煙草突變體篩選與鑒定方法篇：5.煙草耐低鉀突變體的篩選與鑒定

王 倩

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草是喜鉀作物。除了作為重要的營(yíng)養(yǎng)元素發(fā)揮作用外，鉀與煙草的抗逆性、抗病蟲害能力密切相關(guān)；鉀含量也是煙葉品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一?；阝浰氐闹匾院臀覈?guó)土壤普遍低鉀的國(guó)情及國(guó)內(nèi)煙葉鉀含量低的現(xiàn)狀，開展煙草鉀營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)研究、選育耐低鉀/鉀吸收高效型煙草品種等工作極為迫切[1]。為此，煙草基因組計(jì)劃重大專項(xiàng) 2012年研究項(xiàng)目“煙草突變體篩選與鑒定”建立了煙草耐低鉀突變體的高通量篩選方法，并開展了煙草耐低鉀突變體的大量篩選工作。

1 煙草耐低鉀突變體的高通量篩選方法的建立

可見表型突變體通過(guò)外觀表型可較為容易地獲得；與之不同，植物營(yíng)養(yǎng)突變體的篩選相對(duì)復(fù)雜。篩選體系需要一個(gè)明確的篩選指標(biāo)和合適的篩選條件，使得目標(biāo)突變體具備明顯的性狀，從而區(qū)別于其他非突變植株。遵循高通量、快速、簡(jiǎn)易的篩選原則，耐低鉀突變體篩選采用負(fù)篩選的策略，即利用組織培養(yǎng)技術(shù)，減少生長(zhǎng)所必需的鉀元素[2]。因耐低鉀突變體比正常煙草更具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從而被篩選獲得。擬南芥、小麥等植物的營(yíng)養(yǎng)性狀突變體篩選過(guò)程中均采用了類似的篩選體系[3-4]。

1.1 低鉀培養(yǎng)基的配制

低鉀培養(yǎng)基的配制參照擬南芥鉀營(yíng)養(yǎng)突變體的篩選方法[5]。以正常MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，去除KNO3以NH4NO3部分替換，去除 KH2PO4以等濃度 NH4H2PO4替換。其大量元素的具體組成如下：2300 mg/L NH4NO3，370 mg/L MgSO4·7H2O，144 mg/L NH4H2PO4，440 mg/L CaCl2·2H2O。微量元素、鐵鹽、瓊脂、蔗糖的加入量保持不變。經(jīng)測(cè)定，不外加鉀的MS培養(yǎng)基（無(wú)鉀培養(yǎng)基）的鉀本底含量為50 μM。試驗(yàn)中培養(yǎng)基的鉀濃度根據(jù)需要用KNO3調(diào)節(jié)。

1.2 煙草耐低鉀突變體篩選時(shí)期的確定

耐低鉀突變體的篩選條件可簡(jiǎn)單劃分為兩方面：突變體的篩選時(shí)期和生長(zhǎng)環(huán)境中的鉀濃度。對(duì)煙草而言，煙草種子具有體積小、易于消毒、發(fā)芽時(shí)間短等特點(diǎn)，因此選擇煙草幼苗進(jìn)行突變體篩選比較合理。同時(shí)，成株期煙苗由于種植面積大、中間環(huán)節(jié)多，不適合用于高通量篩選。

1.3 煙草耐低鉀突變體篩選指標(biāo)的確定

本體系選取對(duì)環(huán)境中鉀濃度變化較為敏感的煙草性狀作為篩選指標(biāo)。在篩選壓力下，突變體具有忍受鉀脅迫的能力可以正常生長(zhǎng)，而非突變體則生長(zhǎng)受到抑制。野生型煙草種子消毒后單粒點(diǎn)種于1/2 MS培養(yǎng)基，將6 d苗齡的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至不同鉀濃度的低鉀培養(yǎng)基中，對(duì)其生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，煙草幼苗的根部生長(zhǎng)對(duì)外部鉀濃度變化較為敏感，而其冠部生長(zhǎng)受鉀濃度變化影響相對(duì)較小。隨著培養(yǎng)基中鉀濃度的降低，煙草根系生長(zhǎng)速度減慢。因此，選擇幼苗的根系生長(zhǎng)作為篩選指標(biāo)。為便于觀察，將幼苗根尖向上倒立豎直培養(yǎng)，在向地性的作用下，如果根伸長(zhǎng)則向下彎曲生長(zhǎng)。把根發(fā)生彎曲的個(gè)體挑選出來(lái)作為可能的突變體。以根的向地性彎曲生長(zhǎng)為篩選指標(biāo)的方法已在擬南芥和其它作物鉀、鈉、鎘、銨等營(yíng)養(yǎng)突變體的篩選中得到成功應(yīng)用[6-9]。

1.4 煙草耐低鉀突變體篩選壓力（臨界鉀濃度）的確定

合適的篩選壓力是篩選順利的關(guān)鍵。煙草耐低鉀突變體篩選臨界鉀濃度是指可維持煙草幼苗生存且能較好地體現(xiàn)植株缺鉀性狀的鉀濃度，也即能夠完全抑制野生型煙草幼苗主根生長(zhǎng)的最高鉀濃度。

野生型煙草種子消毒后單粒點(diǎn)種于1/2 MS培養(yǎng)基，待主根伸長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)移至不同鉀濃度低鉀培養(yǎng)基上，根尖向上倒立豎直培養(yǎng)。在向地性的作用下，如果根伸長(zhǎng)則向下彎曲生長(zhǎng)。定期測(cè)量不同鉀濃度下幼苗的彎根長(zhǎng)度。經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)與統(tǒng)計(jì)分析，確定煙草外加鉀濃度為75 μM時(shí)，野生型煙草幼苗主根生長(zhǎng)完全被抑制。因此，選取125 μM 鉀濃度（無(wú)鉀MS培養(yǎng)基本底鉀濃度50 μM + 外加鉀濃度75 μM）為煙草耐低鉀突變體的篩選壓力。

2 煙草耐低鉀突變體的高通量篩選

2.1 煙草耐低鉀突變體的高通量初步篩選

將EMS（甲基磺酸乙酯）處理的煙草突變體二代種子消毒后，單粒點(diǎn)播于1/2 MS培養(yǎng)基。每份材料點(diǎn)播40～50粒。以未經(jīng)EMS處理的野生型煙草種子作對(duì)照。待主根生長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)移至外加鉀濃度為75 μM的低鉀培養(yǎng)基上，根尖向上倒立豎直培養(yǎng)，10～20 d內(nèi)觀察記錄各突變體主根生長(zhǎng)情況。根出現(xiàn)明顯彎曲生長(zhǎng)的幼苗為可能的耐低鉀突變體。將篩選到的可能的耐低鉀突變體幼苗轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待根系生長(zhǎng)茁壯后，移栽于營(yíng)養(yǎng)土中，種子成熟后采收第3代種子。期間對(duì)突變體的田間表型進(jìn)行觀察和描述。

2.2 煙草耐低鉀突變體的進(jìn)一步篩選

為剔除試驗(yàn)誤差、保證篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，利用2.1中的篩選方法對(duì)耐低鉀突變體3代種子進(jìn)行復(fù)篩。100%表現(xiàn)為上一代耐低鉀性狀的株系為耐低鉀突變體。該部分工作可大幅度降低后續(xù)鑒定環(huán)節(jié)的工作量。

3 煙草耐低鉀突變體的獲得及突變基因功能鑒定

3.1 突變體的生理性狀分析

篩選所獲得的耐低鉀突變材料需對(duì)其性狀進(jìn)行更加細(xì)致的分析測(cè)定，包括突變體的植株生物量、根冠生物量、根冠鮮重、植株鉀含量、主側(cè)根長(zhǎng)度、根系鉀吸收速率及利用率等，也可通過(guò)改變培養(yǎng)基中的鈣、磷等營(yíng)養(yǎng)成分，觀察其生長(zhǎng)變化，為后續(xù)的功能研究提供信息[10-11]。

3.2 突變基因功能鑒定

突變體的表型變化是由一個(gè)或多個(gè)基因的突變導(dǎo)致的，因此，耐低鉀突變體研究最終要定位到具體的突變基因。以野生型為父本，性狀穩(wěn)定的突變體為母本，進(jìn)行雜交，通過(guò)對(duì)F1代耐低鉀性狀檢測(cè)，確定突變性狀的顯隱性。通過(guò)低鉀篩選統(tǒng)計(jì)F2代的耐低鉀表型，分析其分離比例。建立遺傳分離群體，篩選與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，采用正向遺傳學(xué)方法獲得突變基因。過(guò)表達(dá)或干擾該基因在煙草中的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)植株的耐低鉀性狀，確定基因的功能。在擬南芥的鉀營(yíng)養(yǎng)研究中，利用上述策略成功克隆并解析了蛋白激酶 CIPK23、AtKC1的功能，通過(guò)對(duì)上下游互作研究，提出了擬南芥低鉀脅迫反應(yīng)通路，即Ca2+-CBL-CIPK23信號(hào)通路[4,12-13]。

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