通白菜新品種奠定了良好的基礎(chǔ)。

3.3 品質(zhì)改良基因

目前，品質(zhì)改良已經(jīng)成為選育普通白菜新品種的主要目標(biāo)，一些有價(jià)值的外源基因的導(dǎo)入無疑是一條有效的途徑，但是目前有關(guān)普通白菜品質(zhì)改良基因工程的研究報(bào)道較少。薛萬新（2001）將葉球發(fā)育相關(guān)基因BcpLH轉(zhuǎn)入普通白菜上海黑葉四月慢，但是其并沒有發(fā)生表型變化。也有研究者將藥用基因轉(zhuǎn)入普通白菜，期望獲得藥食兼用的品種。如胡小平等（2006）將芪合酶基因轉(zhuǎn)入普通白菜，產(chǎn)生并積累了具有降血脂、降血壓等多種保健功能的3，4′，5-三羥基芪，最終培育出了藥食兼用的普通白菜新品種。

3.4 雄性不育基因

Zhang等（2008）利用反義技術(shù)將與花粉表達(dá)有關(guān)的聚半乳糖醛酸酶基因BcMF6轉(zhuǎn)入普通白菜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中只有50%的花粉能夠萌發(fā)。

雖然在普通白菜上成功導(dǎo)入了較多的外源基因，但是對(duì)于這些基因的表達(dá)效率來說，大部分沒有得到預(yù)期效果，而且不同外源基因的表達(dá)差異也很大，這些基因的差異性表達(dá)不僅受到不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的調(diào)控，而且轉(zhuǎn)錄水平的抑制和轉(zhuǎn)錄后mRNA的積累也會(huì)造成基因沉默（Maike et al.，1997）。所以如何控制外源基因沉默并提高外源基因表達(dá)效率是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因工作面臨的重要任務(wù)。目前研究表明，構(gòu)建含 MARs的表達(dá)載體、選擇特異性或誘導(dǎo)性的啟動(dòng)子、建立位點(diǎn)特異的重組體系、利用引導(dǎo)肽定位外源基因的表達(dá)產(chǎn)物、利用線粒體和葉綠體的轉(zhuǎn)化以及對(duì)目的基因的改造等方法均在一定程度上可以提高基因的表達(dá)效率。

4 問題與展望

多年來學(xué)者們通過努力，成功摸索出普通白菜不同基因型品種的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但仍存在很多問題：① 轉(zhuǎn)化效率低。目前報(bào)道的普通白菜的轉(zhuǎn)基因植株所占比例較小，介于 0.35%～1.13%之間，遺傳轉(zhuǎn)化體系各項(xiàng)參數(shù)還有待優(yōu)化，從而進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率。② 不具有普遍性。目前普通白菜的遺傳轉(zhuǎn)化體系受植物基因型影響較大，個(gè)體差異較大，可操作性較差。③ 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)手段不健全。目前所報(bào)道的普通白菜轉(zhuǎn)基因檢測(cè)大多數(shù)僅采用了PCR驗(yàn)證。實(shí)際上PCR檢測(cè)的假陽性較高，僅依賴PCR檢測(cè)不能真實(shí)的反應(yīng)外源基因的整合情況，不能很好的檢驗(yàn)遺傳轉(zhuǎn)化體系的可靠性。④ 遺傳穩(wěn)定性研究缺乏。普通白菜的轉(zhuǎn)化植株后代遺傳穩(wěn)定性的問題還沒有得到真正的解決，還需進(jìn)一步深入研究。

目前有關(guān)普通白菜的分子生物學(xué)研究鮮見報(bào)道，基因工程研究進(jìn)展緩慢。多數(shù)研究仍停留在基因克隆分析階段。要充分利用基因圖譜和分子標(biāo)記等生物技術(shù)手段，使育種從依靠表現(xiàn)型選擇向依靠基因型選擇飛躍；針對(duì)普通白菜的重要病蟲害，有重點(diǎn)地開展蔬菜病蟲害分子生物學(xué)研究工作，尋找有效的抗病蟲基因，為病蟲害控制和抗病蟲品種的培育奠定基礎(chǔ)。

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