瘤胃真菌體外培養(yǎng)條件對其產酶活性的影響

青島農業(yè)大學動物科技學院 周光明 王利華

瘤胃真菌在粗飼料消化中起著非常重要的作用，但由于瘤胃真菌屬于嚴格厭養(yǎng)菌，在工業(yè)生產中的應用受到一定的限制。因此，營造適合瘤胃真菌生長的環(huán)境，提高瘤胃真菌生長速度和產酶效率，將會對瘤胃真菌在秸稈處理、新型飼料及新酶源的開發(fā)等領域的廣泛作用起到一定的推動作用。

1 環(huán)境因素

1.1 溫度對瘤胃真菌的影響 微生物的生長和酶的合成均是在酶的催化下進行的，溫度是保證酶活性第一要素，因此發(fā)酵過程中必須保證適宜的溫度。Lowe等（1987）研究表明，厭氧真菌在36～41℃內均能較好生長，其最適溫度為39℃，在此溫度下產酶活力最高，生長速度最快，培養(yǎng)溫度過高或過低酶活都會大幅度降低。

1.2 pH對瘤胃真菌的影響 在瘤胃中，pH通常保持在5.8～6.8，厭氧真菌在這一范圍內能較好生長。 Barichievin和 Calza（1990）研究表明，培養(yǎng)基的pH對厭氧真菌有一定的影響，pH為6.0時酶活力最高。王照華（2004）研究發(fā)現，瘤胃真菌最適pH為6.5～7.0。

2 營養(yǎng)因素

2.1 碳源的影響 碳源作為瘤胃真菌的能量來源，對瘤胃真菌的生長和生產的影響尤為重要。朱崇淼等（2004）在研究瘤胃真菌A4菌發(fā)酵參數時發(fā)現，在分別以稻草秸、玉米秸、花生蔓、濾紙作為碳源時，A4菌均可產生具較高活力的木聚糖酶，其酶活分別為 14.3l、11.39、6.99 U/mL和 13.37 U/mL， 比活力分別為 26.96、15.95、22.29 U/mg 和25.12 U/mg；研究還發(fā)現，以稻草秸和濾紙為碳源時，二者培養(yǎng)液中羧甲基纖維素酶活力無顯著差異（P>0.05），且均顯著高于玉米秸組和花生秸組（P<0.05）。厲學武（2011）在以玉米秸、花生蔓、地瓜蔓及麩皮作為不同的發(fā)酵底物，篩選木聚糖酶和羧甲基纖維素酶體外培養(yǎng)的最優(yōu)發(fā)酵條件時發(fā)現，以玉米秸稈為碳源時木聚糖酶活為最高，與其他三種碳源之間差異顯著（P<0.05）；以地瓜蔓為碳源時，羧甲基纖維素酶活最高，與花生蔓之間差異顯著（P<0.05）；以地瓜蔓為碳源時，木聚糖酶比活力和羧甲基纖維素酶比活力均為最高，與其他三種底物之間差異性極顯著（P<0.01）。以上試驗中，瘤胃真菌酶活差異較大，其原因可能是不同碳源誘導產生的差異。

2.2 硫源的影響 在瘤胃真菌合成含硫氨基酸的過程中為機體提供了硫源，但是瘤胃真菌利用不同的硫源的難易程度不同，而且含硫氨基酸在微生物合成的酶中又有重要的作用，所以硫源對瘤胃真菌的生長和酶活會產生重要的影響作用。鄭拉弟 （2009）研究硫酸鈉和硫化鈉的不同水平（0.18%、0.25%、0.30%）對瘤胃真菌數量和瘤胃羧甲基纖維素酶活力的影響，結果表明，硫酸鈉和硫化鈉均能促進瘤胃真菌的生長；日糧干物質中硫含量為0.25%時，瘤胃真菌的平均數量顯著增加；此外，研究還發(fā)現，硫酸鈉和硫化鈉均能顯著提高瘤胃羧甲基纖維素酶活力，但是總的看來，硫酸鈉的效果要優(yōu)于硫化鈉。

2.3 氮源的影響 氮源在氨基酸或者蛋白質的合成過程中起著重要的作用，因而也會影響瘤胃真菌的生長和其產酶的活性。

Dijkerman等 （1996） 報道， 厭氧真菌Piromyces E2菌在以胺鹽為氮源時生長最好，以谷氨酸為氮源時也可生長，但以其他氨基酸、清蛋白、尿素、硝酸鹽為氮源時，該菌的生長受到抑制。王海榮（2006）研究發(fā)現，不同氮源日糧對瘤胃真菌濃度和數量影響顯著（P<0.05）；其中棉籽粕組顯著高于魚粉+麩皮組和豆粕組（P<0.05）；且瘤胃液相木聚糖酶活受氮源影響顯著（P<0.05），其中魚粉組極顯著高于棉籽粕組和豆粕組 （P<0.01），棉籽粕組又顯著高于豆粕組（P<0.05）。除較常規(guī)的飼料原料外，還有學者對酵母膏等不常用于飼料配合的原料做了相關研究。朱崇淼等（2004）研究表明，酵母膏濃度為 0、0.25、0.50 g/L的3個處理組所產生的木聚糖酶活及比活力均顯著低于1.0 g/L組 （P<0.05）；酵母膏濃度為0、0.25 g/L組的羧甲基纖維素酶活及比活力均顯著低于0.50 g/L和1.0 g/L組（P<0.05）。由此可見，較高濃度的酵母膏可促進木聚糖酶和羧甲基纖維素酶的產生。于紅霞和王利華（2009）研究酵母膏的不同添加量（0%、5%、15%）對瘤胃真菌體外培養(yǎng)的影響，結果表明，酵母膏添加量對纖維素酶活影響顯著（P<0.05），且纖維素酶活在24、48 h時最高；隨酵母膏添加量增大，培養(yǎng)底物的粗蛋白質和真蛋白含量也明顯增大，表明酵母膏對瘤胃真菌的生長有促進作用。

2.4 飼料中精料與粗料的影響 飼料的精粗比也會對瘤胃真菌的生長產生一定的影響，原因可能是由于精粗比會影響到瘤胃內的pH，從而影響瘤胃真菌的存活。也有可能是由于精料過多會加快瘤胃細菌的增殖，使得瘤胃細菌在瘤胃內占據了優(yōu)勢，從而影響了瘤胃真菌的生長；而過少時，瘤胃真菌又得不到充足的營養(yǎng)，生長也會受到限制。 孫云章等（2006）研究不同精粗比（0∶10、3∶7、5∶5、7∶3、10∶0）對瘤胃真菌和發(fā)酵特性的影響，結果表明，與0 h相比，發(fā)酵24 h時精粗比3∶7和5:5兩組的瘤胃真菌數量均有較大幅度的增加，其中精粗比為3∶7時增加的幅度最大，為0 h的10倍，精粗比7∶3組和全粗料組的真菌數量明顯減少，全精料組甚至檢測不到真菌；發(fā)酵48 h時，全粗料組羧甲基纖維素酶活顯著高于其他4組（P<0.05），且其他 4 組之間差異不顯著（P>0.05）；木聚糖酶酶活則隨底物精料比例的上升而顯著下降（P<0.05）。由此可見，全粗料組的羧甲基纖維素酶和木聚糖酶酶活最高，說明纖維含量豐富的底物可誘導共培養(yǎng)系統(tǒng)中纖維降解酶的產生，但是有少量的精料則更有利于瘤胃真菌的增殖，所以要根據具體需要選擇底物的精粗比，這樣才可以得到更多的產品。

2.5 無細胞瘤胃液的影響 無細胞瘤胃液對瘤胃真菌產酶促進作用的機理尚不明確，原因可能是，瘤胃真菌在生長產酶過程中除了需要能量和蛋白質，還需要一定的無機鹽甚至一些生長因子，而無細胞瘤胃液恰恰滿足了瘤胃真菌這兩大需求。朱崇淼等（2004）在產酶培養(yǎng)基中分別添加不同濃度（0、50、100、170 mL/L）的無細胞瘤胃液，進行發(fā)酵試驗，結果表明，3個較低濃度組酶活及比活力均低于高濃度組，且3個較低濃度組之間無顯著差異（P>0.05），說明培養(yǎng)基中無細胞瘤胃液必須處于較高濃度才能促進A4菌羧甲基纖維素酶的產生；此外，研究還發(fā)現無細胞瘤胃液濃度的高低對木聚糖酶活及比活力的影響均不顯著（P>0.05），表明無細胞瘤胃液的濃度對木聚糖酶影響不大或無影響。

3 其他因素

3.1 飼料加工方式的影響 不同的飼料加工方式可能會改變飼料中纖維素和木質素的結合狀態(tài)或者可為瘤胃真菌或其產生的酶提供更多的附著位點，而且有些加工方式還會改變精粗料之間的混合程度，從而影響瘤胃真菌的生長速度和其產生的酶的活性。Cann等（1993）研究發(fā)現，飼料經過氨化處理后有增加瘤胃厭氧真菌的趨勢。Martin 等（1993）和 Williams等（1989）研究發(fā)現，瘤胃中纖維物質主要由與固體結合的瘤胃真菌釋放的酶所消化。據此，陳小連（2007）測定了發(fā)酵底物上的纖維分解酶酶活，結果顯示，飼料經過化學處理可以特異地提高纖維分解酶酶活，NaOH處理顯著提高羧甲基纖維素酶和微晶纖維素酶酶活，而NH4HCO3處理對上述兩種酶酶活影響不顯著；與未處理組相比，NaOH和NH4HCO3這兩種處理方法都能顯著提高木聚糖酶活，并且木聚糖酶酶活隨著培養(yǎng)時間延長有逐漸升高的趨勢，且NaOH處理組效果更好。

化學處理會改變飼料的內部結構，改善飼料品質，從而更易于被瘤胃真菌利用。但有研究發(fā)現，僅僅簡單的混合也會改善瘤胃真菌的營養(yǎng)條件。李德允（2006）分別對肥育期荷斯坦奶牛采用兩種給料方式：全混日糧（TMR）和精粗料分離飼喂，結果發(fā)現，在第6小時和第9小時，TMR試驗組的真菌數量顯著高于精粗分離組（P<0.05）。

3.2 非離子型表面活性劑的影響 非離子型表面活性劑對瘤胃真菌的影響作用，可能是由于其能降低真菌表面的表面張力，促進相關酶或者有害物質的排除或者營養(yǎng)物質的吸收，從而加快瘤胃真菌的代謝速度引起的。Lee等（2003、1998）研究發(fā)現，添加0.05%的吐溫80，能顯著提高單中心真菌和多中心真菌的生長速度 （P<0.05）；然而，當添加量為0.10%時，單中心真菌的生長受到抑制，但多中心真菌的生長速度依然顯著提高（P<0.05）。這說明低劑量的吐溫80對瘤胃真菌有營養(yǎng)改善或促進代謝的作用，而高劑量的吐溫80對瘤胃真菌的這種作用過強，甚至改變了單中心真菌的細胞內環(huán)境，從而表現出了一定的毒害作用；而多中心的真菌對這種作用有一定的耐受性，所以低濃度和高濃度的吐溫80對其均表現出促進生長的作用。

4 小結

瘤胃真菌的體外發(fā)酵過程不僅受飼料加工方式、非離子型表面活性劑等因素影響，而且還受環(huán)境、營養(yǎng)等因素的影響，此外，目前還存在很多亟待解決的問題，如瘤胃真菌發(fā)酵產酶所需時間較長，發(fā)酵要求苛刻，發(fā)酵條件之間的組合優(yōu)化等工作仍有待完善。

[1]陳小連.稻草與補充料組合影響瘤胃纖維消化和微生物生態(tài)的效應研究：[博士學位論文][D].杭州：浙江大學，2007.

[2]李德允.全混合日糧對肥育期的瘤胃發(fā)酵特性及其飼料消化率的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006，10：16 ～ 20.

[3]厲學武.瘤胃真菌體外主要發(fā)酵條件的篩選、應用效果及分子生物學鑒定：[博士學位論文][D].青島：青島農業(yè)大學，2001.

[4]孫云章，毛勝勇，姚文，等.不同精粗比底物下瘤胃真菌和纖維降解細菌共培養(yǎng)發(fā)酵特性及菌群變化[J].微生物學報.2006，46（3）：422 ～ 426.

[5]王海榮.不同日糧精粗比及氮源對綿羊瘤胃纖維降解菌群和纖維物質降解的影響：[博士學位論文][D].內蒙古：內蒙古農業(yè)大學，2006.

[6]王照華.S-Ⅱ型雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)與活體牛瘤胃發(fā)酵和厭氧真菌培養(yǎng)的比較研究：[碩士學位論文][D].內蒙古:內蒙古農業(yè)大學，2004.

[7]于紅霞，王利華.酵母膏不同添加量對瘤胃真菌體外培養(yǎng)的影響[J].畜牧與獸醫(yī)，2009，41（9）：54 ～ 56.

[8]鄭拉弟.無機硫對綿羊瘤胃微生物數量及氮硫代謝的影響：[碩士學位論文][D].內蒙古：內蒙古農業(yè)大學，2009.

[9]朱崇淼，毛勝勇，孫云章，等.產木聚糖酶厭氧真菌菌株篩選及產酶培養(yǎng)條件研究[J].微生物學通報，2004，31（3）：11 ～ 15.

[10]Barichievin E M，Calza R E.Supernatant Protein and cellulase activities of the anaerobic ruminal fungus Neocallimastix ontalis EB 188[J].Applied and Envirnmental Microbiology，1990，56：43 ～ 48.

[11]Cann I K O，Kobayashi Y，Wakita M，et al.Effects of ammoniated rice straw feeding on microbes and their fermentation end-products in the rumen and caecum of sheep[J].Asian-Aust J Anim Sci，1993，6：67 ～ 72.

[12]Dijkerman R，OP den Camp H J M，Van der Drift C.Cultivation of anaerobic fungiin a 10-L fermenter system for the production of （hemi-）cellulolytic enrymes[J].APPlied Microbiology and Biotechnology，1996，46：85～91.

[13]Lee S S，Ahn B H，Kim H S，et a1.Effects of non-ionic surfactants on enzyme disttributionsofrumen contents，anaerobic growth ofrumen microbes，rumen fermentation characteristica and performances of lactating cows[J].Asian-Aust J Anim Sci，2003，16：104 ～ 115.

[14]Lee S S，Kim H D，Ha J K，et a1.Influences of surfactant Tween on the enzyme distributions，and growth of pure cultures of rumen non—and cellulotyic bacteria，and momo—and polycentric fungi[A].Proceedings of the 8th World Conference on Animal Production[C].SeouL，Korea：1998.356 ～ 357.

[15]Lowe S E，Theodorou M K，Trinci A P J.Growth and fermentation of an anaerobic rumen fungus on various carbon sources and effect of temperature on develoPment[J].Applied and Environmental Microbiology，1987，53：1210 ～1215.

[16]Martin C，Michalet—Doreau B，Fonty G，et al.Postprandial variations in the activity of polysaccharide-degrading enzymes of fluid-and particleassociated ruminal microbial populations[J].Curr Microbiol，1993，27：223 ～228.

[17]Williams A G，Withers S E，Strachan N H.Postprandial variations in the activity of polysaccharide-degrading enzymes in microbial populations from the digesta solids and liquor fractions of rumen contents[J].J Appl Bacteriol，1989，66：15 ～ 26.