用超高速液相色譜法同時測定山茱萸藥材中馬錢苷和莫諾苷的含量

周 清，侯 峰，董 斌，周海莉，甘 蓉

（1.遼寧省朝陽市藥品檢驗所，朝陽122000；2.遼寧省食品藥品檢驗所檢驗二室，沈陽110023；3.遼寧省大連市食品藥品檢驗所抗生素室，大連116000；4.遼寧玉皇生化藥品有限公司質(zhì)量保證部，沈陽110102）

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus offcinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，性微溫，味酸、澀，歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝益腎、澀精固脫之功效，臨床用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿、尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等癥［1］。山茱萸中所含成分較復(fù)雜，包括有機(jī)酸類、糖類、環(huán)烯醚萜類和鞣質(zhì)類化合物。目前對于山茱萸藥材的含量測定主要是以HPLC法測定熊果酸［2，3］和馬錢苷［4］，但其分析時間長，分離效果差。超高速液相色譜（ultra fast liquid chromatography，UFLC）儀是日本島津公司近幾年推出的新型液相色譜儀，通過采用更小顆粒、更大峰容量的色譜柱，使得分析時間大為縮短，可以有效節(jié)省溶劑量，一般可節(jié)約80%的分析時間［5］。本研究采用UFLC法同時測定山茱萸中的馬錢苷和莫諾苷。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 LC－20A型UFLC儀、LC Solution色譜工作站和XR－ODS色譜柱（日本島津公司）；AG285型分析天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）。

1.2 藥品和試劑 馬錢苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111640－200503）；莫諾苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號YY90349）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；水為二次蒸餾水（遼寧省食品藥品檢驗所自制）；其余試劑均為分析純。20批山茱萸樣品（遼寧玉皇生化藥品有限公司提供），經(jīng)遼寧省食品藥品檢驗所王維寧副教授鑒定，均為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：XR－ODS柱（75mm×3.0mm，2.1μm）；流動相：乙腈－水（15∶85）；流速：1.0ml／min；柱溫：45℃；檢測波長：240nm。理論塔板數(shù)按馬錢苷峰計算≥3 000，色譜峰的分離度符合要求，3min內(nèi)檢測完畢。

2.2 溶液的制備 （1）對照品溶液：取馬錢苷對照品和莫諾苷對照品適量，精密稱定，置于同一25ml量瓶中，加80%甲醇適量使溶解，稀釋至刻度，得對照品溶液Ⅰ，其中馬錢苷和莫諾苷的濃度分別為0.411 2和0.402 0mg／ml。精密吸取對照品溶液Ⅰ5.0ml置50ml量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，得對照品溶液Ⅱ，其中馬錢苷和莫諾苷的濃度分別為

41.12 和40.20μg／ml。（2）供試品溶液：取山茱萸藥材研磨成細(xì)粉，過四號篩。取藥粉約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過。取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取對照品溶液Ⅱ和供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，得到色譜圖，見圖1。

圖1 莫諾苷和馬錢苷的超高速液相色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取對照品溶液Ⅱ1、2、5、10μl和對照品溶液Ⅰ2、5μl，分別注入UFLC儀中，測定色譜峰面積（Y），以Y對進(jìn)樣量（X）做線性回歸，得到馬錢苷和莫諾苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：Y＝3.282×105X＋3.020× 103和Y＝4.131×105X＋2.787×103，線性范圍分別是0.041～2.056μg和0.040～2.01μg，線性關(guān)系良好（r＝0.999 9）。

2.4 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一批供試品溶液10μl，分別在配制后0、1、2、3、4、6h進(jìn)樣測定，結(jié)果測得馬錢苷和莫諾苷峰面積的RSD分別為0.28%和0.14%（n＝6），表明供試品溶液配制后在室溫放置6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 精密度實驗 精密吸取同一批供試品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次測定，結(jié)果測得馬錢苷和莫諾苷峰面積的RSD分別為1.20%和0.42%（n＝6），表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗 取同一批山茱萸樣品研磨成細(xì)粉，取約0.1g，精密稱定，共取6份。按2.2項下方法制備成供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣10μl。結(jié)果測得馬錢苷和莫諾苷含量的RSD分別為1.02%和0.62%（n＝6），表明重復(fù)性良好。

2.7 回收率實驗 取山茱萸藥材，研磨成細(xì)粉過四號篩。取約0.05g，精密稱定，共取6份，分別加入對照品溶液Ⅰ1.0ml，按2.2項下方法制備成供試品溶液。按2.1項下色譜條件分別進(jìn)樣10μl。結(jié)果測得馬錢苷和莫諾苷的平均加樣回收率分別為（98.0±1.02）%（n＝6）和（99.7±0.36）%（n＝6），表明回收率良好。

2.8 樣品含量測定 取20批山茱萸藥材，每批次進(jìn)行兩次平行操作，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析，測定結(jié)果為兩次測定值的平均值，見表1。

表1 山茱萸藥材中馬錢苷和莫諾苷的含量測定結(jié)果（%）

3 討 論

現(xiàn)有文獻(xiàn)多采用HPLC法測定山茱萸中馬錢苷和熊果酸的含量，分析時間長。本研究采用UFLC法同時測定山茱萸中馬錢苷和莫諾苷的含量，與傳統(tǒng)的HPLC法相比，可以實現(xiàn)快速分離，在3min內(nèi)完成分析，縮短分析時間，節(jié)約分析溶劑，有利于健康和環(huán)保。UFLC所用色譜柱比傳統(tǒng)ODS色譜柱粒徑更小，分離機(jī)制與傳統(tǒng)色譜柱不同，導(dǎo)致山茱萸各成分出峰順序與傳統(tǒng)方法不一樣。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：26.

State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010ed.Volume 1［S］.Beijing：Chinese Medical Science Press，2010：26.In Chinese.

［2］ 王曉紅.山茱萸幾種不同炮制品的熊果酸含量測定［J］.中成藥，2000，22（7）：482－483.

Wang XiaoHong.Quantitative analysis of ursolic acid from different prepared products of Fructus Corni［J］.Chin Tradit Pat Med，2000，22（7）：482－483.In Chinese with English abstract.

［3］ 宋良科，鄢 丹，馬云桐.HPLC法測定山茱萸果實不同部位中熊果酸含量［J］.中藥材，2004，27（8）：584－585.

Song LiangKe，Yan Dan，Ma YunTong.Content determination of ursolic acid in different parts of Corni Fructus by HPLC method［J］.J Chin Mat Med，2004，27（8）：584－585.In Chinese.

［4］ 王曉燕.不同采收期山茱萸中馬錢苷的含量測定［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（9）：2025－2026.

Wang XiaoYan.Determination of loganin in fruit of Cornus officinalis from different harvesting time［J］.Chin J Health Lab Technol，2009，19（9）：2025－2026.In Chinese with English abstract.

［5］ 施 法，侯 峰.金銀花中3種成分含量的超高速液相色譜法同時測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（11）：3014－3015.

Shi Fa，Hou Feng.Simultaneous determination of 3ingredients contents in Jinyinhua by ultra fast liquid chromatography［J］.Lishizhen Med Mat Med Res，2010，21（11）：3014－3015.In Chinese.