殼寡糖對辣椒種子萌發(fā)及幼苗抗氧化酶活性影響研究

陸建玲，孫達峰，張 超，戚善龍，李 輝

(1.江蘇省生產(chǎn)力促進中心，江蘇南京210042;2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京210042;3.揚州日興生物科技股份有限公司，江蘇 揚州225600)

甲殼素、殼聚糖及其衍生物可以作為一種新型的植物生長調(diào)節(jié)劑，能激發(fā)種子發(fā)芽，促進作物生長，提高其抗病能力，從而提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)。可以作為種子處理劑，配置成溶液對作物進行拌種、浸種處理，經(jīng)處理的種子，能促進植物mRNA的重新合成［1］，提高酶活性，加速種子萌發(fā)過程中胚乳淀粉的水解，為種子的萌發(fā)提供充足的養(yǎng)分，從而提高種子的發(fā)芽率。殼聚糖對植物的生長調(diào)節(jié)作用從對種子處理之后便開始了，它提高種子的發(fā)芽率和實生苗株高有利幼苗生長，能激活植物細胞，提高抗病能力、促進作物生長和增產(chǎn)［2－6］，對多種作物還有增加分蘗(如小麥)、增強抗倒伏能力(如玉米)和縮短生長周期(如棉花、玉米等)的作用。

殼寡糖(Chitosan oligosaccharide)，也稱幾丁寡糖，是甲殼素、殼聚糖降解后的產(chǎn)物，在國際上被稱為“第六生命要素”，殼寡糖具有更好生物活性，廣泛應(yīng)用于功能材料、食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域中［7－8］。殼寡糖植物生長調(diào)節(jié)劑，包括促進種子萌發(fā)和植物生長的作用。通過浸種和噴施處理方式，對不同苗期植物生長有促進作用，并能增強幼苗素質(zhì)，促進壯苗形成，在農(nóng)業(yè)上具有很好的開發(fā)利用價值。目前，國內(nèi)外報道了殼寡糖在植物生長調(diào)節(jié)中的諸多應(yīng)用，如在促進黃瓜種子的萌發(fā);提高黃瓜、小麥、番茄等的產(chǎn)量;提高蘭花植物組織培養(yǎng)成活率中的應(yīng)用［9－10］。

種子的活力直接關(guān)系到辣椒幼苗的成長和壯苗的培育，進而影響作物產(chǎn)量。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等是評價種子發(fā)芽情況的常用指標(biāo)，反映了種子的生活力、發(fā)芽速度、發(fā)芽整齊程度、幼苗健壯程度等情況。種子發(fā)芽勢高，表示種子生活力強，發(fā)芽整齊，出苗一致。超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)屬于抗氧化酶類，在植物體內(nèi)協(xié)同作用，清除過量活性氧，維持活性氧的代謝平衡、保護膜結(jié)構(gòu)不受損害，這使得植物能抵御、忍耐一定程度的逆境脅迫［11］。本文研究結(jié)果表明一定濃度的殼寡糖可以促進種子萌發(fā)，能激活辣椒幼苗抗氧化酶活性，為殼寡糖在植物生長調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料:辣椒品種為蘇椒五號，(純度≥90%，凈度≥98%，發(fā)芽率≥80%，水分≤7%)市場購得;殼寡糖(揚州日興生物科技股份有限公司，平均分子量300～2 000D，脫乙酰度≥90%)。

試劑:冰醋酸(分析純)、氯化鈉、蒸餾水。

超氧化物歧化酶測試盒、過氧化氫酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)

儀器:恒溫培養(yǎng)箱，上海實驗儀器總廠;20PR－52D離心機，日立工機株式會社;JA1003電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司;UV－2000型紫外可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH·S電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械三廠。

1.2 方 法

1.2.1 測定方法

1.2.1.1 發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活性指數(shù)的測定 參照陶嘉齡［12］的方法。

發(fā)芽勢。種子發(fā)芽勢是指發(fā)芽試驗初期，在規(guī)定的日期內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)占供試種子數(shù)的百分率，是判斷田間出苗率的指標(biāo)。種子發(fā)芽勢高，表示種子生活力強，發(fā)芽整齊，出苗一致。

發(fā)芽勢=(6d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

發(fā)芽率。發(fā)芽率是指種子發(fā)芽終止在規(guī)定時間內(nèi)的全部正常發(fā)芽種子粒數(shù)占供檢種子粒數(shù)的百分率，可用以判斷田間出苗率。

發(fā)芽率=(12d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

發(fā)芽指數(shù)GI=∑Gt/Dt

式中，Gt:在時間t日的發(fā)芽數(shù)，Dt:相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)

1.2.1.2 SOD 活性的測定

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)，SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基(O－2·)，保護細胞免受損傷。

黃嘌呤氧化酶法測定原理為:通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O－2·)，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光分光光度計測其吸光度。當(dāng)被測樣品中含有SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。

1.2.1.3 CAT 活性的測定

過氧化氫酶(Catalase)，CAT的主要作用是催化H2O2分解為H2O和O2，從而清除體內(nèi)的過氧化氫，保護細胞免于毒害。

可見光法測定CAT活性的原理為:CAT分解過氧化氫的反應(yīng)通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的過氧化氫與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種黃色絡(luò)合物，在405nm處測定其生成量，可計算出CAT的活力。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 殼寡糖溶液的制備

電子天平準(zhǔn)確稱取0.025 g殼寡糖，蒸餾水定容至250 mL得100.00 mg/L殼寡糖溶液(液一);取該溶液2.5 mL，加蒸餾水定容至250 mL，得1.00 mg/L殼寡糖溶液(液二);取液二25 mL，蒸餾水定容至250 mL得0.10 mg/L殼寡糖溶液(液三);取液三25 mL，蒸餾水定容至250 mL得0.01 mg/L殼寡糖溶液(液四)。

1.2.2.2 生理鹽水的配制

稱取2.250 g分析純NaCl，用蒸餾水定容至250 mL。

1.2.2.3 種子處理和培養(yǎng)方法

選取籽粒飽滿、大小一致的辣椒種子，漂洗干凈，在室溫條件下分別用蒸餾水(CK)和4個不同質(zhì)量濃度 0.01(A)、0.10(B)、1.00(C)、100.00(D)mg/L殼寡糖溶液浸種20 h，每個處理100粒，3次重復(fù)。浸種后用蒸餾水沖洗3次，播在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，加10mL蒸餾水浸潤，在種子上覆一層濾紙，放入(29±1)℃恒溫箱中黑暗環(huán)境下催芽，催芽期間每日給各處理加適量的蒸餾水。

1.2.2.4 殼寡糖對辣椒種子萌發(fā)的影響

每天觀察并記錄發(fā)芽相關(guān)指標(biāo)。催芽6天后測定種子發(fā)芽勢，第12天測定發(fā)芽率，計算活力指數(shù)。

1.2.2.5 殼寡糖對辣椒幼苗抗氧化酶活性的影響組織勻漿的制備每組隨機取培養(yǎng)至12天的幼苗1.00 g，將準(zhǔn)確稱量的新鮮幼苗全株剪碎并加入9 mL生理鹽水，在事先放入冰箱的研缽中研磨勻漿，獲得10%的組織勻漿，2 500 rpm冷凍離心10 min，取上清液。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒的方法(黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶活力)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度殼寡糖對辣椒種子發(fā)芽的影響

用不同濃度的殼寡糖對辣椒種子進行處理，種子發(fā)芽情況如表1所示。

表1 不同濃度殼寡糖對辣椒種子發(fā)芽的影響

殼寡糖溶液浸種處理后，蘇椒五號種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均較對照有較大程度的提高(表1)。經(jīng)統(tǒng)計分析表明，各濃度處理的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)分別較對照組有顯著提高，其中以0.10 mg/L濃度的殼寡糖溶液處理效果最佳，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)分別比對照提高了118.1%、7.7%和28.3%;用100.00 mg/L處理效果最差，蘇椒五號的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)分別僅比對照提高了33.2%、2.1%和4.1% ，這表明在一定濃度下，辣椒種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與浸種的殼寡糖溶液的濃度呈正相關(guān)，當(dāng)殼寡糖的濃度過高時，對促進種子萌發(fā)的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)效果不是很明顯，見圖1、圖2。

圖1 5d各組發(fā)芽情況

2.2 不同濃度殼寡糖對辣椒幼苗抗氧化酶活性的影響

2.2.1 對SOD活性影響

不同濃度殼寡糖浸種處理能激活SOD活性。實驗中，1.00 mg/L殼寡糖溶液浸種處理，幼苗SOD活性最高，比對照提高了18.9%。殼寡糖濃度較低時，對提高辣椒幼苗抗氧化酶活性的作用較弱，隨濃度升高促進效果增強，當(dāng)處理濃度達到最佳時辣椒幼苗的酶活性達到最高，之后隨處理濃度的上升，對提高幼苗酶活性的效果下降。

2.2.2 對CAT活性影響

圖4 不同濃度殼寡糖對CAT活力影響

不同濃度殼寡糖浸種處理能激活CAT活性。實驗中，0.10 mg/L殼寡糖溶液浸種處理，幼苗CAT活性最高，比對照提高了52.7%。殼寡糖濃度較低時，對提高辣椒幼苗抗氧化酶活性的作用較弱，隨濃度升高促進效果增強，當(dāng)處理濃度達到最佳時辣椒幼苗的酶活性達到最高，之后隨處理濃度的上升，對提高幼苗酶活性的效果下降。

3 討論

(1)不同濃度殼寡糖對辣椒種子萌發(fā)的影響種子的活力直接關(guān)系到辣椒幼苗的成長和壯苗的培育，進而影響辣椒的產(chǎn)量。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)等是評價種子發(fā)芽情況的常用指標(biāo)，反映了種子的生活力、發(fā)芽速度、發(fā)芽整齊程度、幼苗健壯程度等情況。種子發(fā)芽勢高，表示種子生活力強，發(fā)芽整齊，出苗一致。本實驗結(jié)果表明，用不同濃度的殼寡糖溶液浸泡辣椒種子，均可以促進種子萌發(fā)，提高發(fā)芽種子整齊度和種子生活力。在本實驗范圍內(nèi)，用0.10 mg/L的殼寡糖溶液浸種處理效果最佳。用不同濃度殼寡糖浸種處理對辣椒種子萌發(fā)的效果與其濃度有關(guān)，殼寡糖濃度較低時，對辣椒種子萌發(fā)的的促進作用較小，隨濃度升高促進作用增大，當(dāng)處理濃度達到最佳時辣椒種子萌發(fā)達到最佳效果，之后隨處理濃度的上升，對種子萌發(fā)的促進作用下降。

(2)不同濃度殼寡糖對辣椒幼苗抗氧化酶活性的影響SOD、CAT屬于抗氧化酶類，在植物體內(nèi)協(xié)同作用，清除過量活性氧，維持活性氧的代謝平衡、保護膜結(jié)構(gòu)不受損害，這使得植物能抵御、忍耐一定程度的逆境脅迫。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，它能催化超氧陰離子自由基(·)發(fā)生歧化反應(yīng)而解除其毒害，并產(chǎn)生;CAT則催化過氧化氫H2O2分解為H2O和O2，從而清除體內(nèi)的過氧化氫，保護細胞免于毒害。

不同濃度殼寡糖浸種處理能激活SOD和CAT活性。在本實驗中，1.00mg/L殼寡糖溶液浸種處理，幼苗SOD酶活力最高;0.10 mg/L殼寡糖溶液浸種處理，幼苗CAT酶活力最高。用不同濃度殼寡糖浸種處理對辣椒幼苗抗氧化酶活力的影響與其濃度有關(guān)，殼寡糖濃度較低時，對提高辣椒幼苗抗氧化酶活的作用較弱，隨濃度升高促進效果增強，當(dāng)處理濃度達到最佳時辣椒幼苗的酶活達到最高，之后隨處理濃度的上升，對提高幼苗酶活的效果下降。

在本實驗中，用不同濃度殼寡糖溶液浸種處理，蘇椒五號辣椒種子的抗氧化酶活性在一定程度上得到提高并表現(xiàn)出上述規(guī)律，但是酶活的提高程度并不十分明顯，這可能是因為種子的培養(yǎng)條件適宜，抗氧化酶保持在較高的水平上，使得殼寡糖的促進效果不明顯，若采用一定的逆境脅迫，可能會使效果更為顯著，在惡劣條件下的植物生長調(diào)節(jié)作用將在后面的實驗中進一步研究。

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