ELISA法檢測乙肝標志物的臨床應用

趙遼群

陜西省延安市婦幼保健院檢驗科，陜西 延安 716000

乙肝兩對半又稱乙肝五項，為國內常用的乙肝病毒（HBV）感染的檢測血清標志物。乙肝病毒免疫學標記有表面抗原（HBsAg）和表面抗體（抗 HBs或 HBsAb）、e 抗原（HBeAg）和e抗體（抗HBe或HBeAb）、核心抗原（HBcAg）和核心抗體（抗HBc或HBcAb）[1]，可檢測患者是否感染乙肝及感染的具體情況。隨著現(xiàn)代臨床免疫學的發(fā)展，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）因其操作簡單、靈敏度高、特異性高等特點而廣泛應用于乙肝五項的檢測[2]。但由于乙肝標志物檢測生產(chǎn)試劑廠家較多，各種試劑診斷靈敏度及特異性相差很大。因此如何選擇靈敏度高、特異性好的乙肝標志物檢測試劑成為乙肝檢測中至關重要的問題之一。本研究分別選擇3家國產(chǎn)ELISA試劑盒對來我院參加健康體檢患者血液樣品進行乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）檢測，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2005年6月～2010年11月健康體檢患者220例，其中，男140例，女80例；年齡23～50歲，平均38.5歲。抽取患者靜脈血，分離血清，低溫（15℃）保存待檢。

1.2 方法

1.2.1 檢測試劑 檢測試劑盒分別購自上海江萊生物科技有限公司（簡稱江萊），北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司（簡稱萬泰）、英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司（簡稱新創(chuàng)）。其中包括96孔（48人份）酶標板，陰性對照1 mL，陽性對照1 mL，酶結合物6 mL，顯色劑A 6 mL，顯色劑B 6 mL，20倍洗滌液40 mL，終止液6 mL，說明書1份，不干膠3張，自封袋1個。抗HBV金標試紙條購自新創(chuàng)。

1.2.2 檢測儀器 振蕩器（型號ZD-8800），磁力攪拌器（型號JB90-D）均購自上海精密儀器儀表有限公司，酶標儀購自鄭州安圖生物工程有限公司，型號：Anthos2010。

1.2.3 檢測方法 采用ELISA法檢測。嚴格按照試劑盒操作步驟進行，即：①使用前，充分混勻所有試劑，勿產(chǎn)生泡沫。②根據(jù)待測樣品數(shù)量確定所需酶標板數(shù)量。每次實驗設空白對照孔1孔，陰性對照、陽性對照各2孔。待檢標本用稀釋液1∶1稀釋后加入50 μL于酶標板反應孔內。采用棋盤法做倍比稀釋，使標本濃度依次為 40、20、10、5.0、2.5、1.25、0 IU/L。 同樣方法稀釋陰性血清。③加入稀釋好后的標準品及陰性血清50 μL于反應孔，待測樣品50 μL于反應孔內，立即加入50 μL的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃孵育1 h。④甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作5次。⑤每孔加入80 μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃孵育30 min。⑥重復步驟④1次。⑦每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10 min。避免光照。⑧取出酶標板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后應立即測定結果。⑨在450 nm波長處測定各孔的OD值。分別用3個不同公司的試劑盒進行初測，初測ELISA陽性標本再采用膠體金法測定1次。金標試紙條于檢測線及對照線位置處各出現(xiàn)一條紫紅色線條為陽性，只于對照線位置出現(xiàn)1條紫紅色線條為陰性，未出現(xiàn)任何線條表示金標試紙條失效。

1.3 結果判定及觀察項目

測定孔OD值/陰性對照孔OD值（S/N）大于2.1判為陽性。比較3個不同公司ELISA檢測靈敏度、特異性及與膠體金法檢測的一致性。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

江萊、萬泰、新創(chuàng)三家廠家生產(chǎn)的試劑盒檢測HBsAg陽性率分別為 12.3%（27/220）、9.5%（21/220）、13.6%（30/220）。 新創(chuàng)陽性率最高。陽性血清經(jīng)金標試紙條檢測陽性結果分別為24、18、27例。新創(chuàng)試劑盒ELISA法檢測抗原包被濃度為1.25 IU/L時，仍可檢出陽性標本。其他兩個試劑盒最低檢出濃度為 2.5 IU/L，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.25，P ＞ 0.05）。

3 討論

慢性乙型肝炎為世界性醫(yī)學難題之一，為世界范圍內引起慢性肝臟疾病的主要病原之一，起病緩慢，感染率高，我國為HBV感染的主要流行病區(qū)，截至2011年有慢性HBV攜帶者約1.2億，慢性乙型肝炎患者約3 000萬例，以每年新增病例10萬～25萬的速度增長。大多數(shù)患者無明顯癥狀，并可導致肝硬化、肝癌等終末期肝病，目前尚無治療特效藥。主要通過血液、母嬰及性接觸傳播。乙肝疫苗為控制及預防乙型肝炎的主要措施。HBsAg血清中HBsAg陽性是HBV感染的標志。本身有抗原性，無傳染性。但由于HBsAg常與HBV同時存在，通常認為是傳染性標志之一。HBV標志物檢測是臨床診斷乙肝感染的重要依據(jù)，也是抗病毒治療檢測的重要指標之一。臨床通常采用免疫學檢測及核算檢測兩類方法進行。基于免疫學檢測的酶聯(lián)免疫吸附試驗因操作方便、靈敏度高、特異性好而較多用于乙肝患者的初篩。

膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，由于靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，在弱堿性環(huán)境下可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固結合，這種結合為靜電結合，不影響蛋白質的生物學性質[3]。單克隆抗體包被于檢測線處，抗金標抗體包被于對照線處，金標抗體吸附于固相載體無紡紗上。利用抗原抗體特異性結合的免疫反應原理，在檢測線處形成抗體-待測抗原-金標抗體復合物，在對照線處形成抗金標抗體-金標抗體復合物。具有特異性強、靈敏度高、使用方便等優(yōu)點。但常因判斷結果時間不夠、反應不充分、溫度低、樣本加樣問題、過濾膜破損等原因導致判斷失誤，也可因臨床醫(yī)師經(jīng)驗不足把隱約可見的陽性線誤判為陰性等不正常結果發(fā)生。

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測HBV抗體為較簡便、快速的檢測方法。臨床檢測通常檢測HBsAg及HBsAb[4]。HBsAg為病毒外膜蛋白的重要組成成分，為HBV感染的最主要的血清學檢測指標。HBsAg陽性提示HBV現(xiàn)癥感染，陽性持續(xù)時間超過6個月則為慢性HBV感染。目前國內HBsAg檢測使用的ELISA法多為定性檢測，只能初步判斷陰性或者陽性，也有半定量檢測的ELISA試劑盒，通常以信號/臨界值（singal/cut-off，S/CO）或臨界指數(shù)表示。ELISA試劑盒評價指標為檢測靈敏度及檢測廣譜性[5]。目前國產(chǎn)HBsAg ELISA試劑盒靈敏度在 0.2～0.5 U/mL之間。HBV 9種不同血清型 ayw1、ayw2、zyw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq+、adwq-，分別位于 HB-sAg第2、3跨膜區(qū)親水區(qū)的a表位為各血清型病毒共有的免疫優(yōu)勢表位。正是由于不同血清型a表位氨基酸組成的差異，導致同一試劑對不同血清型病毒檢測能力存在差異。本組研究中新創(chuàng)公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒靈敏度略高于其他兩個公司，差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。不同廠家生產(chǎn)的ELISA試劑盒檢測HBsAg結果存在不一致性，可能與廠家用于檢測時包被的乙肝病毒基因片段不一致有關。

本組實驗結果表明，不同廠家ELISA試劑盒檢測結果存在差異，臨床檢測時需綜合幾個試劑盒結果及其他試驗進行驗證。

[1]顧志冬，吳倩文，馮曉靜，等.用于國產(chǎn)一步法HBsAg ELISA試劑及確認試驗試劑的改進方法[J].檢驗醫(yī)學，2011，26（1）：32-35.

[2]陳慧英.對應用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測肝炎病毒血清標志物臨界結果報告的探討[J].檢驗醫(yī)學，2006，21（Z1）：54-56.

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[4]孫寶春，付春祥.三種不同廠家試劑檢測血清HBsAg、HBsAb結果比較[J].山東醫(yī)藥，2010，50（27）：89.

[5]李蘭娟.努力提高我國病毒性肝炎的實驗室診斷水平[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2007，30（8）：845-849.