大鼠海馬損毀與學習記憶研究進展

黃曉科 銀曉勇 黃艷秋 李艷君 (河北省峰峰集團邯鄲醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分，參與了情緒、學習和記憶、行為、免疫等的調(diào)節(jié)，目前發(fā)現(xiàn)成年海馬神經(jīng)發(fā)生可能有幾種潛在的功能，包括學習和記憶的適應作用、對新環(huán)境的適應、與低沉情緒的潛在聯(lián)系以及對損傷的可能反應〔1〕。海馬結(jié)構(gòu)和功能的研究是當前腦科學領域研究的熱點，損毀法是研究腦海馬功能定位的常用方法之一。

目前海馬毀損的實驗動物模型的滯后制約了海馬的研究，隨著海馬損毀模型的完善，我們將能夠越來越好地研究海馬與認知的關系。已有的毀損海馬模型，總的來說，包括物理損毀，化學損毀和電損毀。

1 物理方法

1.1 切斷開穹窿海馬傘通路 早在1954年，Daitz等人就采用橫斷穹窿海馬傘系統(tǒng)來研究觀察神經(jīng)元的退化過程。后來人們?yōu)榱诉M行AD方面的研究，采取了真空抽吸、橫斷或電解等方法損毀單側(cè)或雙側(cè)穹窿海馬傘通路建立AD模型〔2，3〕。此種方法主要是通過切斷隔海馬通路(如扣帶束、背穹窿海馬傘)，破壞膽堿能及非膽堿能纖維傳入，導致實驗動物行為及神經(jīng)化學方面的缺損，造成動物空間定向和記憶障礙及膽堿能神經(jīng)元的丟失。步驟:將大鼠用以10%水合氯醛3.5 ml/kg劑量，對實驗大鼠行腹腔注射將其麻醉后，固定于腦立體定位儀，常規(guī)消毒、剪毛，正中切開頭皮，暴露出顱骨，于前囟自后1.5 mm，中線外左右1.0 mm處，用電動開顱器鑿開顱骨，切開硬腦膜，用自制的雙刃刀先置于上述部位的腦表面(相當于彎窿部位)，續(xù)降刀6 mm，切斷彎窿，降刀時間約1 min，假手術(shù)組降刀2 mm，(未切彎窿)，刀在腦中均停留5 min。清潔顱面，縫合頭皮。用此方法建立模型，周期短(約2 w)，但手術(shù)定位難以控制，很難避免手術(shù)區(qū)鄰近組織的受損。

胡謀先等〔4〕用手術(shù)的方法直接橫切大鼠雙側(cè)隔一海馬通路。腹腔麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀上，用一把三面有刃的特制刀片在前囟后1.8 mm、距中線1 mm，自顱骨表面垂直插入5 mm橫切距離4 mm切斷雙側(cè)海馬傘及部分穿隆。術(shù)后大鼠記憶力顯著下降。He等〔5〕采用單側(cè)彎窿傘損傷，主要破壞膽堿能通路，致使其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的完整性破壞，海馬膽堿能纖維減少，大鼠學習記憶力下降。

1.2 液壓打擊 液壓損傷法(FPI)由Lindgren于1966年首先報道，1976年使用于貓及兔正中液壓打擊，1987年 Dixon等〔6，7〕建立了大鼠液壓沖擊顱腦損傷模型。至1989年改進為嚙鼠動物單側(cè)半球液壓沖擊〔8，9〕。側(cè)方液壓沖擊模型在2002年后廣泛用于小動物TBI模型的制備。其原理是通過液壓裝置有然改變密閉顱腔內(nèi)壓力而間接造成腦損傷。根據(jù)顱骨鉆孔的位置不同，可將模型分為正中沖擊和側(cè)位沖擊兩種。該法受外界因素如動物頭顱發(fā)育的差異影響小，穩(wěn)定性和重復性好，定性及可控性較強。

海馬損傷模型的建立參照大鼠腦立體定位圖譜明確海馬結(jié)構(gòu)對應腦皮層位置(海馬結(jié)構(gòu)基本位于前囟后1.8～6.0 mm，中線旁0.5～5 mm范圍內(nèi)皮層下)，確定于頂骨開骨窗部位。以10%水合氯醛3.5 ml/kg劑量，對實驗大鼠行腹腔注射，常規(guī)備皮、消毒，頂部正中切口，分離暴露頂骨。選擇前囟后3.5 mm，矢狀縫右側(cè)3 mm處鉆孔開骨窗，骨窗直徑為3 mm，注意保持硬腦膜的完整性。連接固定顱骨連接管，封閉液壓打擊系統(tǒng)。待大鼠恢復角膜反射及夾尾反射后再進行液壓打擊。此模型借助國際上通用的MODEL01-B液壓打擊裝置對大鼠進行分組打擊。

缺點:沖擊后裝置內(nèi)壓力不能立即釋放，腦組織可再次受損傷，伴有不同程度局部腦挫傷的彌漫性腦損傷，挫傷范圍及周圍水腫程度隨打擊力度增加而增大。如果想對海馬結(jié)構(gòu)進行有效打擊，則液壓打擊部位的選擇和打擊力度的控制尤為重要。如不加以重視，則會對海馬以外腦組織造成較大范圍損傷，加重大鼠意識及運動功能等障礙，掩蓋因海馬結(jié)構(gòu)損傷所致的學習記憶功能障礙，致使實驗結(jié)果不準確。如果打擊沖擊道波和(或)經(jīng)過鼠腦中線部位，甚至會對腦干、丘腦等重要結(jié)構(gòu)造成直接損害，明顯增加實驗組大鼠的傷情和死亡率。

林云鵬〔10〕用改進的液壓打擊海馬損傷模型觀察大鼠傷后空間學習能力發(fā)現(xiàn):各實驗組大鼠均可見程度不同的MR影像特征、病理學特征改變;除輕型打擊組外，水迷宮逃避潛伏期及游泳距離均與對照組間存在顯著差異。

2 電損毀

近年來電毀損建立模型在實驗研究中得到廣泛應用。電毀損即用金屬電極通過直流電在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)造成損傷，其機制是離子流能誘發(fā)細胞發(fā)生不可逆性代謝改變，最終導致細胞死亡。由陽極電流造成的損傷，無論在損傷的大小及形狀上均易于重復，而且損傷的程度可以通過電流強度及通電時間進行調(diào)節(jié)〔11〕。

以水合氯醛(35 mg/kg)腹腔麻醉，麻醉生效時間3～5 min，麻醉生效后將常規(guī)備皮、消毒，頂部正中切口，分離暴露頂骨。選擇前囟后3.5 mm，矢狀縫兩側(cè)3 mm處鉆孔開骨窗，骨窗直徑為3 mm，注意保持硬腦膜的完整性，按《大鼠立體定位圖譜》確定海馬位置海馬結(jié)構(gòu)基本位于前囟后1.8～6.0 mm，中線旁0.5～5 mm范圍內(nèi)皮層下，用直流電陽極電解雙側(cè)海馬。電解損毀的最大不足是損毀特異性不強，它不僅定位損毀神經(jīng)元，同時也損毀輸入纖維和過路纖維，往往導致?lián)p毀部位與損毀效應關系的不確定。

方崇儀〔12〕利用局部電解損傷雙側(cè)海馬的腹前部、后部和背前部對大白鼠避暗行為的學習和記憶的影響，結(jié)果表明;局部損傷海馬各部可以不同程度地阻礙這種行為模式的學習和記憶，其中以損傷腹前部最為嚴重，依次是損傷后部和背前部，但是對大白鼠避光嗜暗的本能沒有影響。

方崇儀〔13〕利用廣泛的電損毀雙側(cè)海馬背部或腹部觀察對大白鼠避暗行為的學習和記憶的影響。結(jié)果表明:廣泛的雙側(cè)損毀海馬背部或腹部，可明顯阻礙大白鼠避暗行為的學習和記憶，尤以損毀腹部更為嚴重，但是對大白鼠避光嗜暗的本能和電防御反應的敏感性等均無影響。提示廣泛的雙側(cè)損毀海馬背部或腹部可能阻礙暗間成為電擊“信號”的學習過程及其痕跡的保持，而海馬腹前部可能與這些過程有更密切的關系。

3 化學毀損

1980 年Ben-An、1985年Sofroniew等分別報道用興奮性神經(jīng)毒氨基酸，如紅藻氨酸(KA)、鵝膏蕈氨酸(IBD)、使君子氨酸(QUIS)、N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)注入大鼠 NBM，可以損毀大鼠NBM建立癡呆模型〔14～16〕。隨后，國內(nèi)外一些科研工作者采用上述方法建立了AD模型，并在此基礎上進行了關于AD的一系列研究。1987年方崇儀等〔17〕利用KA損傷海馬各區(qū)來觀察海馬結(jié)構(gòu)與大白鼠避暗行為的學習和記憶關系。神經(jīng)毒氨基酸可導致海馬各區(qū)的膽堿能神經(jīng)元變性和減少，繼而引進相應膽堿能纖維減少，細胞變性與死亡，膽堿能的標志酶ChAT和AChE含量下降，學習記憶行為減退。因此，這種神經(jīng)興奮毒性氨基酸可作為腦內(nèi)局部去神經(jīng)元的工具藥而用于研究〔18，19〕，使用神經(jīng)興奮毒性氨基酸，腦組織內(nèi)微量注射可使注射部位神經(jīng)元變性死亡，而通過注射部位的神經(jīng)纖維卻安然無恙。

實驗大鼠以水合氯醛(35 mg/kg)腹腔麻醉，按《大鼠立體定位圖譜》確定海馬位置海馬結(jié)構(gòu)基本位于前囟后1.8～6.0 mm，中線旁0.5～5 mm范圍內(nèi)皮層下將大鼠固定在腦立體定位儀上，剪開頭皮后用過氧化氫清洗創(chuàng)面，確定前囟平面為參考平面，按確定的坐標在腦顱上打孔，然后將進樣器針頭緩緩插入到預定部位使用海人酸或使君子氨酸雙側(cè)損毀。手術(shù)完成后，每實驗動物肌肉注射1萬單位慶大霉素。

興奮性神經(jīng)氨基酸能擴散到遠離注射腦區(qū)，意外地損及易傷的神經(jīng)元，干擾結(jié)果的分析，由于毒性太大，海馬對興奮性神經(jīng)毒氨基酸的興奮作用比較敏感，如果損毀劑量或位置不適當就很容易導致實驗失敗甚至實驗動物的死亡。因此在損毀時要十分注意。但化學損毀如果工具藥選擇得當，其損毀作用是相當特異的。

方崇儀〔17〕利用KA損傷海馬各區(qū)觀察海馬結(jié)構(gòu)與大白鼠避暗行為的學習和記憶關系發(fā)現(xiàn)損毀兩側(cè)海馬背部與背前部的錐體細胞，但是幾乎無損于大白鼠避暗行為的學習和記憶。損毀海馬的腹前部、腹部和后部的CA3和CA4區(qū)錐體細胞，避暗行為的學習和記憶受嚴重障礙。Hendelmenn等〔20〕發(fā)現(xiàn)KA注入海馬內(nèi)，選擇地損及大白鼠的CA3錐體細胞，并障礙了大白鼠在輻射迷宮中的學習和記憶，其中單獨損及海馬前部或后部的障礙較輕，而同時損及海馬前部和后部的最為嚴重。Sutherland等〔21〕報道了用KA損傷單側(cè)海馬CA3，CA4區(qū)錐體細胞，并不影響大白鼠在水中的空間定位學習，而雙側(cè)的損傷對其才有影響。

海馬損毀對學習和記憶的影響結(jié)果表明，海馬在認知過程中扮演重要的過程，海馬不同的區(qū)域在認知過程中扮演不同的角色，不同區(qū)域在不同的認知中起的作用不同。海馬是參與學習和記憶的，但并非參與任何學習任務的習得和記憶，有些類型的學習，海馬并非是必需的;同時海馬不同區(qū)域，其參與程度也并非完全相同。雖然海馬在學習、記憶中的作用研究的時間最長，研究工作最多，然而，真正機制還有待研究。

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