陜北野生山丹丹染色體數(shù)目與核型分析研究

丁媛媛，齊向英，陳宗禮，劉 維，楊 鵬

(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延安大學(xué))陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000)

山丹丹(Lilium pumilum DC.)為百合科，百合屬多年生草本植物［1］。主要分布在陜西、寧夏、山西、甘肅、青海等地。在陜北延安地區(qū)分布的山丹丹一般株高30～40 cm，葉狹長如松葉，花具清香，春末夏初開放。其花朵下垂，花瓣向外反卷，通常無斑點(diǎn)有光澤，十分美麗，是極好的園藝觀賞花卉和切花材料。其生命力頑強(qiáng)，花色火紅，是陜北地區(qū)的代表性花卉，在陜北地區(qū)常被視為中國紅色革命的象征。山丹花具有極高的藥用價(jià)值?！侗静菥V目》中記載山丹丹花味微苦，性平，有養(yǎng)陰潤肺、清心安神功能。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明山丹丹不僅用于陰虛久咳，虛煩驚悸，而且是很好的藥食同源植物。國外對野生百合資源的研究較早，英國在16世紀(jì)末期就開始了野生百合的調(diào)查、收集和評價(jià)［2］，國內(nèi)也對部分百合屬 植 物 如 對 毛 葉 百 合(L.dauricum Ker.gewl.)［3－15］、卷丹(L.lancifolium Thunb.)［4－5］、條葉百合(L.callosum Sieb.et Zucc.)［6］、紫斑百合(L.nepalense D.Don.)［7］等進(jìn)行了核型研究，但關(guān)于山丹丹，尤其是陜北野生山丹丹的核型至今尚未見報(bào)道。本文利用酸解去壁低滲法首次對陜北地區(qū)野生山丹丹染色體數(shù)目和核型進(jìn)行報(bào)道，旨在了解其特性，為山丹丹的品種選育及栽培利用提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試材料 采自陜西省區(qū)域生物保育與利用工程技術(shù)研究中心苗木品種園示范園保存的野生山丹丹，原種采自延川縣小程村。

1.1.2 試劑 飽和對二氯苯，無水乙醇，冰醋酸，氯化鉀，改良苯酚品紅染液，鹽酸。

采用Olympus BX41 DP 71全自動(dòng)顯微照相系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 染色體制片方法 取材:于上午8:30～9:30進(jìn)行。從山丹丹根部取長約1～2 cm幼嫩根尖。預(yù)處理:飽和對二氯苯溶液前處理4 h。固定:卡諾氏固定液(無水乙醇:冰醋酸體積比為3∶1)中固定12 h。前低滲:0.075 mol/L氯化鉀溶液中前低滲1h。酸解:放入預(yù)熱好的0.1mol/L鹽酸中60℃恒溫水浴解離7 min。后低滲:0.075 mol/L氯化鉀溶液中后低滲30 min。染色:改良石碳酸品紅染液染色30 min。壓片:取分生區(qū)的材料置于載玻片上，滴一滴染液壓片。鏡檢拍照:將制好的染色體臨時(shí)裝片置于Olympus BX41 DP71全自動(dòng)顯微鏡下觀察，捕捉圖像，尋找染色清晰、分散而不重疊的分裂中期細(xì)胞進(jìn)行拍照。

1.2.2 染色體數(shù)目確定與核型分析方法 隨機(jī)選取30個(gè)染色體清晰且分散良好的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色數(shù)目統(tǒng)計(jì)。分別對染色體數(shù)目及含有不同染色體數(shù)目的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算其在觀察細(xì)胞的總數(shù)中的百分比和95%置信區(qū)間。

沖洗5張放大的照片，剪下染色體測量長度，將同源染色體進(jìn)行配對。核型分析按李懋學(xué)(1985)的分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［8］，核型分類根據(jù)Stebbins(1971)的分類標(biāo)準(zhǔn)劃分［9］，核型不對稱系數(shù)(As.K/%)按Arano的方法計(jì)算［10］。染色體的相對長度、臂長及類型參照Levan等的命名系統(tǒng)命名［11］。

染色體形態(tài)測量公式:

相對長度=(染色體長度/染色體組總長度)×100%

著絲粒指數(shù)=(短臂/染色全長)×100%

臂比=長臂/短臂

核型不對稱系數(shù)(As.K%)=(長臂總長/全組染色體總長)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目

通過對30個(gè)細(xì)胞分裂相的觀察，結(jié)果見表1。含24條染色體的細(xì)胞共計(jì)27個(gè)，占觀察細(xì)胞總數(shù)的90.00%，95%置信區(qū)間在79.26% ～100.74%，大于24條染色體的細(xì)胞有3個(gè)，占觀察細(xì)胞總數(shù)的10%，其中有1個(gè)細(xì)胞含有25條染色體，占總數(shù)的3.33%，2個(gè)細(xì)胞含有26條染色體，占觀察總數(shù)的6.67%。

2.2 山丹丹染色體長度與核型

山丹丹的中期染色體形態(tài)見圖1，山丹丹染色體及核型圖見圖2，核型模式圖見圖3。據(jù)表2可以看出，山丹丹有24條染色體，相對長度變化范圍在5.84%～12.75%，全組染色體總長度為100.01 μm，平均長度為8.334 μm，屬于大型染色體。最長染色體與最短染色體之比為2.183，臂比大于2∶1的染色體有3、4、5、6、7、9、11、12 ，8 組，占全組染色體的66.67%。按Stebbins的核型不對稱標(biāo)準(zhǔn)，屬于“3B”型。核型不對系數(shù)為72.16%，核型對稱性差，為較不對稱類型。根據(jù)Stebbins有花植物核型進(jìn)化中對稱—原始，不對稱—進(jìn)化的觀點(diǎn)［12］，陜北野生山丹丹屬于較進(jìn)化類型。配對的12組染色體中，第1、2、8、10 組為中部著絲點(diǎn)染色體(m)，第6組為近中部著絲點(diǎn)染色體(sm)，第 3、4、5、7、9、12 組為近端部著絲點(diǎn)染色體(st)，11組為端部著絲點(diǎn)染色體(t)。其中在第10組，第11組染色體短臂上發(fā)現(xiàn)具有隨體。根據(jù)以上數(shù)據(jù)，可以確定野生山丹丹的染色體核型公式為2n=2x=8m+2sm+12st+2t。

表2 山丹丹染色體相對長度、臂比與類型

圖1 山丹丹的中期染色體形態(tài)

圖2 山丹丹染色體核型圖

圖3 山丹丹染色體核型模式圖

3 討論

每一種生物染色體數(shù)目是恒定的，我們通過對30個(gè)細(xì)胞分裂相的觀察得到，含24條染色體的細(xì)胞為27個(gè)，占觀察總細(xì)胞數(shù)的90%，95%的置信區(qū)間結(jié)果為79.26～100.74。根據(jù)陳瑞陽［13］等植物染色核型分析標(biāo)準(zhǔn)的要求，最少統(tǒng)計(jì)30個(gè)細(xì)胞，其中85%以上細(xì)胞具有恒定一致的染色體數(shù)，我們的研究結(jié)果正好在該標(biāo)準(zhǔn)要求的范圍內(nèi)，所以認(rèn)為山丹丹染色體是24條。

核型是指染色體組在有絲分裂中期的表現(xiàn)，是染色體數(shù)目、大小、形態(tài)特征的總和。在對染色體進(jìn)行測量計(jì)算的基礎(chǔ)上進(jìn)行分組、排隊(duì)、配對并進(jìn)行形態(tài)分析的過程叫核型分析。百合屬植物的染色體多為大型，染色體核型一般為“3B”型［14］，染色體基數(shù)為12，以二倍體居多，目前僅在卷丹［15－16］、川百合［17］等少數(shù)種中發(fā)現(xiàn)三倍體。圖立古爾等［18］對吉林省產(chǎn)的5種百合品種進(jìn)行了核型分析，結(jié)果表明5種百合的核型為“3A”和“3B”型，戴小紅等［19］對觀賞百合3個(gè)品種的核型分析表明，其核型類型也為“3A”和“3B”型，本研究得到山丹丹的核型屬于“3B”型，與他們的研究結(jié)果一致。在植物體細(xì)胞染色體鑒別中，主要是以其全長、臂長、著絲點(diǎn)位置和特殊的結(jié)構(gòu)如隨體為依據(jù)的。我們的研究在野生山丹丹的染色體中發(fā)現(xiàn)具有居間隨體，分別位于第10對，11對染色體的短臂上。這與劉華敏等［20］報(bào)道的山丹(L.pumilum DC.)第1、6、8 對染色體上有居間隨體，第2對染色體的短臂上有隨體，第11對染色體的長臂上有隨體，范小峰等［21］報(bào)道的細(xì)葉百合無隨體出現(xiàn)，岳玲等［16］報(bào)道的細(xì)葉百合有1對染色體有隨體的結(jié)果有所不同。

本研究對山丹丹的核型分析結(jié)論與劉華敏等［20］報(bào)道的山丹(L.pumilum DC.)核型為 2n=2x=2m+6sm+4st+12t，屬3A型結(jié)論不一致，這與百合屬各種間植物的生長環(huán)境有關(guān)。如果排除試驗(yàn)誤差因素的干擾，可能是因?yàn)樯降ぎa(chǎn)地的不同，為了適應(yīng)不同的環(huán)境條件，植物染色體及其外部形態(tài)發(fā)生了一定程度的變異。劉敏華等所用材料來源于甘肅天水的野生山丹，其生長環(huán)境與陜北延安地區(qū)相比差異較大，生境不同將會(huì)引起不同生態(tài)類型，這將會(huì)造成其核型的差異。

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