銀杏內(nèi)酯B 防治腦缺血的研究進(jìn)展

聶珍貴，梁翠茵（首都醫(yī)科大學(xué)燕京醫(yī)學(xué)院藥理教研室，北京 101300）

銀杏Ginkgo bilobaL.為銀杏科（Ginkgoaceae）銀杏屬唯一生存種，被稱為植物界的“活化石”。祖國(guó)醫(yī)學(xué)記載銀杏葉具有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛的功能。自20世紀(jì)70年代始，銀杏葉提取物（EGb）已廣泛應(yīng)用于治療缺血性心腦血管疾病。銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物中，主要含銀杏黃酮和萜烯內(nèi)酯，萜烯內(nèi)酯包括單體銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J和白果內(nèi)酯。研究表明，銀杏內(nèi)酯為血小板活化因子（PAF）受體拮抗劑，其中以銀杏內(nèi)酯B（GB、BN52021）作用最強(qiáng)。國(guó)內(nèi)外的研究[1，2]顯示，GB具有抑制血小板聚集、抗過(guò)敏、抗炎、抗休克，以及保護(hù)心腦血管、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶、防治早老性癡呆等作用。目前國(guó)外正在進(jìn)行銀杏內(nèi)酯混合物和GB純品的臨床試驗(yàn)研究，國(guó)內(nèi)GB單體制劑已完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)。本文就其防治腦缺血的藥效學(xué)及作用機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

1 GB對(duì)不同種屬動(dòng)物腦缺血模型的實(shí)驗(yàn)研究

動(dòng)物的腦缺血模型主要分為全腦缺血和局灶性腦缺血兩大類。全腦缺血是由于暫時(shí)阻斷供應(yīng)腦部的血流，導(dǎo)致腦部廣泛的缺血缺氧（通常主要是前腦）所致。局灶性腦缺血一般是由于暫時(shí)性或永久性地阻斷了特定區(qū)域的腦血管，導(dǎo)致限定的腦區(qū)域受損所致。一般認(rèn)為全腦缺血與心臟停搏關(guān)系密切，而局灶性腦缺血與急性腦中風(fēng)更加相關(guān)。大量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道GB對(duì)不同種屬動(dòng)物多種腦缺血模型具有保護(hù)作用。

1.1 對(duì)沙土鼠、小鼠腦缺血模型的保護(hù)作用

Spinnewyn B等[3]最早研究GB對(duì)腦缺血的作用，其采用雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎法制備成年沙土鼠全腦缺血-再灌注模型，發(fā)現(xiàn)BN52021（預(yù)先或結(jié)扎時(shí)給藥，10 mg·kg-1，ip或po）可劑量依賴性地拮抗腦缺血的神經(jīng)癥狀，并顯著提高線粒體呼吸功能。結(jié)扎后1 h給藥也可逆轉(zhuǎn)腦損傷。隨后Panetta T等[4]的研究也證實(shí)BN52021可減少沙土鼠缺血-再灌注導(dǎo)致的腦損傷，增加腦血流量，并且降低再灌注90 min時(shí)前腦和中腦游離脂肪酸（FFA）含量。Krieglstein J等[5]在對(duì)EGb及其成分的神經(jīng)保護(hù)作用的研究中指出，GB單體（100 mg·kg-1，sc）對(duì)小鼠的局灶性腦缺血也有保護(hù)作用。

1.2 對(duì)大鼠腦缺血模型的作用

1.2.1 對(duì)大鼠全腦缺血模型 Prehn JH等[6]制備大鼠短暫性前腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)在造模前或造模后1 h給予BN52021（25 mg·kg-1，sc），均可顯著減少大鼠海馬區(qū)和新皮層的損傷。秦兵等[7]采用3條動(dòng)脈夾閉法制備大鼠全腦缺血-再灌注損傷模型，研究GB對(duì)缺血-再灌注神經(jīng)元損傷的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)GB（1～10 mg·kg-1）靜脈給藥能明顯減輕腦組織神經(jīng)細(xì)胞損害。

1.2.2 對(duì)大鼠局灶性腦缺血模型 人的腦血管阻塞以大腦中動(dòng)脈最為常見(jiàn)。阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈后，可引起大腦半球皮層和基底核缺血性損傷，以海馬CA1區(qū)最為敏感，與人的病理改變相似。吳雪豐等[8]采用Longa’s頸內(nèi)線栓法加以改進(jìn)制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞-再灌模型，研究了銀杏內(nèi)酯對(duì)大鼠局灶性腦缺血的作用。研究表明，銀杏內(nèi)酯（含GB 56%）po 10、20、40 mg·kg-1，連續(xù)7 d，可劑量依賴性地改善中動(dòng)脈閉塞所致局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，明顯縮小梗死面積，減輕腦水腫。黃賤英等[9]采用相同模型，探討了單體GB注射液對(duì)大鼠缺血3 h及再灌注21 h的保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示，GB對(duì)缺血3 h大鼠神經(jīng)癥狀無(wú)影響，對(duì)再灌注21 h大鼠神經(jīng)癥狀有明顯的改善作用；GB 10、5 mg·kg-1能明顯降低腦梗死范圍。病理切片檢查結(jié)果表明，GB能減輕缺血側(cè)大腦的水腫及空泡現(xiàn)象。Fang W等[10]采用大鼠腦中動(dòng)脈閉塞模型（MCAO）進(jìn)一步研究血腦屏障對(duì)GB的通透性及GB的治療時(shí)間窗問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血組動(dòng)物血腦屏障對(duì)GB的通透性增高，腦組織內(nèi)GB濃度高于正常組，腦缺血后4 h內(nèi)，即再灌注后2 h內(nèi)靜脈給予GB 8、16 mg·kg-1，可減少梗死面積，減輕腦水腫，發(fā)揮明顯的保護(hù)作用。

1.3 對(duì)低靈長(zhǎng)類動(dòng)物局部血栓性腦缺血模型的作用

李樹(shù)清等[11]采用光化學(xué)法誘導(dǎo)局部血栓形成腦缺血模型，研究GB對(duì)低靈長(zhǎng)類動(dòng)物（樹(shù)鼩）腦缺血的保護(hù)作用。該模型系使用特殊波長(zhǎng)的光束透過(guò)半透明的樹(shù)鼩顱骨與血管內(nèi)的光敏物質(zhì)rosebengal相互作用，在局部產(chǎn)生單線態(tài)氧介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致血小板聚集、血栓形成、血管閉塞。這種腦缺血模型更接近于人類的發(fā)病條件，而且樹(shù)鼩的生物學(xué)特性與人類更相似。研究發(fā)現(xiàn)，于缺血后6 h一次靜脈注射GB能抑制半暗區(qū)神經(jīng)元鈣離子超載，改善局部血流量減少所致的神經(jīng)泵功能紊亂，緩解腦水腫。

2 GB防治腦缺血作用機(jī)制的研究進(jìn)展

腦缺血后病理生理改變有諸多因素參與，如能量代謝耗竭、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基（活性氧和一氧化氮（NO））產(chǎn)生、酸中毒、花生四烯酸產(chǎn)生等。研究表明，GB通過(guò)多種機(jī)制對(duì)腦缺血損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

2.1 改善能量代謝及抗酸中毒

缺血、缺氧使腦組織能量耗竭、細(xì)胞膜Na+-K+泵功能障礙、Ca2+-ATP酶活性降低，導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)失衡，同時(shí)無(wú)氧糖酵解加強(qiáng)，乳酸大量釋放，引起酸中毒，進(jìn)一步加重腦水腫。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，GB能改善大鼠大腦缺血-再灌注損傷時(shí)的能量代謝障礙，升高ATPase活性，改善細(xì)胞內(nèi)、外離子的交換，減少細(xì)胞內(nèi)的Ca2+，增加細(xì)胞內(nèi)的Mg2+，使細(xì)胞的代謝過(guò)程走上良性循環(huán)。GB還能抑制大腦缺血-再灌注造成乳酸脫氫酶（LDH）活力的升高[12]，還可劑量依賴性降低乳酸的含量[8]。

2.2 抑制炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)在腦缺血-再灌注中的作用逐漸引起人們的重視。大量證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)介導(dǎo)了腦缺血-再灌注損傷，過(guò)度的炎癥反應(yīng)不僅影響局部的血液供應(yīng)，而且可以直接破壞組織結(jié)構(gòu)，是造成缺血腦組織損傷的主要原因之一。腦缺血-再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)使血腦屏障受損，加重了腦損害及腦水腫，在此病理生理過(guò)程中有許多炎性因子的參與，如白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α以及E-選擇素（E-selectin）、細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）等。劉永剛等[13]研究GB對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷后炎癥的影響。結(jié)果顯示，GB可降低腦內(nèi) TNF-α與血清 IL-6、IL-1 β含量及 E-selectin、ICAM-1的表達(dá)，提示GB可通過(guò)抑制腦缺血-再灌注過(guò)程中炎癥介質(zhì)的釋放，降低腦缺血-再灌注所致的腦損傷。張雄等[14]研究發(fā)現(xiàn)，GB能顯著抑制大鼠缺血再灌注后12 h腦組織內(nèi)環(huán)氧化酶2（COX-2）基因表達(dá)的增強(qiáng)，提示PAF是COX-2的上游信使，經(jīng)其受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子絲裂原活化蛋白（MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B而調(diào)控COX-2基因的表達(dá)。

2.3 清除自由基及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化

腦缺血期由于糖原、葡萄糖和ATP等的減少，線粒體膜內(nèi)的電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈反應(yīng)大大受阻，中間產(chǎn)物自由基累積。而腦組織缺乏自由基清除系統(tǒng)如SOD、過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等，同時(shí)又富含不飽和脂肪酸，尤易受到自由基攻擊，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，造成神經(jīng)元的功能障礙和病理性損傷。吳雪豐等[8]報(bào)道，銀杏內(nèi)酯可以降低大鼠局灶性腦缺血模型腦組織丙二醛（MDA）水平，降低腦脂質(zhì)過(guò)氧化速率，同時(shí)升高超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）的水平，加快對(duì)組織超氧陰離子自由基的清除。黃賤英等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GB能明顯降低腦梗死范圍，同時(shí)升高SOD活力，減少M(fèi)DA含量及LDH活力，認(rèn)為GB抗腦缺血的作用機(jī)制可能是提高機(jī)體清除自由基能力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、減少自由基的產(chǎn)生。

2.4 抑制NO生成

NO是一種重要的內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)，在許多病理和生理過(guò)程中起著雙重作用。腦缺血可引起胞外興奮性氨基酸增加，從而刺激腦內(nèi)精氨酸代謝生成NO。缺血早期NO迅速升高，但持續(xù)時(shí)間短暫，較少產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。數(shù)小時(shí)及數(shù)天腦缺血，又有繼發(fā)性NO增高，而且它還可與超氧化物反應(yīng)生成羥自由基等活性氧自由基，導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)元損害。Du ZY等[15]報(bào)道單體銀杏內(nèi)酯A和B可抑制脂多糖誘發(fā)的新生大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的NO產(chǎn)生。隨后，Zhao HW等[16]又在大鼠的C6細(xì)胞和人的BT325膠質(zhì)瘤細(xì)胞（均屬星形細(xì)胞）上也證明了這些藥物可抑制NO的產(chǎn)生。Zhao HW等[17]進(jìn)一步研究了過(guò)量NO對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SK-N-SH）的毒性，發(fā)現(xiàn)單體銀杏內(nèi)酯A（GA）和GB可明顯減弱過(guò)量NO導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞凋亡。Xu Y等[18]發(fā)現(xiàn)，BN52021可抑制長(zhǎng)期暴露于PAF的神經(jīng)元中NO合成酶活性，減少過(guò)量NO的神經(jīng)毒性。以上研究證實(shí)，GB可抑制NO合成酶的表達(dá)，減少NO的生成，并能降低過(guò)量NO導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。

2.5 抑制興奮性氨基酸致神經(jīng)元損傷

腦缺血時(shí)PAF的釋放大量增加，PAF可誘發(fā)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)（EAA）如谷氨酸（Glu）釋放增加，增多的EAA通過(guò)激活細(xì)胞膜上N甲基D天冬氨酸（NMDA）受體和代謝性谷氨酸受體，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，引起腦神經(jīng)細(xì)胞的遲發(fā)性壞死。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，GB對(duì)興奮性氨基酸所致的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。Krieglstein J和Prehn JH等[5，6]研究發(fā)現(xiàn)，單體GA和B可減少Glu誘導(dǎo)的雞胚神經(jīng)細(xì)胞和大鼠海馬神經(jīng)元的興奮毒損傷。張穎等[19]研究發(fā)現(xiàn)，樹(shù)鼩海馬微灌流Glu和Ca2+溶液后24 h，線粒體細(xì)胞色素C（Cyt C）含量顯著下降，而胞質(zhì)部分出現(xiàn)Cyt C；海馬組織Caspase-3、Caspase-9 mRNA明顯升高。當(dāng)海馬微灌流Ca2+及Glu后6 h于舌下靜脈注射GB（5 mg·kg-1），可部分防止Cyt C釋放及有效降低微灌流后海馬Caspase-9 mRNA含量，神經(jīng)元存活數(shù)目增多。該實(shí)驗(yàn)揭示GB可防止興奮性氨基酸促發(fā)的Ca2+內(nèi)流，減少線粒體應(yīng)激引起的Cyt C釋放及Caspase-9的活化，對(duì)異常微環(huán)境中的海馬神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用。梅世昌等[20]觀察到GB對(duì)Glu致原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)GB可提高神經(jīng)細(xì)胞活性，扭轉(zhuǎn)Glu致神經(jīng)細(xì)胞存活率的下降。蔡衛(wèi)斌等[21]利用Glu作用于原代培養(yǎng)的胎小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元建立細(xì)胞損傷模型，并觀察了GB的作用。發(fā)現(xiàn)GB能減輕Glu所致的細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)元存活率提高、細(xì)胞形態(tài)的恢復(fù)和DNA斷裂減少，并能減輕Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞Ca2+超載。徐靜等[22]以原代培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元的Glu興奮毒性模型，以預(yù)處理給藥模式觀察了EGb及其單體GB對(duì)Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的影響，發(fā)現(xiàn)EGb761、GB在不同劑量下均能不同程度地提高細(xì)胞存活率、降低凋亡率，對(duì)Glu興奮毒性損害有保護(hù)作用。在預(yù)處理給藥模式的最佳劑量下，GB的保護(hù)效果優(yōu)于EGb761。

2.6 減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中的急性期，細(xì)胞壞死和凋亡并存，而在缺血性腦卒中的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡期，則以細(xì)胞凋亡為主。研究證實(shí)，GB對(duì)神經(jīng)元凋亡具有拮抗作用。Ahlemeyer B等[23]在對(duì)EGb及其成分的抗凋亡實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)24 h血清剝奪后，雞胚神經(jīng)元凋亡比例由12%增加至36%，GB（10 μmol·L-1）可使凋亡比例恢復(fù)至正常。相同濃度的GB可使staurosporine（PKC抑制劑）誘導(dǎo)的雞胚神經(jīng)元凋亡比例由 74%下降至 31%。GB（100 μmol·L-1）可減少staurosporine誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡比例。季秋虹等[24]以原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元，研究了GB對(duì)缺血引起的神經(jīng)元凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)GB預(yù)處理可提高缺血神經(jīng)元的活性，降低凋亡比率，并提出GB抗神經(jīng)元缺血性凋亡的機(jī)制與提高磷酸化糖原合成酶激酶（GSK）-3β、抑制Caspase-3活化有關(guān)。GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸類激酶，含有α和β 2個(gè)亞單位，β亞單位磷酸化后使GSK失活，從而抑制Caspase-3的活化。

2.7 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用

近年研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷后異常活躍，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間存在著復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用，以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腦缺血時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，表現(xiàn)為胞體肥大和細(xì)胞增生，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達(dá)增加?；罨男切文z質(zhì)細(xì)胞一方面產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，利于損傷神經(jīng)元的修復(fù)；另一方面過(guò)度的膠質(zhì)化卻可形成物理屏障，干擾髓鞘和軸索的再生。張敬各等[25]建立光化學(xué)誘導(dǎo)樹(shù)鼩局灶性腦缺血模型，觀察GB對(duì)局灶性腦缺血時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)腦缺血后半暗區(qū)GFAP表達(dá)增多，以24 h最為顯著；GFAP表達(dá)增多與神經(jīng)元受損有關(guān)，光化學(xué)反應(yīng)后6 h于舌下靜脈注射GB（5 mg·kg-1），發(fā)現(xiàn)缺血后24 h半暗區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)明顯下調(diào)，與對(duì)照組相比有顯著差異。GB可通過(guò)減少星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。

2.8 其他作用機(jī)制

趙文杰等[26]觀察GB對(duì)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血1周后大鼠海馬齒狀回顆粒下層、紋狀體、前腦腦室下區(qū)和皮層5-溴脫氧尿嘧啶核（BrdU）標(biāo)記的新生神經(jīng)細(xì)胞數(shù)有所增多，表明腦缺血可促進(jìn)腦組織海馬、紋狀體、側(cè)腦室等部位的神經(jīng)發(fā)生，GB（2、5 mg·kg-1）可以進(jìn)一步促進(jìn)這一神經(jīng)發(fā)生過(guò)程，使新生神經(jīng)細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多，這對(duì)于腦缺血后腦組織的損傷修復(fù)等方面的治療、減少腦血管病引發(fā)的死亡及致殘都有著重要的意義。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，在不同種屬動(dòng)物多種腦缺血模型中，GB顯示了明顯的腦保護(hù)作用，可明顯改善神經(jīng)癥狀、縮小梗死面積、減輕腦水腫。GB通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，如改善能量代謝、抑制缺血后炎癥因子和炎癥反應(yīng)的發(fā)生、抗氧化、降低興奮性氨基酸所致細(xì)胞損傷、抑制NO的生成、減少缺血細(xì)胞凋亡等。

GB是天然的PAF受體拮抗劑，具有強(qiáng)大的抗PAF功能。PAF是一種重要的內(nèi)源性磷脂類介質(zhì)，正常情況下，腦內(nèi)產(chǎn)生的PAF量很少；腦缺血時(shí)，細(xì)胞生物膜進(jìn)行性受損，PAF大量釋出。PAF與受體結(jié)合后，通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起腦損傷，其可能機(jī)制包括：通過(guò)耦聯(lián)的G蛋白激活磷脂酶C（PLC），產(chǎn)生三磷酸甘油（IP3）和甘油二酯（DG），IP3可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，DG可激活蛋白激酶C（PKC），導(dǎo)致細(xì)胞膜功能障礙；促進(jìn)興奮性氨基酸釋放，興奮性氨基酸（EAA）與N-甲基-D-門(mén)冬氨酸（NMDA）受體結(jié)合，致鈣通道開(kāi)放；激活磷脂酶A2（PLA2），使花生四烯酸代謝產(chǎn)物（PGs、TXA2、LTs）大量生成，引發(fā)炎癥反應(yīng)；刺激誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的活化；激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB），誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)。GB抗腦缺血的作用是完全通過(guò)拮抗PAF而產(chǎn)生，還是涉及其他機(jī)制，如清除自由基、抗凋亡、對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用等及其與拮抗PAF有何關(guān)系等，有待于進(jìn)一步闡明。隨著GB抗腦缺血作用的深入研究，其在保護(hù)大腦缺血-再灌注方面將有廣闊的應(yīng)用前景。

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