胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞的研究進(jìn)展

秦厲梅 劉黎青 周盛年 王 媛 (山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 50355)

帕金森病、阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化病、脊髓損傷、腦外傷、腦卒中等均由于分化成熟的神經(jīng)細(xì)胞不能分裂增殖，無(wú)法彌補(bǔ)損傷或死亡的細(xì)胞。這些疾病的病理表現(xiàn)無(wú)一例外都涉及神經(jīng)細(xì)胞的丟失，且丟失的細(xì)胞得不到新生細(xì)胞的補(bǔ)充，故治療這些疾病的最佳途徑就是誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞分化形成各種類型的神經(jīng)細(xì)胞，然后進(jìn)行細(xì)胞移植治療，以替代那些丟失的細(xì)胞，使神經(jīng)功能恢復(fù)。1998年Thomson等和Gearhart各自成功建立了人的胚胎干細(xì)胞(ESC)系，使人們看到了用ESC治療人類疑難疾病的曙光。自從建系以來(lái)，ESC的研究領(lǐng)域取得了不少可喜的成績(jī)。目前大部分ESC體外誘導(dǎo)分化的細(xì)胞類型主要集中在心肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等，而ESC的神經(jīng)誘導(dǎo)分化一直是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)〔1〕，故本文將近年來(lái)ESC向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究進(jìn)行綜述。

1 ESC的來(lái)源及特性

ESC是來(lái)源于著床前囊胚期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cellmass，ICM)或早期胚胎原始生殖嵴的原始生殖細(xì)胞(primordialgerm cell，PGC)的一種多潛能細(xì)胞，具有體外無(wú)限增生和高度自我更新能力的兩個(gè)顯著特征〔2〕。

形態(tài)學(xué)上，ESC具有與早期ESC相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁，胞核中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)少，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長(zhǎng)。用堿性磷酸酶染色，ESC呈棕紅色，而周圍的成纖維細(xì)胞呈淡黃色。細(xì)胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細(xì)胞彼此界限不清，細(xì)胞表面有折光較強(qiáng)的脂狀小滴。細(xì)胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈島狀或巢狀。

ESC系的特征包括:①能大量繁殖并保持未分化狀態(tài);②在一定條件下具有向3個(gè)胚層組織和細(xì)胞分化的全能性;③能夠形成嵌合體動(dòng)物，即ESC具有種系傳遞功能;④易于進(jìn)行基因改造操作〔3〕。

2 ESC向神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

2.1 ESC體內(nèi)向神經(jīng)細(xì)胞的分化 ESC植入機(jī)體后的分化方向受局部微環(huán)境的影響較大。將維甲酸(RA)誘導(dǎo)后的小鼠B5 ESC植入視網(wǎng)膜變性的rd1小鼠的玻璃體，6 w后可觀察到植入細(xì)胞已經(jīng)整合到視網(wǎng)膜內(nèi)層，達(dá)到與視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞組成一致的情況:大多數(shù)分化為神經(jīng)元，少量為星形膠質(zhì)細(xì)胞，并且沒(méi)有少突膠質(zhì)細(xì)胞形成〔4〕。將用RA特定處理的ESC移植到脫髓鞘模型的大鼠背側(cè)脊髓，一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)大量的ESC存活并且在髓鞘部位分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞，形成髓鞘〔5〕。

2.2 ESC體外向神經(jīng)細(xì)胞的分化

2.2.1 RA誘導(dǎo) RA在ESC誘導(dǎo)分化過(guò)程中起了非常關(guān)鍵的作用。RA誘導(dǎo)的細(xì)胞表現(xiàn)了多種神經(jīng)細(xì)胞特征。在經(jīng)過(guò)4 d的RA誘導(dǎo)后，ESC出現(xiàn)了神經(jīng)樣細(xì)胞:細(xì)胞胞體小，并有一些長(zhǎng)的突起。單抗染色細(xì)胞表達(dá)了神經(jīng)微絲的M亞單位及Ⅲ型β－微管蛋白。與神經(jīng)功能密切相關(guān)的蛋白基因也在誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，如神經(jīng)遞質(zhì)合成酶(GAD和TH)、遞質(zhì)受體亞單位(GluRs)和細(xì)胞骨架亞單位(NF－1)。電生理也顯示了細(xì)胞具有與神經(jīng)遞質(zhì)功能性受體有關(guān)的電壓控制的Na+、K+、Ca2+的離子通道〔6〕。

2.2.2 基質(zhì)細(xì)胞源性誘導(dǎo)法(SDIA) SDIA可將小鼠ESC向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化。將小鼠的ESC與骨髓來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞(PA6)放在一起共同培養(yǎng)1 w，90%以上的ESC可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)元〔7，8〕。SDIA法不但操作起來(lái)簡(jiǎn)單，而且其中的神經(jīng)分化快速有效，經(jīng)SDIA處理的小鼠ESC可分化為含量高達(dá)30%的中腦多巴胺能神經(jīng)元，將其植入小鼠體內(nèi)后不僅可以存活，還能與宿主細(xì)胞建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)〔9〕。

2.2.3 生長(zhǎng)因子誘導(dǎo) 在ESC體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入特定的生長(zhǎng)因子后，能促進(jìn)ESC向特定神經(jīng)細(xì)胞分化，如白血病抑制因子(LIF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、成纖維生長(zhǎng)因子－2(FGF－2)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)和胰島素等〔10，11〕。卵磷脂－腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(PCBDNF)比BDNF對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞有更好的親和力，它可以通過(guò)加強(qiáng) TrkB受體表達(dá)，提高 Mash－1、p35、NF68的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)的分化〔12〕。

2.2.4 應(yīng)用譜系限制性發(fā)育控制基因控制ESC向神經(jīng)分化

譜系選擇就是用某種神經(jīng)干細(xì)胞所含的基因轉(zhuǎn)染ESC，選擇性的剔除不含譜系限制性基因的細(xì)胞，通過(guò)促進(jìn)特定基因表達(dá)來(lái)獲得純的細(xì)胞系。在ESC體外培養(yǎng)的早期即可有效快速誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化，其作用強(qiáng)于RA。

核受體相關(guān)因子－1(Nurr1)是基因轉(zhuǎn)錄因子的一種，其可促進(jìn)中腦神經(jīng)前體細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元。將全長(zhǎng)的大鼠Nurr1 cDNA克隆到質(zhì)粒中，再將小鼠ESC轉(zhuǎn)染，使得分化細(xì)胞TH陽(yáng)性率從5%上升到50%〔13〕。

2.2.5 中藥誘導(dǎo) 有研究證明經(jīng)典補(bǔ)益中藥淫羊藿(Herba Epimedii)誘導(dǎo)ESC分化為神經(jīng)干細(xì)胞的過(guò)程中，采用Western印跡法對(duì)神經(jīng)細(xì)胞特異性蛋白膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)、神經(jīng)元特異性骨架蛋白 β－TublinⅢ進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著ESC的分化發(fā)育，ChAT、β－TublinⅢ的表達(dá)呈逐漸增加的趨勢(shì)。β－TublinⅢ在懸浮培養(yǎng)至第8天的擬胚體中表達(dá)明顯增加，貼壁分化5 d后，表達(dá)量繼續(xù)增加，后趨于穩(wěn)定;膽堿能神經(jīng)標(biāo)志蛋白ChAT則在貼壁分化5 d后明顯增加，后趨于穩(wěn)定。這些證據(jù)提示了神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的時(shí)間依賴性，貼壁分化的前5 d是藥物誘導(dǎo)ESC分化為神經(jīng)細(xì)胞的關(guān)鍵時(shí)間窗。淫羊藿素(icaritin，ICT)處理組細(xì)胞ChAT蛋白表達(dá)量比溶劑對(duì)照組高，提示ESC能夠分化發(fā)育為膽堿能神經(jīng)，ICT對(duì)此過(guò)程具有一定的促進(jìn)作用。

淫羊藿的主要成分淫羊藿苷(icaritin，ICA)為異戊烯基黃酮苷類化合物，其在體內(nèi)的代謝組分為淫羊藿素(ICT)和去甲淫羊藿素(desicaritin，DICT)，ICT具有促進(jìn)ESC體外定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用，ICT引起的p38的低磷酸化水平是ICT誘導(dǎo)ESC分化為神經(jīng)細(xì)胞的可能機(jī)制〔14〕。

3 ESC的研究前景

近年來(lái)ESC來(lái)源的細(xì)胞在移植領(lǐng)域的研究逐漸成為一個(gè)焦點(diǎn)。ESC誘導(dǎo)形成的神經(jīng)細(xì)胞可作為細(xì)胞移植的最佳對(duì)象。隨著社會(huì)老齡化的到來(lái)，神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病在人類疾病中的比重越來(lái)越大。通常認(rèn)為，神經(jīng)細(xì)胞不可再生，故以往的研究基本都集中在改善神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀并防止進(jìn)一步損害的治療方法上。ESC能夠成功誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療打開(kāi)了嶄新的一頁(yè)。但此技術(shù)如果應(yīng)用到臨床上，其所需要的細(xì)胞來(lái)源必須具備:供體細(xì)胞來(lái)源豐富，安全可靠，純度較高，移植的細(xì)胞能產(chǎn)生所需的神經(jīng)譜系細(xì)胞，且不產(chǎn)生免疫排斥等條件〔15〕。

添加誘導(dǎo)劑RA后的神經(jīng)誘導(dǎo)效率很高，可達(dá)90%以上，但是誘導(dǎo)后的細(xì)胞成分不純，雜細(xì)胞太多，存在的神經(jīng)細(xì)胞大多是神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且神經(jīng)元所占的比例不大。SDIA雖然操作簡(jiǎn)單，神經(jīng)分化也快速有效，但在機(jī)體應(yīng)用卻不太方便。生長(zhǎng)因子造價(jià)高，費(fèi)用昂貴，不適宜大規(guī)模的推廣應(yīng)用。應(yīng)用譜系限制性發(fā)育控制基因控制ESC向神經(jīng)細(xì)胞分化的方法則要求必須將基因插入到基因組的正確位置和分化的恰當(dāng)階段活化，才能獲得想要的結(jié)果。并且由于人為地介入基因組可能導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致下游基因的異常表達(dá)。

利用中藥誘導(dǎo)ESC向神經(jīng)細(xì)胞分化具有操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景，但中藥誘導(dǎo)出的神經(jīng)細(xì)胞是不是具有神經(jīng)細(xì)胞所具有的完整的功能，是否可完全替代機(jī)體的細(xì)胞等問(wèn)題，都有待進(jìn)一步的研究和探討。中醫(yī)藥博大精深，中藥制劑尤其是中藥湯劑或提取液進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)還并不普遍，如果加強(qiáng)這方面的研究，必將取得可喜的成績(jī)。相信ESC誘導(dǎo)形成神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)用前景是不可估量的，它必將在臨床應(yīng)用中發(fā)揮巨大作用。

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