蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)及在腫瘤診斷中的應(yīng)用

?，摤?姜蘭香 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

目前隨著人類基因序列破譯相繼完成〔1〕，蛋白質(zhì)組研究已成為目前生命科學(xué)發(fā)展中不可或缺的一部分。相同基因在不同條件、不同時(shí)期可能會(huì)引起完全不同的作用，加上翻譯后修飾作用如磷酸化、糖基化、乙?；?、羥基化以及蛋白質(zhì)自剪接等，都會(huì)使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能發(fā)生變異。蛋白質(zhì)的變異與疾病的發(fā)生關(guān)系最為密切，通過對(duì)正常及病理個(gè)體之間的蛋白質(zhì)組的比較和分析，從中找出某些疾病的特異性蛋白質(zhì)分子，可能成為疾病尤其是腫瘤的早期診斷的分子標(biāo)志。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到腫瘤生物學(xué)的研究中，以尋找腫瘤標(biāo)志物為目的，以蛋白質(zhì)組學(xué)方法為手段，結(jié)合腫瘤分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究與腫瘤檢測(cè)、診斷等臨床研究，最終產(chǎn)生出能應(yīng)用于臨床的腫瘤檢測(cè)和治療的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)經(jīng)歷了表達(dá)譜、修飾譜到活性譜的進(jìn)化過程，在不同的層面上揭示腫瘤可能的致病機(jī)制。本文概述了近年來在常見的惡性腫瘤中進(jìn)行的腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究，應(yīng)用各種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)方法，找到了大量的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)概念

蛋白質(zhì)組是指細(xì)胞、組織或基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)是運(yùn)用各種技術(shù)手段分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律〔2〕。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)

目前蛋白質(zhì)組技術(shù)主要涉及雙向電泳(2-DE)及質(zhì)譜(MS)技術(shù)對(duì)蛋白進(jìn)行分離、分析及鑒定〔3〕。細(xì)胞蛋白質(zhì)通過高分辨率的雙向凝膠電泳的圖譜時(shí)經(jīng)掃描儀掃描并使之?dāng)?shù)字化，運(yùn)用二維分析軟件對(duì)數(shù)字化的圖譜進(jìn)行各種圖像分析。一種細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)組經(jīng)雙向電泳后可分離到幾千甚至上萬種蛋白質(zhì)，尚需質(zhì)譜技術(shù)去鑒定。從質(zhì)譜技術(shù)測(cè)得的完整蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、蛋白質(zhì)的肽質(zhì)譜(或稱肽質(zhì)譜指紋，peptide mass fingerprint)以及部分肽序列等數(shù)據(jù)通過相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜尋來鑒定蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)定性和定量分析的基礎(chǔ)上，建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.1 2-DE 基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的差異而使之進(jìn)行第一相等電聚焦(IEF)，然后按照其相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)第二相電泳分離，使相同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)得以分離。

2.2 MS技術(shù) MS技術(shù)的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)生化特性不同，選擇性地從待測(cè)生物樣品中捕獲配體，將其結(jié)合在芯片的固相基質(zhì)表面上，利用激光脈沖輻射使芯片表面的分析物解析成帶電離子，質(zhì)荷比不同的離子在電場(chǎng)中飛行時(shí)間不同，據(jù)此繪制出質(zhì)譜圖。結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的快速鑒定和高通量篩選。

2.3 生物信息 在蛋白質(zhì)組分析的各個(gè)水平都需要生物信息工具。隨著2-DE、MS等技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中產(chǎn)生的信息量將越來越大。單靠人工去分析處理是不可能完成的，現(xiàn)在已有眾多的軟件應(yīng)用于2-DE進(jìn)行圖像掃描、剪輯、對(duì)比，如2-DE Analysis Software等。2-DE所得到的大量蛋白質(zhì)組圖譜，以及MS分析得到的蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)、生理、病理數(shù)據(jù)都可以通過互聯(lián)網(wǎng)查詢。目前swiss prot和TrEMBL蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)已成為重要的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)資源。有利于研究者分析已鑒別的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾三維結(jié)構(gòu)、生化特性等。另外肽MS結(jié)合環(huán)境參數(shù)，如等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量、化學(xué)修飾等可在Swiss prot和TrEMBL等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找可與其匹配的蛋白質(zhì)序列。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用

在腫瘤發(fā)病過程中，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為基因和環(huán)境都起著關(guān)鍵性的作用?，F(xiàn)已證明許多蛋白質(zhì)在腫瘤皮損中均表達(dá)異常，這與腫瘤的發(fā)病相關(guān)。這些蛋白質(zhì)主要是一些小分子蛋白質(zhì)及磷酸化異常的蛋白質(zhì)。通過2-DE方法分離正常皮膚、腫瘤的蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)染色和分析軟件的處理得到差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，對(duì)這些蛋白質(zhì)點(diǎn)用MS技術(shù)分析和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索鑒定出該蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)即可成為腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志。

3.1 在肺癌診斷中的應(yīng)用 Chen等〔4〕運(yùn)用2-DE聯(lián)合MS鑒定技術(shù)，通過對(duì)93例肺腺癌組織和10例正常組織的蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)了抗氧化酶 AOE372、ATP合酶亞基 d(ATP5D)、β1，4半乳糖轉(zhuǎn)移酶、胞漿無機(jī)化焦磷酸酶、糖調(diào)節(jié)Mr58000蛋白、谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶M4、脯氨酰4羥化酶β亞基、磷酸丙糖異構(gòu)酶以及反巰基酯酶(UCHL1)等9個(gè)肺腺癌潛在標(biāo)志物。Okano等〔5〕則聯(lián)合多維液相色譜與2-DE技術(shù)，對(duì)5例肺癌患者的血漿在去除高豐度蛋白后行蛋白組學(xué)的分析，并與4例正常對(duì)照，發(fā)現(xiàn)包括α-1-酸糖蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、叢生蛋白及肌動(dòng)蛋白等58種基因表達(dá)產(chǎn)物在兩者血漿中存在著差異表達(dá)。

3.2 在乳腺癌診斷中的應(yīng)用 Vercoutter-Edouart等〔6〕發(fā)現(xiàn)在35個(gè)癌變組織中，14-3-3σ在人類乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)量都下調(diào)了約10倍，而14-3-3α，β，δ，ζ，的量沒有明顯的變化。從而說明在癌變過程中僅14-3-3σ在起作用，因此14-3-3σ可以作為診斷乳腺癌的潛在分子靶標(biāo)。Page等〔7〕從封閉期人類乳腺中分離純化出乳腺管腔細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞，然后提取乳腺癌患者與正常人的這兩種細(xì)胞的蛋白質(zhì)，經(jīng)2-DE技術(shù)分離，MS鑒定出了51個(gè)具有兩倍或兩倍以上差異的蛋白質(zhì)，其中包括cytokeratin 5、17、19;annexin II;熱休克蛋白 60、27 等。這些差異蛋白都有望成為生物分子靶標(biāo)。

3.3 在卵巢癌診斷中的應(yīng)用 Morita等〔8〕利用差異熒光顯示凝膠電泳和MS分析技術(shù)對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVISE，OVTOKO和MCAS相關(guān)蛋白質(zhì)群進(jìn)行了鑒定，共檢測(cè)到18個(gè)上調(diào)和31個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，它們?cè)趦蓚€(gè)卵巢透明細(xì)胞癌(CCA)細(xì)胞系和對(duì)照MCAS細(xì)胞系中的表達(dá)至少有兩倍的差異。隨后使用來自CCA病人的外科樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述鑒別出的差異蛋白質(zhì)在真實(shí)組織中的表達(dá)確有差異，與其在CCA培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)水平一致;表明蛋白質(zhì)組學(xué)方法能夠鑒定不同組織類型的卵巢癌相關(guān)蛋白，這些蛋白質(zhì)有可能成為不同組織類型的卵巢癌如CCA的診斷標(biāo)記物和治療靶標(biāo)。

3.4 在肝癌診斷中的應(yīng)用 Zinkin等〔9〕應(yīng)用MS技術(shù)鑒別出一些肝癌患者血清的腫瘤標(biāo)志，比較其與甲胎蛋白(AFP)、糖化AFP-L3片段以及PIVKA2的敏感性和特異性，41個(gè)丙型肝炎病毒(HCV)感染相關(guān)肝癌病人和51個(gè)HCV感染的肝硬化病人做比較，發(fā)現(xiàn)11個(gè)蛋白質(zhì)高峰，其中包括半胱氨酸蛋白酶抑制劑C，這些腫瘤標(biāo)志診斷的敏感性和特異性分別是79%和86%。與其他腫瘤標(biāo)志相比，主要是能鑒別出小于2 cm的腫瘤，表明蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒別出的標(biāo)志易于區(qū)分HCV感染相關(guān)的肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)小腫瘤。許多相關(guān)研究鑒別和篩選出了一些血清肝癌標(biāo)志，如富含亮氨酸的A2 AFP和A1抗胰蛋白酶、熱休克蛋白27、補(bǔ)體C3a、載脂蛋白A1前體、血清淀粉樣蛋白A、嗜中性激活肽等〔10〕。這對(duì)肝癌的早期監(jiān)測(cè)有重要的指導(dǎo)意義。

3.5 在膀胱癌診斷中的應(yīng)用 鈣網(wǎng)素(CRT)的一般生物學(xué)特性：CRT是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，是首先在四肢肌肉細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)中發(fā)現(xiàn)的一種鈣結(jié)合蛋白，后來在非肌肉細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。據(jù)報(bào)道〔11～13〕，CRT并不特異地存在于膀胱癌。在非膀胱癌患者的尿路感染人群中有極高的陽性率(88%)。因此用CRT診斷膀胱癌需排除尿路感染。此外CRT在其他各種腫瘤中也存在。在鄰近尿路的泌尿系腫瘤包括腎細(xì)胞癌、前列腺癌也發(fā)現(xiàn)CRT，但它們的陽性率比膀胱癌低。乳腺癌患者乳腺組織與正常組織相比CRT升高，但尿液CRT陽性率比膀胱癌低得多，根據(jù)多數(shù)學(xué)者推測(cè)只有有活力的腫瘤細(xì)胞才能分泌CRT入尿。對(duì)早期檢測(cè)膀胱癌起重要的指導(dǎo)意義。

3.6 在前列腺癌診斷中的應(yīng)用 血清前列腺特異抗原(PSA)作為最有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物廣泛應(yīng)用于前列腺癌的診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后判斷，使前列腺癌的診治效果得到了很大的提高。然而PSA畢竟是一個(gè)組織特異性而非腫瘤特異性的標(biāo)志物，受諸多因素影響，在某些疾病特定狀態(tài)下缺乏足夠的敏感性和特異性，所以，當(dāng)PSA被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的篩選、診斷及預(yù)后判斷時(shí)，出現(xiàn)敏感性差和特異性低的現(xiàn)象也就可以理解了〔14〕。Zheng等〔15〕利用SELD-I技術(shù)，分析了22例前列腺癌根治術(shù)切除標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊蛋白Pca224，其平均分子質(zhì)量為(24 782 156±107 127)m/z，并應(yīng)用激光捕獲微解剖技術(shù)(LCM)，進(jìn)一步證實(shí)了Pca224蛋白來源于前列腺癌細(xì)胞。Pan等〔16〕采用SELD-I蛋白質(zhì)芯片技術(shù)分析了83例前列腺癌病人和95例正常對(duì)照者血清樣本，發(fā)現(xiàn)了18個(gè)血清差異蛋白峰，其中4個(gè)蛋白峰在前列腺癌病人血清中水平升高，14個(gè)蛋白峰在前列腺癌病人血清中水平下降，選取8個(gè)標(biāo)志蛋白用于建立前列腺癌診斷的分類樹模型，得到4層分類樹，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，診斷的敏感性達(dá)到92%，特異性達(dá)到96.7%，研究表明這是一項(xiàng)有前途的早期診斷前列腺癌準(zhǔn)確率高且無創(chuàng)的方法。

3.7 在惡性黑素瘤診斷中的應(yīng)用 高天文等〔17〕通過激光共聚焦顯示Foxp3分子定位于黑素瘤細(xì)胞的胞核和核周部位。黑素瘤組織病理切片的免疫組織化學(xué)證實(shí)Foxp3表達(dá)于黑素瘤細(xì)胞的胞核和核周，皮內(nèi)痣的黑素瘤細(xì)胞未檢測(cè)到Foxp3的表達(dá)，最后得出結(jié)論：黑素瘤細(xì)胞系及黑素瘤組織中的黑素瘤細(xì)胞普遍存在于Fopx3的表達(dá)，而原代培養(yǎng)和皮內(nèi)痣組織中的黑素瘤細(xì)胞未檢測(cè)到Fopx3的表達(dá)。

4 展望

隨著現(xiàn)代生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，必將在蛋白質(zhì)組時(shí)代發(fā)揮更大更重要的作用。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種生命科學(xué)包括細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物等學(xué)科在臨床研究中，2-DE聯(lián)合MS技術(shù)已在多種腫瘤研究中展開，隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷革新，相信在不久的將來，通過各種蛋白質(zhì)組學(xué)的各項(xiàng)技術(shù)能發(fā)掘出更新、更多的腫瘤標(biāo)志物，進(jìn)一步揭開腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及耐藥機(jī)制，為腫瘤特別是惡性腫瘤的早期診斷、靶向治療和新藥開發(fā)將提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 曹志成，余堅(jiān)文，梁榮能.蛋白質(zhì)組學(xué)-引領(lǐng)后基因組時(shí)代〔J〕.中國(guó)生物工程雜志，2005;25(1)：33-8.

2 Merchant M，Weinberger SR.Recent advancements in surface-enhanced laser desorptionionizafion-time of flight-mass spectrometry〔J〕.Electrophoresis，2000;21(6)：1164-77.

3 肖育紅，周 敏.蛋白質(zhì)組學(xué)及其在生殖醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·計(jì)劃生育/生殖健康分冊(cè)，2006;25(2)：60-4.

4 Chen G，Gharib TG，Huang CC，et al.Proteomic analysis of lung adenocarcinoma：identification of a highly expressed set of proteins in tumors〔J〕.Clin Cancer Res，2002;8(7)：2298-305.

5 Okano T，Kondo T，Kakisaka T，et al.Plasma proteomics of lung cancer by a linkage of multi-dimensional liquid chromatography and two-dimensional difference gel electrophoresis〔J〕.Proteomics，2006;6(13)：3938-48.

6 Vercoutter-Edouart AS，Lemoine J，Le Bourhis X，et al.Proteomic analysis reveals that 14-3-3Sigma is down-regulated in human breast cancer cells〔J〕.Cancer Res，2001;61(1)：76-80.

7 Page MJ，Amess B，Townsend RR，et al.Proteomic definition of normal human luminal and myoepithelial breast cells purified from reduction mammoplasties〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96(22)：12589-94.

8 Morita A，Miyagi E，Yasumitsu H，et al.Proteomic search for potential diagnostic markers and therapeutic targets for ovarian clear cell adenocarcinoma〔J〕.Proteomics，2006;6(21)：5880-90.

9 Zinkin NT，Grall F，Bhaskar K，et al.Serum proteomics and biomarkers in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease〔J〕.Clin Cancer Res，2008;14(2)：470-7.

10 Wang HY.Laser capture microdissection in comparative proteomic analysis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Methods Cell Biol，2007;82：689-707.

11 Yoon GS，Lee H，Jung Y，et al.Nuclear matrix of calreticulin in hepatocellular carcinoma〔J〕.Cancer Res，2000;60(4)：1117-20.

12 Yu LR，Zeng R，Shao XX，et al.Identification of differentially expressed proteins between human hepatoma and normal liver cell lines by two-dimensional electrophoresis and liquid chromatography-ion trap mass spectrometry〔J〕.Electrophoresis，2000;21(14)：3058-68.

13 Alaiya A，Roblick U，Egevad L，et al.Polypeptide expression in prostate hyperplasia and prostate adenocarcinoma〔J〕.Anal Cell Pathol，2000;21(1)：1-9.

14 Gretzer MB，Chan DW，Van Rootselaar CL，et al.Proteomic analysis of dunning prostate cancer cell lines with variable metastatic potential using SELDI-TOF〔J〕.Prostate，2004;60(4)：325-31.

15 Zheng YX，Xu Y，Jerome P，et al.Protein chip array technology identify Pca-24，a potential protein marker in prostate cancer〔J〕.Chin Oncol，2005;15(3)：257-60.

16 Pan YZ，Xiao XY，Zhao D，et al.Application of surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight-based serum proteomic array technique for the early diagnosis of prostate cancer〔J〕.Asian J Androl，2006;8(1)：45-51.

17 高天文，牛軍州.Foxp3在黑素瘤細(xì)胞中表達(dá)的鑒定及其功能的初步研究〔D〕.中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)博士論文，2009.