谷氨酰胺二肽合成方法及其在生豬養(yǎng)殖中的應用

廣東工業(yè)大學輕工化工學院 衛(wèi)林進 李大光

廣州天科生物科技有限公司 舒緒剛

谷氨酰胺二肽相對于谷氨酰胺單體，溶解度高，熱穩(wěn)定性好，并能夠被小腸黏膜完整吸收，然后在腸黏膜、肝、腎、骨骼肌等組織器官中被快速分解，產生體內所需的氨基酸，提高血漿中谷氨酰胺濃度，從而發(fā)揮谷氨酰胺的作用 （周榮艷和彭健，2005）。常見的谷氨酰胺二肽有甘氨酰谷氨酰胺二肽和丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（俗稱力肽）兩種類型，其可分解產生谷氨酰胺。本文對目前谷氨酰胺二肽合成方法及其在畜牧養(yǎng)殖中的應用作一綜述。

1 谷氨酰胺二肽合成方法

目前，國內外已知的二肽及多肽合成方法主要有四類：生物酶法、微生物發(fā)酵法、化學反應法和多肽固相合成法。

1.1 生物酶法 生物酶法是指通過一些具有生物活性和專一性的分解酶（天然或化工合成）水解目標大分子蛋白質，形成具有生物活性的小分子肽和氨基酸；或通過氨基酸合成酶進行氨基酸的組裝與成肽（林軍，2009；黃惟德，1985）。 其特點是反應條件溫和，原料廉價易得，但存在酶解效率不高，產物活性較低的問題。此外，分解物中具有生物活性的肽片段從兩個氨基酸到十幾個氨基酸不等，得到的產品中副產物居多，目標產物純度較差，后續(xù)分離提純過程繁瑣，導致總體產率偏低（馬海樂等，2010；徐力等，2004）。

1.2 微生物發(fā)酵法 發(fā)酵法是指利用特定微生物的代謝活動將廉價原料轉變?yōu)槟繕硕嚯牡姆椒?，其特點是發(fā)酵使用的細菌或酵母易于培養(yǎng)，原料獲取方便，條件容易控制（湯亞杰等，2007；陳堅等，2004）。但酵母細胞中目標活性肽含量較低，酵母用量大，收率低，遠遠不能滿足市場需求，理論上僅為一種多肽生產方式，可以在實驗室進行小劑量合成。

1.3 化學反應法 化學反應法是通過一系列化學反應對氨基酸前期處理，然后進行肽鍵縮合的合成方法，是目前二肽及多肽小分子的研究熱點，其應用前景最為廣闊。這是因為化學合成法反應機理和操作方法多樣，反應條件易于控制，反應迅速、徹底，而且各個步驟產率高，產品專一性較好，具備工業(yè)化生產的理論條件。但氨基酸在中性條件下是以分子內的兩性離子形式（+H3NCH（R）COO-）存在，氨基酸之間直接縮合成酰胺鍵的反應在一般條件下難以進行；而且氨基酸肽酯反應無定向性，產物易發(fā)生消旋，若反應物側鏈官能團處理不當，易引入副產物（楊梅林，2006）。此外，一些試劑，如催化劑、保護基團試劑等毒副作用大且價格昂貴，化學合成步驟較多，因此整體產率不高，且生產成本高，制約了該方法的廣泛使用。目前國內外已有的谷氨酰胺二肽化學合成方法主要有以下幾種。

1.3.1 活化酯法 活化酯法合成多肽是目前為止一種較為常用的合成方法，通過氨基保護、羧基活化、肽鍵縮合、去除保護基團，最終得到目標產物（Kato 和 Kurauchi，1999）。該方法的優(yōu)點是反應條件溫和，使γ位酰胺基在反應中比較穩(wěn)定，不易發(fā)生水解；縮合產物可以分離得到純品；氫解后雜質較少，易于用重結晶法分離純化；原料工業(yè)來源充足。但總體反應步驟較多，且反應中要用到一些價格較高的原料導致成本增大。因此，若將該工藝路線進行改進和優(yōu)化，將會成為一種理想的制備谷氨酰胺二肽的方法。

1.3.2 酰氯法 谷氨酰胺直接與α-氯代酰氯在堿性條件下生成酰胺鍵，然后進行氨解得到最終產物，最后分離提純即可得到目標產品。此法巧妙利用活性較大的酰氯與氨基酸中氨基進行反應，生成酰胺鍵，具有反應溫和，合成路線短，收率高的優(yōu)點，但常用的2-D-氯丙酰氯價格昂貴，氨解過程中可能發(fā)生消旋，得到消旋產物，難以分離。一種改進方式是原料采用谷氨酸，先在酸性條件下與醇形成谷氨酸脂，然后在pH=8左右與酰氯反應，最后進行氨解，得到谷氨酰胺二肽。此法的優(yōu)點：一是避免了以往反應中γ-酰胺的水解，二是選用廉價的谷氨酸，降低生產成本，適合工業(yè)化生產（金輝，2003）。

1.3.3 酸酐法 酸酐中羰基作為活性親電中心，可以與帶孤對電子的氨基發(fā)生親核取代反應，形成肽鍵，得到二肽。目前已有的酸酐法是N-羧基內酸酐（NCA）法和混合酸酐法（Stehle 等，1982）。區(qū)別在于前者通過甘氨酸或丙氨酸與光氣二氯化碳環(huán)合生成N-羧基內酸酐；而后者是氨基酸與酯制的直鏈狀酸酐。該方法的優(yōu)點是反應條件溫和，速度快，收率高，但是中間體N-羧基內酸酐不穩(wěn)定，以及混合酸酐有兩個羰基活性中心，若不采取對應措施易發(fā)生同等加成反應，得到難以分離的副產物，限制了其工業(yè)化應用。

1.3.4 保護γ-酰胺法 大多研究認為，谷氨酰胺作為腸外營養(yǎng)物質不宜直接被機體吸收利用，主要原因是谷氨酰胺本身的水溶液穩(wěn)定性差，自身的酰胺鍵易發(fā)生水解，生成對人體有害的環(huán)化產物-焦谷氨酸（李幼生和黎介壽，2002）。Yasutsugu（1992）研究表明，使用呫噸氫醇將其保護起來再進行酯化縮合反應，避免了γ酰胺基團的水解。這種方法可以避免L-谷氨酰胺的γ-酰胺水解，但是無疑增加了操作步驟，而且呫噸氫醇價格昂貴，使得該方法僅理論可行。

1.4 固相合成法 固相是指多肽合成中的載體是固相，一般以不溶性的氯甲基聚苯乙烯樹脂為載體，其他氨基酸原料在載體上進行多肽縮合。氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個氨基被封閉基團X保護的氨基酸共價連接在固相載體上。在三氟乙酸的作用下，脫掉氨基的保護基，這樣第一個氨基酸就與固相載體相連接。然后氨基被封閉的第二個氨基酸的羧基通過N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺 （DCC）活化，羧基被DCC活化的第二個氨基酸再與已接在固相載體上的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，這樣在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上述肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度。最后脫去保護基X，用HF水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，就得到了合成好的肽。固相合成的優(yōu)點主要表現在最初的反應物和產物都是連接在固相載體上，因此可以在一個反應容器中進行所有的反應，便于自動化操作，加入過量的反應物可以獲得高產率的產物，同時產物很容易分離。但是固相合成法對于載體條件要求苛刻，合成過程中伴隨縮合位點，產物異構，原料間縮合等問題的發(fā)生，產物中存在數量較為可觀的副產物，而且整體反應速度慢。

2 谷氨酰胺二肽在生豬養(yǎng)殖中的應用

2.1 在斷奶仔豬上的應用 斷奶仔豬，尤其是早期斷奶仔豬，由于從采食母乳過渡到固體飼料，易造成仔豬斷奶后采食量降低而導致營養(yǎng)不足，并且因飼料中抗原物質引起仔豬腸道過敏反應，導致仔豬出現生長遲緩、腹瀉、免疫力下降等為主要特征的 “早期斷奶綜合征”，給養(yǎng)豬業(yè)帶來直接經濟損失。研究表明，斷奶仔豬日糧中添加甘谷二肽，能明顯降低仔豬腹瀉率，提高仔豬采食量、日增重，表明甘谷二肽有增強仔豬免疫力，促進仔豬生長的作用（黃冠慶等，2003）。此外，由甘氨酰谷氨酰胺二肽在仔豬體內分解而生成的谷氨酰胺作為細胞供能物質和氮源，能促進仔豬腸道細胞的修復、器官的生長和蛋白質的合成，有利于仔豬生長。

2.2 在妊娠和哺乳期母豬上的應用 活性二肽另一個重要的用途是通過二肽與一些動物體內所需的微量元素或者重要的金屬元素進行螯合，得到營養(yǎng)價值更高的氨基酸螯合物類產品。盡管螯合物在動物體內的吸收機制目前尚無定論，但目前主要有兩種觀點：一是金屬離子與二肽螯合，形成穩(wěn)定的電中性化合物，通過細胞膜進入血漿，進而被吸收；二是微量元素氨基酸螯合物利用氨基酸和小肽吸收機制，通過小腸刷狀緣，以氨基酸和肽類形式被吸收，這種方式使得金屬元素吸收和循環(huán)進入機體的效率更高。楊玲媛和陳永豐（2011）研究表明，在妊娠和哺乳期母豬日糧中添加適量氨基酸螯合鐵可有效減少死胎，提高仔豬初生重和初生仔豬含鐵量，并能預防仔豬貧血和提高仔豬存活率。

3 前景展望

綜上所述，谷氨酰胺二肽及其衍生物具有良好的市場前景。但由于谷氨酰胺二肽生產難度大，我國的工業(yè)化生產技術尚不成熟，導致成本過高，主要依賴進口。因此，如何設計一條高效的合成路線，對于降低活性肽生產成本，擴大谷氨酰胺二肽的應用范圍至關重要，這也是今后活性肽類產品的一個發(fā)展方向。

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