細(xì)胞自噬和缺血性腦卒中

郭 強(qiáng) 韋 強(qiáng) 邊心超 張金柱 王宏磊 (吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021)

自噬作為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，在腫瘤、老化和神經(jīng)退化等細(xì)胞增殖和死亡紊亂疾病中發(fā)揮著重要的作用。近年來，越來越多的學(xué)者關(guān)注到在缺血性腦卒中不僅有細(xì)胞的凋亡和壞死的參與，尚有細(xì)胞自噬參與其中。本文就細(xì)胞自噬和缺血性腦卒中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 自噬的概念

自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是生命進(jìn)化過程中一種保守的細(xì)胞行為，也是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象。自噬參與了細(xì)胞對持續(xù)性內(nèi)外刺激的非損傷性應(yīng)答反應(yīng)，在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝和功能的平衡方面起重要的作用〔1〕。在細(xì)胞的正常生長和分裂中，必然會出現(xiàn)一些不需要的生物大分子和受損、衰老的細(xì)胞器，而自噬就參與這些物質(zhì)的降解和再利用。通常這些待降解物首先被細(xì)胞內(nèi)單層或雙層膜包裹形成自噬體，然后運(yùn)送到溶酶體形成自噬溶酶體，最后在溶酶體內(nèi)被多種水解酶水解。

首先，水解生成的氨基酸和脂肪酸可以被用來合成新的蛋白質(zhì)或參與能量代謝。而該作用在細(xì)胞應(yīng)對各種不利應(yīng)激的情況下(如營養(yǎng)缺乏、生長因子撤離、輻射等)，尤為重要。通過這種方式細(xì)胞可以獲取制造ATP、保證基本代謝過程的營養(yǎng)物質(zhì)，從而限制其損傷和死亡〔2〕。

其次，通過自噬及時清除多余或損傷的細(xì)胞器，對于穩(wěn)定細(xì)胞的形狀和結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞的正常功能和避免細(xì)胞衰老等至關(guān)重要。再次，消滅致病微生物，并參與抗原遞呈過程〔3〕。但是，自噬的過度發(fā)生可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，從而引起一系列疾病過程〔4〕。這種自噬性程序性細(xì)胞死亡同凋亡(I型程序性死亡)明顯相異，被學(xué)者稱為Ⅱ型程序性死亡〔5〕。

2 細(xì)胞自噬的過程

自噬是胞漿大分子物質(zhì)和細(xì)胞器在雙層膜包囊泡中大量降解的生物學(xué)過程。在此過程中自噬體的形成是關(guān)鍵。其發(fā)生過程大致分為3個階段:

2.1 自噬誘導(dǎo) 在饑餓、氧化應(yīng)激損傷等情況下，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非核糖體區(qū)域、高爾基體等來源的自噬體膜脫落形成杯狀分隔膜，包繞在被降解物周圍〔6，7〕。自噬前體的誘導(dǎo)過程可以是選擇性的，也可以是非選擇性的，分別稱為選擇性自噬和非選擇性自噬，前者是指游離膜結(jié)構(gòu)識別并包裹胞質(zhì)內(nèi)的特殊底物形成自噬體，并將其降解，如Cvt途徑(cytoplasm to vacuole targeting pathway)和過氧化酶體降解(pexophagy)途徑;后者是指隨機(jī)包裹細(xì)胞質(zhì)形成自噬體。釀酒酵母是選擇性自噬的典型的例子，釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)中的Apel蛋白(aminopeptidase 1)通過Cvt途徑直接運(yùn)輸至雙層膜泡結(jié)構(gòu)〔8〕。選擇性自噬主要由細(xì)胞內(nèi)的底物誘導(dǎo)發(fā)生，而非選擇性自噬主要是對細(xì)胞外刺激發(fā)生反應(yīng)的結(jié)果。在饑餓或生長因子缺乏時可誘導(dǎo)非選擇性自噬的發(fā)生。缺氧的信號使mTOR信號途徑失活，從而激活自噬信號途徑。在細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)放大的作用下，Atg相關(guān)蛋白被修飾而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

2.2 自噬體形成 分隔膜逐漸延伸，將要被降解的胞漿成分完全包繞形成自噬體。自噬前體誘導(dǎo)形成后，游離膜結(jié)構(gòu)繼續(xù)與自噬前體結(jié)合，逐漸構(gòu)成自噬體。在Cvt途徑，游離膜以底物作為支架添加到自噬前體上，使自噬前體逐漸形成自噬體。

非選擇性自噬是依靠Atgl2-At95-Atgl6復(fù)合物為支架完成自噬體形成。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Atg12、At95和Atgl6被募集到自噬前體的雙層膜結(jié)構(gòu)上，并形成較大的寡聚復(fù)合體。此決定雙層膜的曲度，并募集含有At98的游離膜結(jié)構(gòu)，使自噬前體雙層膜結(jié)構(gòu)不斷延長，形成自噬體〔9〕。

2.3 自噬體內(nèi)容物的降解 自噬體通過細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體，與之融合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成分，自噬體膜脫落再循環(huán)利用〔10〕。Atgl2-At95復(fù)合物與 Atgl6解聚，At98從自噬體上脫離下來后，自噬體被運(yùn)輸至溶酶體，其外膜與溶酶體膜融合，自噬體內(nèi)膜及其內(nèi)容物進(jìn)入溶酶體腔。在各種酸性酶的催化下，底物降解為氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)。

調(diào)節(jié)上述復(fù)雜的過程的分子水平有五個關(guān)鍵階段〔11〕:(1)形成吞噬泡。(2)At95-12復(fù)合物與Atgl6L多聚化。(3)LC3形成并且插入吞噬泡膜。(4)包繞預(yù)被降解物。(5)自噬體與溶酶體融合〔12〕。

3 自噬的調(diào)控機(jī)制

3.1 依賴mTOR(marnmalian target of rapamycin)途徑的自噬

雷帕霉素靶蛋白mTOR，是一種氨基酸、ATP、生長因子、胰島素等分子的感受器，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，抑制自噬方面起關(guān)鍵性作用。酵母中Ser/Thr蛋白激酶Atgl于其他Atg分子結(jié)合定位于自噬體前膜上。饑餓刺激下，Atgl3去磷酸化，并與Atgl結(jié)合，導(dǎo)致Atgl7依賴性自噬的發(fā)生〔13〕。mTOR活性抑制時，促進(jìn)自噬體形成，在酵母中是通過Atsl和Atgl3去磷酸化而促進(jìn)下游自噬信號，但在人類中的是否為該機(jī)制尚不明了。mTOR活性增強(qiáng)時，通過磷酸化S6KI激活之，進(jìn)而磷酸化核糖體蛋白S6

(p70s6)來促進(jìn)mRNA翻譯，同時促使核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的黏附而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脫落形成自噬體膜。mTOR同時也磷酸化4EBPs并抑制其活性，解除了對真核細(xì)胞翻譯啟動因子elF4E的抑制〔14〕。有研究發(fā)現(xiàn)在氨基酸豐富時，mTOR信號激活，自噬被抑制，S6K1活性增強(qiáng)，增加了mRNA翻譯、蛋白質(zhì)合成。氨基酸缺乏時，原料減少，蛋白質(zhì)合成減少，同時mTOR信號被抑制，自噬增強(qiáng)，S6KI活性減弱，負(fù)反饋IRS/Class I PDK的作用減弱，也增強(qiáng)了自噬〔15，16〕。

3.2 依賴磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)途徑的自噬Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class III PI3K)復(fù)合物(Atg6-Atgl4-Vpsl5-ClassⅢPI3K)在細(xì)胞自噬中扮演重要的角色。它可以將磷脂酰肌醇(PI)磷酸化為3-磷脂酰肌醇(PI3P)，進(jìn)而募集胞漿中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白質(zhì)，用于自噬體膜的形成〔17〕。另外抑癌基因Atg6的哺乳動物同源體beclinl和抑癌基因UVRAG作為自噬正調(diào)控子，抗凋亡因子bcl-2作為自噬負(fù)調(diào)控子共同參與組成Class III PI3K復(fù)合物調(diào)控自噬〔18，19〕。經(jīng)典的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)并非作用于mTOR途徑，而是通過抑制ClassmPI3K的活性從而抑制自噬形成。

3.3 Ras/PKA通路 有研究證實(shí):哺乳動物和酵母細(xì)胞細(xì)胞中Ras/PKA通路可感受細(xì)胞外葡萄糖含量的變化，并影響到自噬基因的表達(dá)。在酵母細(xì)胞中，Ras/PKA通路通過抑制TOR而抑制自噬，表明Ras/PKA通路抑制自噬作用與TOR-Tap42通路平行。Atgl作為PKA的磷酸化底物可能參與到Ras/PKA通路的調(diào)節(jié)當(dāng)中，使Ras/PKA抑制自噬得以實(shí)現(xiàn)。同時酵母細(xì)胞中的sch9與哺乳作用與動物細(xì)胞中的PKB/Akt相似，也參與感受細(xì)胞外葡萄糖水平。

3.4 AMPK途徑 自噬活性對細(xì)胞存活十分重要。在哺乳動物細(xì)胞中，AMPK感受ATP的水平。通過上游激酶LKBl下調(diào)ATP/AMP比例而激活A(yù)MPK?；钚缘腁MPK誘導(dǎo)TSCl/2復(fù)合體磷酸化并有活性，TSCl/2復(fù)合體可通過Rheb抑制mTOR活性。除此之外，LKBl-AMPK使P27磷酸化并有活性，后者可在生長因子缺乏或營養(yǎng)缺乏時阻滯細(xì)胞凋亡而誘導(dǎo)自噬。與AMPK相同，酵母細(xì)胞中的Snfl也可正向誘導(dǎo)自噬。

4 自噬和缺血性腦卒中

自噬(autophagy)是細(xì)胞適應(yīng)惡劣環(huán)境的一種生存機(jī)制，通過這種方式細(xì)胞可以獲取制造ATP、保證基本代謝過程的營養(yǎng)物質(zhì)，從而限制其損傷和死亡。從這一觀點(diǎn)出發(fā)，認(rèn)為自噬具有神經(jīng)保護(hù)作用〔20〕。Puyal和 Clarke〔21〕在大鼠腦缺血模型研究中觀察到，缺血灶周圍腦組織神經(jīng)元中的溶酶體和自噬活動均顯著增強(qiáng)，認(rèn)為自噬活動對缺血周圍腦組織具有保護(hù)作用。有研究表明腦缺血缺氧后，自噬基因ATG7缺失的新生鼠較正常新生鼠能夠有效的減輕腦損傷，不但能夠減少自噬性死亡，而且減少了凋亡;ATG7缺失的成年鼠腦缺血缺氧后，自噬性死亡是海馬錐體細(xì)胞死亡的重要方式〔22〕。Carloni等〔23〕在新生小鼠缺血缺氧性腦損傷模型研究中發(fā)現(xiàn)，腦缺血后海馬和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中的自噬相關(guān)基因Beclin-1表達(dá)上調(diào)，并在24 h達(dá)高峰;同樣，IPC后Beclin-l表達(dá)也顯著上調(diào)。在缺血前20 min經(jīng)側(cè)腦室注入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3.methyladenine，3-MA)可顯著下調(diào)Beclin-l表達(dá)，同時海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元死亡顯著增多;相反，經(jīng)側(cè)腦室注入自噬激活劑雷帕霉素(rapomycin)可顯著上調(diào)Beclin-1表達(dá)，同時海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元死亡顯著減少。最近，Carloni等〔24〕進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活劑雷帕霉素能抑制核糖體s6蛋白激酶(ribosomes 6 protein kinase，pTOS6K)磷酸化以及顯著上調(diào)Beclin-l和LC3表達(dá)，而自噬抑制劑渥曼青霉素(wort，mnnin)可顯著減少Akt和cAMP的應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(eAIVIPresponse element-binding protein，CREB)磷酸化，但不會影響p70S6K磷酸化以及Beclin-I和I.L-3表達(dá)。Tizon等〔25〕證實(shí)，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C，CysC)可以通過抑制哺乳動物mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而保護(hù)小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元。因此認(rèn)為通過調(diào)節(jié)CysC表達(dá)有望為缺血性卒中的一個治療靶點(diǎn)。

但現(xiàn)有的研究結(jié)果卻并不完全一致。因過度激活的自噬會引起Ⅱ型細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，故有學(xué)者又認(rèn)為自噬的激活也是導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的重要原因〔26，27〕。成年大鼠大腦中動脈閉塞模型研究表明，缺血半暗帶區(qū)域的自噬顯著激活，應(yīng)用自噬抑制劑3-MA或巴弗洛霉素A1(bafliomycin A1)阻斷自噬，可使梗死體積顯著縮小，腦水腫和大鼠行為學(xué)損害均得到顯著改善〔28，29〕。Koike 等〔30〕采 用 自 噬 基 因 缺 陷 大 鼠、胱 冬 酶(caspase)-3基因缺陷大鼠以及胱冬酶活化DNA酶抑制大鼠模型來分析腦缺血缺氧性損傷后的神經(jīng)元死亡情況，結(jié)果證實(shí)，自噬基因Atg7表達(dá)陰性的大鼠海馬錐體細(xì)胞自噬受到明顯抑制，同時海馬區(qū)神經(jīng)元死亡較對照組明顯減少。由此推測，自噬的產(chǎn)生可能會加重神經(jīng)元損害，促進(jìn)其死亡，從而對自噬在腦缺血后的保護(hù)作用提出了質(zhì)疑。因此，自噬在腦缺血缺氧性損害中的確切作用仍然存在爭議，自噬是加重還是減輕缺血后神經(jīng)元損害尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

5 展望

隨著國內(nèi)外學(xué)者對細(xì)胞自噬在心腦血管缺血缺氧、缺血再灌注及細(xì)胞凋亡等方面的研究，自噬同腦卒中的密切關(guān)系正被人們發(fā)現(xiàn)并重視。對腦卒后缺血半暗帶的保護(hù)一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，而自噬在腦缺血半暗帶病理生理變化中扮演著重要的角色。相信隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)一步深化，我們能夠找到自噬通路中某些關(guān)鍵的靶點(diǎn)。通過這些關(guān)鍵點(diǎn)我們可能成功逆轉(zhuǎn)某些卒中病人的神經(jīng)功能損害，為人類的健康作出里程碑式的貢獻(xiàn)。

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