豬瘟防控技術(shù)研究進(jìn)展

王 琴，范學(xué)政，趙啟祖，徐 璐

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

豬瘟又稱經(jīng)典豬瘟(Classical swine fever，CSF)，是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起豬的高度致死性、接觸性傳染病，是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病。近10年來(lái)，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所在豬瘟的流行病學(xué)、信息系統(tǒng)的建立、診斷系列新技術(shù)研發(fā)、疫苗效檢替代方法、致病機(jī)制及標(biāo)記疫苗的研究以及豬瘟的防控與凈化方面所取得了突破性進(jìn)展，現(xiàn)綜述如下。

1 我國(guó)豬瘟病毒分子流行病學(xué)及信息系統(tǒng)的研究

CSF分子流行病學(xué)調(diào)查研究對(duì)闡明CSFV的遺傳變異特征和規(guī)律，掌握當(dāng)前的流行現(xiàn)狀，溯源和追蹤C(jī)SF疫情發(fā)生的來(lái)源和去向，監(jiān)測(cè)現(xiàn)行使用疫苗的有效性，建立分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，提出新的防制策略具有十分重要的科學(xué)意義。

國(guó)際上將CSFV分為3個(gè)基因群(Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群)，10 個(gè)基因亞群(1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3 和 3.4)［1］。為弄清我國(guó) CSF 流行病學(xué)本底，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和軍事獸醫(yī)研究所分析了我國(guó)31個(gè)省市自治區(qū)自1979到2010年間的554條E2基因序列，表明我國(guó)流行毒株均為4個(gè)基因亞群(2.1、2.2、2.3 和1.1)，以基因 2 群(73.82%)為主，其次是 1 群(26.18%)。一直沒(méi)有監(jiān)測(cè)到基因3群的傳入與流行，但在周邊國(guó)家和地區(qū)如韓國(guó)、泰國(guó)、臺(tái)灣等均有基因3群，應(yīng)嚴(yán)密加強(qiáng)監(jiān)測(cè)［2］。多年一些學(xué)者認(rèn)為流行毒株免疫基因正在朝著遠(yuǎn)離疫苗的方向變異，導(dǎo)致免疫失敗，對(duì)上述從1979-2010年流行毒株與疫苗株E2基因核苷酸同源性進(jìn)行逐年分析，發(fā)現(xiàn)疫苗毒株抗原基因與流行株同源性在2007年最低，為76.2%，疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)也證實(shí)了我國(guó)目前使用的疫苗對(duì)同源性在76.2%以上的流行毒株攻擊依然有效［3］。中監(jiān)所曾用不同時(shí)間、不同地點(diǎn)、不同基因亞群和不同致病力的野毒株進(jìn)行單獨(dú)、混合、一次、多次或交叉攻毒，結(jié)果接種豬均能得到完全保護(hù)［4］。為此在我國(guó)使用HCLV進(jìn)行高密度(100%)強(qiáng)制免疫，仍然是有效的政策，筆者建議在今后的監(jiān)測(cè)工作中，如發(fā)現(xiàn)流行毒株與疫苗株E2基因同源性低于76.2%時(shí)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)并監(jiān)測(cè)疫苗的有效性。國(guó)際上對(duì)CSFV的分子流行病學(xué)研究，以位于德國(guó)漢諾威(Hannover)的歐盟CSF參考實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)最為完善，該實(shí)驗(yàn)室收集了來(lái)自35個(gè)國(guó)家E2基因數(shù)據(jù)已經(jīng)接近1000條。我國(guó)經(jīng)過(guò)多年的CSFV分子流行病學(xué)調(diào)查研究，弄清了中國(guó)CSFV的遺傳衍化背景，填補(bǔ)了國(guó)際上CSFV分子流行病學(xué)研究缺乏中國(guó)數(shù)據(jù)這一空白，表明我國(guó)CSFV遺傳變異情況在32年間處于穩(wěn)定狀態(tài)。通過(guò)調(diào)用歐盟CSF參考實(shí)驗(yàn)室的部分基因數(shù)據(jù)，有助于分析我國(guó)豬瘟流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為防治提供依據(jù)。我國(guó)養(yǎng)豬模式多樣，生態(tài)環(huán)境多樣，繼續(xù)開(kāi)展不間斷的分子流行病學(xué)跟蹤調(diào)查，實(shí)時(shí)跟蹤病毒變異特征及抗原性變異程度，監(jiān)測(cè)新的流行毒株的情況和疫苗對(duì)流行毒株的有效性，不僅對(duì)我國(guó)CSF防制具有重要的指導(dǎo)意義，對(duì)建立該病毒的全球監(jiān)測(cè)體系具有深遠(yuǎn)意義。

中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所聯(lián)合軍事獸醫(yī)研究所、中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心將CSF流行病學(xué)信息數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)、GIS技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合。采用ArcGIS桌面產(chǎn)品、ArcMapObjects軟件和Delphi軟件，在中國(guó)數(shù)字地圖的數(shù)據(jù)支持下，創(chuàng)新性的建立了CSF流行病學(xué)信息系統(tǒng)(CSFinfo)，使我們成為全球繼德國(guó)之后第二個(gè)有這種數(shù)據(jù)庫(kù)的國(guó)家［5］。CSFinfo對(duì)加強(qiáng)CSF流行病學(xué)信息的統(tǒng)一管理，掌握全球CSF數(shù)據(jù)，分析CSF傳播來(lái)源，建立一整套連續(xù)、可靠、完整、系統(tǒng)的國(guó)內(nèi)外CSF流行病學(xué)資料，對(duì)我國(guó)CSF防控具有十分重要的意義。

2 豬瘟病毒致病機(jī)制

CSFV的3’UTR被認(rèn)為與病毒基因組的復(fù)制、翻譯以及復(fù)制和翻譯的調(diào)控有關(guān)，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)HCLV的3’UTR核苷酸的第61位有一個(gè)12-nt(CUUUUUUCUUUU)的插入序列，而在強(qiáng)毒SM株以及其它毒株中缺失。為研究這一特征性序列的生物學(xué)功能，構(gòu)建兩個(gè)突變株感染性cDNA克隆，一株是在強(qiáng)毒SM株基因組pT7SM感染性cDNA克隆 3’UTR的第 61位處插入了 12個(gè)堿基“CTTTTTTCTTTT”;另一個(gè)是 pT7SM 的3’UTR完全被HCLV基因組3’UTR所替換。結(jié)果兩個(gè)突變株在PK-15細(xì)胞上的增殖滴度比其親本株下降了約100倍，對(duì)實(shí)驗(yàn)用豬產(chǎn)生了明顯減毒的現(xiàn)象，有效誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體并使宿主完全抵抗致死劑量SM強(qiáng)毒的攻擊，與HCLV十分類似。表明HCLV 3’UTR的12個(gè)堿基插入對(duì)CSFV復(fù)制和毒力有著重要影響，與疫苗減毒有重要關(guān)系。該結(jié)果也提示CSFV的非編碼區(qū)突變可以影響病毒的毒力，這對(duì)理解CSFV的減毒機(jī)理以及開(kāi)發(fā)新一代疫苗提供理論依據(jù)［6］。

3 豬瘟診斷新技術(shù)

CSF的診斷多年來(lái)一直困擾著對(duì)該病的凈化策略，近年我國(guó)CSF診斷技術(shù)取得突破性進(jìn)展。病原分子診斷技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國(guó)際水平，同時(shí)建立了抗體阻斷ELISA方法和抗體間接ELISA方法。

3.1 病原學(xué)診斷技術(shù) 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和軍事獸醫(yī)研究所CSFV通用熒光RT-PCR試劑盒的建立，可對(duì)所有CSFV進(jìn)行檢測(cè)，該方法十分成熟和穩(wěn)定，獲國(guó)家專利(200610109404.X)并形成國(guó)標(biāo)(GB/T27540-2011)，特別對(duì)非典型、溫和型及持續(xù)感染CSF的診斷提供一個(gè)快速、敏感、準(zhǔn)確的方法，是適用于種豬凈化的可靠手段。我國(guó)CSF免疫采取的是100%強(qiáng)制免疫措施，建立快速、敏感、特異地檢測(cè)CSFV野毒的方法十分必要，CSFV MGB鑒別熒光RT-PCR方法的研制，為臨床鑒別野毒和疫苗毒提供了可靠的工具，該方法獲國(guó)家專利(CN2010242080.0)。歐盟CSF參考試驗(yàn)室根據(jù)已知毒株的基因序列，鎖定主要保護(hù)性抗原E2基因區(qū)域的2467～2738之間共272bp的片段作為序列測(cè)定和分析目標(biāo)，能反應(yīng)不同毒株抗原基因序列的變化特點(diǎn)，是用于毒株間系統(tǒng)發(fā)生分析的首選公認(rèn)區(qū)域［1］。本課題組對(duì)其改進(jìn)優(yōu)化，并進(jìn)行了12年的臨床應(yīng)用，該方法不僅可用于核酸的檢測(cè)和診斷，采用其擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序用于CSFV分子流行病學(xué)研究，達(dá)到了一舉兩得的目的［7］。

CSFV抗體標(biāo)記技術(shù)有免疫熒光技術(shù)和過(guò)氧化物酶標(biāo)記技術(shù)，也是OIE推薦的CSF病原檢測(cè)技術(shù)之一。采用從英國(guó)AHVLA實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的CSFV E2單抗WH303作為一抗，標(biāo)記辣根過(guò)氧化酶的兔抗鼠二抗，建立了免疫過(guò)氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)染色方法，用于CSFV TCID50檢測(cè)、疫苗定量、病毒分離鑒定、拯救重組CSFV的鑒定［8-9］，具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。直接對(duì)單抗WH303進(jìn)行熒光素標(biāo)記，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)蛋白抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見(jiàn)抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。我所和軍事獸醫(yī)研究所采用該單抗(WH303)分別建立了CSFV免疫熒光試驗(yàn)和CSFV間接免疫熒光試驗(yàn)，較多抗標(biāo)記法更特異和準(zhǔn)確，容易分辨，錯(cuò)判誤判率會(huì)大大減少，田間推廣應(yīng)用容易，是CSF凈化的一項(xiàng)準(zhǔn)確、特異和簡(jiǎn)便的技術(shù)。

3.2 抗體檢測(cè)技術(shù) CSF抗體水平檢測(cè)是疫苗免疫效果評(píng)價(jià)的主要方法，ELISA方法以其操作簡(jiǎn)便、敏感、檢測(cè)樣本量大等優(yōu)點(diǎn)成為其主要手段，研發(fā)國(guó)產(chǎn)化的準(zhǔn)確度高的CSF抗體ELISA檢測(cè)試劑盒勢(shì)在必行。本實(shí)驗(yàn)室采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得CSFVE2基因可溶性表達(dá)產(chǎn)物(CN200810223406.0)，突破了診斷用抗原的關(guān)鍵制備技術(shù);對(duì)單抗WH303進(jìn)行純化和FITC標(biāo)記，分別建立了 CSF間接ELISA方法和阻斷ELISA方法［10］。

抗體間接ELISA方法:采用中和實(shí)驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)與間接ELISA對(duì)232個(gè)陽(yáng)性樣本和242個(gè)陰性樣本進(jìn)行符合實(shí)驗(yàn)，其敏感性符合率為90.95% ，特異性符合率為94.21%，兩種方法的總符合率為92.62%。該方法具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高等特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)血清中E2蛋白多抗的檢測(cè)，可全面反應(yīng)豬體內(nèi)抗體水平，適用于田間大規(guī)模免疫抗體水平普查、商品豬場(chǎng)免疫效果評(píng)價(jià)和不同免疫水平豬群的分群。

抗體阻斷ELISA檢測(cè)方法，對(duì)PRRSV、PRV、PCV、PPV、BVDV等病毒性疾病抗體(CSF抗體為陰性)無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)285份臨床血清樣本的檢測(cè)結(jié)果表明，與IDEXX試劑盒的特異性為94.2%，敏感性為98%，兩種方法的符合性為97.5%。由于采用單抗WH303作為酶標(biāo)抗體，大大了降低非特異性反應(yīng)。該方法除用于田間大規(guī)模普查外，尤其適用于規(guī)?；N豬場(chǎng)和重點(diǎn)疫區(qū)抗體監(jiān)測(cè)。制備成本較低，穩(wěn)定性好，為我國(guó)CSF抗體水平的監(jiān)測(cè)提供了重要的技術(shù)支持。

3.3 豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法的建立 豬瘟兔化弱毒株是世界公認(rèn)的最安全、免疫效果最好的疫苗毒株，也是我國(guó)唯一使用的豬瘟疫苗毒株。由于家兔個(gè)體差異和標(biāo)準(zhǔn)化程度不高、檢測(cè)周期長(zhǎng)有關(guān)，無(wú)疑提高了疫苗儲(chǔ)藏成本，因此家兔熱反應(yīng)對(duì)疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，建立新的準(zhǔn)確簡(jiǎn)便的替代方法，提高疫苗檢測(cè)質(zhì)量，對(duì)其質(zhì)量監(jiān)控至關(guān)重要。我們建立的HCLV熒光定量PCR方法和單抗WH303直接免疫熒光檢測(cè)方法與兔熱反應(yīng)比較，三者之間存在良好相關(guān)性，對(duì)CT值在17.10～20.81，病毒含量在8.27 ×104～1.11 ×106copy/μL，TCID50值在 10-2.88/0.1 ～10-4.54/0.1 mL 之間的疫苗半成品原液，可以按半成品疫苗原液每毫升能引起100萬(wàn)個(gè)兔體定型熱反應(yīng)進(jìn)行配苗［11］。為疫苗效檢提供了一種快速、敏感、特異的方法，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的兔熱反應(yīng)方法，更準(zhǔn)確、快速指導(dǎo)疫苗的生產(chǎn)，縮短生產(chǎn)周期，產(chǎn)生更明顯的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

應(yīng)歐盟CSF參考實(shí)驗(yàn)室邀請(qǐng)，中監(jiān)所從2009到2011年連續(xù)3年參加歐盟CSF參考實(shí)驗(yàn)室組織的來(lái)自42個(gè)國(guó)家50個(gè)實(shí)驗(yàn)室的CSF診斷比對(duì)實(shí)驗(yàn)。采用了本實(shí)驗(yàn)室建立的CSFV通用熒光RT-PCR方法、CSFV鑒別熒光MGB-RT-PCR方法和CSFV RT-nPCR方法，病原檢測(cè)結(jié)果與歐盟完全一致;采用本實(shí)驗(yàn)室建立的CSF抗體間接ELISA和阻斷ELISA方法，僅間接ELISA對(duì)一個(gè)盲樣反應(yīng)結(jié)果為陰性或可疑，其余樣本完全符合。3次國(guó)際比對(duì)、國(guó)內(nèi)比對(duì)以及我們的大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中監(jiān)所研制的系列方法彌補(bǔ)了我國(guó)CSF病原檢測(cè)的空白，組裝的CSF病原檢測(cè)試劑盒相關(guān)指標(biāo)達(dá)到歐盟參考實(shí)驗(yàn)室技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，抗體檢測(cè)試劑盒相關(guān)指標(biāo)達(dá)到了進(jìn)口商品化試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)?？蓪?shí)現(xiàn)CSF病原檢測(cè)和CSF抗體檢測(cè)試劑盒的國(guó)產(chǎn)化，提升我國(guó)CSF診斷水平，為獲得國(guó)際貿(mào)易認(rèn)可鋪平了道路，具有很好的推廣應(yīng)用前景和極大的產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。

通過(guò)和歐洲的交流及合作，提升了科技創(chuàng)新能力，解決CSF準(zhǔn)確診斷的關(guān)鍵問(wèn)題，建立了良好的國(guó)際合作渠道，提升了該實(shí)驗(yàn)室的國(guó)際地位，建立并完善我國(guó)系列CSF診斷技術(shù)，進(jìn)而改進(jìn)和完善我國(guó)CSF預(yù)防控制策略。至此，我們?cè)贑SF診斷、疫情監(jiān)測(cè)、分子流行病學(xué)調(diào)查分析等所需的檢測(cè)方法已經(jīng)系統(tǒng)建立，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)建立和掌握CSF診斷技術(shù)最全的實(shí)驗(yàn)室之一。

4 標(biāo)記疫苗的研究

由于HCLV接種豬與自然感染豬不能從血清學(xué)上予以區(qū)分，我國(guó)CSF防控實(shí)行的是強(qiáng)制免疫措施，開(kāi)發(fā)CSF標(biāo)記活疫苗對(duì)于我國(guó)CSF凈化和參與國(guó)際貿(mào)易具有現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用反向遺傳操作技術(shù)，在C株感染性克隆的E1 C末端插入FLAG基因作為標(biāo)記分子，構(gòu)建了含有FLAG標(biāo)記的vC-FLAG病毒。細(xì)胞適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)證明vC-FLAG病毒可以適應(yīng)多種豬源細(xì)胞，SK6細(xì)胞系是培養(yǎng)vC-FLAG的最適細(xì)胞系。不同代次病毒經(jīng)免疫組化、RT-PCR和核苷酸序列測(cè)定證明嵌合病毒能穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)記抗原，且在細(xì)胞中傳代的遺傳穩(wěn)定性良好，為CSF標(biāo)記疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

5 豬瘟凈化策略研究

CSF是我國(guó)政府計(jì)劃要根除的重要傳染病，通過(guò)“十一五”支撐計(jì)劃《豬瘟、豬偽狂犬病綜合防空集成與示范》的實(shí)施，集成上述技術(shù)，按照準(zhǔn)備階段→控制階段→強(qiáng)制凈化階段→監(jiān)測(cè)階段→認(rèn)證階段等五個(gè)凈化程序，通過(guò)對(duì)CSF快速診斷試劑盒、疫苗毒株和致病毒株鑒別診斷方法的篩選和整合，免疫程序的調(diào)整，生物安全措施的綜合實(shí)施。對(duì)CSF嚴(yán)重污染場(chǎng)，CSF病原陽(yáng)性率分別從2006年的7.08% ～11.49%下降至 2010年的0% ～2.07%，達(dá)到基本清除CSF的目標(biāo);對(duì)CSF一般污染場(chǎng)，陽(yáng)性率分別從0.87% ～3.09%下降至0%，清除CSF。CSF免疫合格率總體上升，從2006年的67.30% ～90.67%上升至2010年的 85.00% ～96.32%。達(dá)到了基本無(wú)疫或無(wú)疫，成功在15個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬示范場(chǎng)使7個(gè)場(chǎng)凈化了CSF，示范場(chǎng)生產(chǎn)指標(biāo)得到了全面改善，經(jīng)濟(jì)效益穩(wěn)步提升，提升了養(yǎng)豬場(chǎng)的理論水平和疫病防控能力。構(gòu)建了符合我國(guó)國(guó)情的規(guī)?；i場(chǎng)CSF和豬偽狂犬病的不同凈化模式，形成了一系列的指導(dǎo)方案，制定了《規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)集成與示范實(shí)施方案》、《規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟凈化技術(shù)指南》、《集約化、規(guī)?；i場(chǎng)生物安全體系的實(shí)施方案》和《“豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)集成與示范”課題種豬凈化認(rèn)證方案建議》等指南，取得的重要?jiǎng)?chuàng)新性成果，可用于指導(dǎo)我國(guó)CSF的防控和凈化。

CSF困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)半個(gè)多世紀(jì)，目前依然是各級(jí)政府計(jì)劃要根除的重大豬病。上述研究表明CSF的病毒基因組比較穩(wěn)定，且只有一個(gè)血清型，對(duì)該病毒的清除是一個(gè)有利條件。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的診斷技術(shù)已經(jīng)達(dá)到國(guó)際技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，并被國(guó)際上認(rèn)可。尤其是“十一五”期間對(duì)我國(guó)部分養(yǎng)豬場(chǎng)凈化CSF的成功先例表明，在我國(guó)目前豬病流行狀態(tài)下，在規(guī)?；i場(chǎng)和部分區(qū)域開(kāi)展CSF的凈化是完全可行的。

致 謝: 感謝軍事獸醫(yī)研究所涂長(zhǎng)春教授，中國(guó)動(dòng)物與衛(wèi)生流行病學(xué)中心黃保續(xù)教授及英國(guó)AHVLA Trevor Drew教授給予的幫助。

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