腦缺血耐受中線粒體及細(xì)胞色素C的作用

蘇 靜 姜長斌 尹 劍 劉 琳 (大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院癲癇門診，遼寧 大連 116027)

腦動脈自然閉塞或由于治療疾病原因而人為閉塞可能會造成腦缺血損害，其發(fā)展取決于很多病理生理機制的內(nèi)在聯(lián)系，例如神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、膜離子成分的崩潰、線粒體功能障礙、凋亡機制的觸發(fā)、反應(yīng)性氧的產(chǎn)生、炎性細(xì)胞的釋放、血腦屏障的破壞、微循環(huán)灌注的障礙及很多其他因素〔1～4〕。這些反應(yīng)可以被多種神經(jīng)保護(hù)機制抵消。研究表明，短暫缺血可啟動機體自身保護(hù)機制，提高組織缺血、缺氧的耐受性，此現(xiàn)象稱為缺血預(yù)處理或預(yù)處理(IPC)的保護(hù)作用。1986年IPC作為心血管保護(hù)的辯論形式由Murry首次提出，認(rèn)為短暫的缺血損傷能保護(hù)心肌避免發(fā)生后續(xù)的致死性壞死。目前IPC的研究以心、腦報道最多。腦缺血預(yù)處理或神經(jīng)缺血預(yù)處理(NIPC)是由多種低于永久性損害刺激形成的機體內(nèi)在的神經(jīng)保護(hù)措施，能使神經(jīng)系統(tǒng)增加抵抗致死性缺血性損害的能力，不易形成永久性缺血損害〔1〕。雖然缺血預(yù)處理的腦保護(hù)作用得到廣泛的認(rèn)可，但其發(fā)生的機制以及如何最大可能地開發(fā)和利用這種內(nèi)源性腦保護(hù)機制，使缺血性腦損害降至最低程度，仍然是一個待解的課題。

1 腦缺血預(yù)處理(BIP)和腦缺血耐受現(xiàn)象

BIP是指通過亞致死性的短暫腦缺血過程，誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機制，使之在一定程度上耐受或減輕再次發(fā)生的腦缺血損傷。其所誘導(dǎo)的耐受叫做腦缺血耐受(BIT)〔5〕，表現(xiàn)為實質(zhì)細(xì)胞死亡明顯減少、梗死范圍大幅度縮小、器官功能障礙明顯減輕等。1987年，Tomida在心臟中觀察到IPC現(xiàn)象，并對此作了詳細(xì)描述。隨后，在哺乳動物的大多數(shù)器官(腦、脊髓、骨骼肌、肺、腎、小腸等)中都發(fā)現(xiàn)了這一有趣的現(xiàn)象。1990年，日本學(xué)者Kitagawa采用沙土鼠前腦缺血模型首先發(fā)現(xiàn)海馬缺血耐受現(xiàn)象。近年來對BIP機制進(jìn)行了廣泛研究，越來越多的資料表明:BIP是一個涉及介質(zhì)、受體、基因表達(dá)等多環(huán)節(jié)調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程〔6，7〕。

1.1 IPC保護(hù)作用的形成機制 NIPC保護(hù)作用實際上是短暫缺血啟動機體內(nèi)源性保護(hù)機制，提高神經(jīng)元、組織對缺血的耐受能力。從整體上看，NIPC改善了腦血流量，由于短暫腦缺血，導(dǎo)致腦側(cè)支循環(huán)形成，腦血流量增加，延緩腦細(xì)胞壞死，在腦血管完全梗死時加以代償。機體在受到刺激損傷時，釋放出大量內(nèi)源性物質(zhì)，并通過一定的調(diào)控機制在不同時間、不同濃度、不同地方表現(xiàn)出不同作用，可能是損傷，也可能是保護(hù)作用。

從細(xì)胞防御機制看，炎性細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)、內(nèi)皮細(xì)胞及相應(yīng)缺血組織、臟器實質(zhì)細(xì)胞均介導(dǎo)了損傷過程;從分子水平看，大量的代謝產(chǎn)物(如腺苷、自由基等)、遞質(zhì)、受體及新合成或分泌產(chǎn)物(如細(xì)胞因子等)等在不同時間、不同程度介導(dǎo)損傷。蛋白質(zhì)的基因也出現(xiàn)相應(yīng)改變，調(diào)控著機體病理生理改變(如即刻早期反應(yīng)基因、抑凋亡基因、促凋亡基因等)。研究表明〔4〕，上述各種損傷因子均在一定程度、一定時間表現(xiàn)出抗損傷作用。因此，如何調(diào)控好損傷和抗損傷的關(guān)系，使機體朝著有利的方向發(fā)展，將是最終解決缺血、缺氧損傷的重要手段。

1.2 NIPC的時間過程 IPC作用對如何選擇合適的缺血間期至關(guān)重要，多數(shù)實驗表明，IPC神經(jīng)保護(hù)作用存在快速相、延遲相兩個階段。第一階段的保護(hù)作用在IPC后數(shù)分鐘即可表現(xiàn)出來，稱作“經(jīng)典”的IPC保護(hù)效應(yīng)，有效期短暫，1～2 h之后消失。形成機制是由翻譯后修飾中介的獨立的蛋白合成所引起。該階段的研究以循環(huán)系統(tǒng)最為深入，而對中樞神經(jīng)系統(tǒng)則爭議甚大，認(rèn)為IPC后早期對再次腦缺血不表現(xiàn)出保護(hù)作用。腦內(nèi)同樣存在IPC的快速相保護(hù)作用，大鼠在接受10 min缺血性損害前30 min接受2 min的IPC比單純接受10 min缺血性損害能顯示出更強的神經(jīng)保護(hù)作用，引起了人們的關(guān)注。IPC是由于適應(yīng)缺血應(yīng)激反應(yīng)的流動媒介機制或細(xì)胞代謝機制引發(fā)的〔3〕。第二階段也稱為IPC保護(hù)作用的“第二窗口”(the second window)，由IPC應(yīng)激引發(fā)形成遲發(fā)保護(hù)。有學(xué)者認(rèn)為“第二窗口”的保護(hù)作用出現(xiàn)在IPC后大約72 h，2 w內(nèi)逐漸消退。然而也有不同看法，Kato等報道IPC后24 h即可表現(xiàn)出顯著的腦保護(hù)作用，并可持續(xù)到IPC后5～7 d。其形成機制可能有基因復(fù)制和蛋白合成引起〔8〕。由于第二階段的保護(hù)作用持續(xù)時間較為固定，與臨床有潛在的關(guān)系，最近的研究重點多集中在IPC的遲發(fā)相上〔9〕。現(xiàn)在公認(rèn)遲發(fā)相NIPC是一個由IPC刺激引發(fā)表型改變的一套多級過程和其他機制介導(dǎo)的保護(hù)因素〔4〕。快速相和延遲相的NIPC是不同的，在體內(nèi)，快速相NIPC似乎只能提供短暫的神經(jīng)保護(hù)作用，延緩了神經(jīng)死亡的時間過程，而不能保證長期的神經(jīng)元生存。

1.3 NIPC與短暫性腦缺血發(fā)作(TIA) TIA很久以來被認(rèn)為是腦梗死的重要危險因素。近年實驗證實，一次短暫的亞致死性腦缺血可對腦細(xì)胞起到保護(hù)作用，使再次腦缺血時腦組織的病變比單次腦缺血時輕。臨床證據(jù)也顯示，病人在腦梗死之前若經(jīng)歷過同側(cè)的TIA發(fā)作，較那些沒有發(fā)生過TIA的患者恢復(fù)情況要好〔10〕。TIA作為IPC刺激能引發(fā)神經(jīng)保護(hù)，改善腦卒中的預(yù)后〔10〕。區(qū)別TIA的危險和保護(hù)作用是困難的，因為TIA是一類腦血管疾病的臨床診斷，其持續(xù)時間、位置、嚴(yán)重性和次數(shù)均有不同〔11〕。多元回歸分析中預(yù)后差別的唯一參數(shù)是前驅(qū)TIA發(fā)作，因此，TIA對病人和臨床醫(yī)生是一個潛在血管疾病警示，可以運用可能的臨床裝置—體外模型IPC信號傳感器，來指導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)治療和預(yù)判腦組織缺血耐受性的自然發(fā)生情況，從而減少閉塞血管之后腦卒中發(fā)生的可能性。

另一方面，當(dāng)頻繁TIA發(fā)生，時間間隔很短，則可能遮蔽了以前引發(fā)的腦保護(hù)作用，造成嚴(yán)重缺血。如果把前驅(qū)TIA作為小面積或不嚴(yán)重缺血的IPC，有前驅(qū)TIA病人的灌注缺陷應(yīng)該不同于無TIA發(fā)作的病人。而事實上，在有前驅(qū)TIA發(fā)作的病人和無TIA發(fā)作的病人中，灌注損害的大小和腦血流量(CBF)及腦血容量(CBV)沒有差別，顯示兩組病人血流限制、微血管功能紊亂程度和嚴(yán)重性相同，然而，有前驅(qū)TIA發(fā)作病人的梗死面積更小〔12〕。輕微的整個IPC損害，顯著地減少了永久性大腦中動脈閉塞(PMCAO)的梗死面積，解釋這種現(xiàn)象只能考慮有腦缺血預(yù)處理的機制作用。

2 腦缺血耐受中的凋亡機制

目前比較普遍的認(rèn)為，在腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損傷過程中，在缺血發(fā)生迅速且程度較重的中心區(qū)域常發(fā)生壞死，而正常腦組織與壞死腦組織之間半暗帶區(qū)的細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡。凋亡的發(fā)生既是凋亡相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果，又受內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)，它的轉(zhuǎn)歸可直接影響梗死灶的范圍，因此保護(hù)這部分細(xì)胞對腦缺血的治療具有重要的意義。腦缺血預(yù)處理可以通過抑制細(xì)胞凋亡來減輕腦缺血缺氧損傷。

2.1 細(xì)胞凋亡的基本概念 “細(xì)胞凋亡(apoptosis)”是“程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)”的一種形式，是一種生理性、主動性的細(xì)胞“自殺行為”。細(xì)胞程序化死亡最早是由Lockshin和Wiliams在1965年提出。隨后在1972年，Kerr等描述一種在形態(tài)學(xué)上和壞死完全不同的細(xì)胞死亡類型，并稱之為凋亡(apoptosis)。其形態(tài)學(xué)特點如下:①細(xì)胞和胞核皺縮，體積縮小。②核染色質(zhì)濃縮，凝集至核膜周邊，呈月芽形斑塊狀。③細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不受損害。④細(xì)胞膜內(nèi)陷將整個細(xì)胞分割成數(shù)個大小不等的不連續(xù)小體，內(nèi)有部分細(xì)胞器，有或沒有核碎片，稱為凋亡小體。⑤凋亡小體被吞噬細(xì)胞吞噬，不引起炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡最顯著的生化特征是Ca2+、Mg2+依賴的內(nèi)源性核酸酶的激活將核染色體從核小體間斷裂，形成由大約為180～200 kb低聚核小體片段，瓊脂糖凝膠電泳可見特征性的“梯狀”(ladder)帶，此特征被認(rèn)為是鑒別細(xì)胞凋亡的一個試金石。細(xì)胞凋亡是機體在生長、發(fā)育和受到外來刺激時清除多余、衰老和受損傷的細(xì)胞以保持機體內(nèi)環(huán)境平衡和維持正常生理活動過程的一種自我調(diào)節(jié)機制。這種調(diào)節(jié)機制的異常與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如癌癥的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)，而老年性癡呆、缺血性卒中等均與凋亡有關(guān)。目前對細(xì)胞凋亡的研究已經(jīng)涉及腫瘤生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、免疫生物學(xué)等方面，已經(jīng)取得很多突破性的成果。

單細(xì)胞個體無凋亡現(xiàn)象，而多細(xì)胞生物多數(shù)有凋亡現(xiàn)象。凋亡可自發(fā)產(chǎn)生，但多數(shù)情況下需特殊介導(dǎo)物或條件誘導(dǎo)產(chǎn)生。已發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)物有三類:①激素及生長因子;②免疫細(xì)胞;③毒素、損傷、射線、高溫、某些化學(xué)物質(zhì)等理化因素及生物因素。

細(xì)胞凋亡作為一個獨特的細(xì)胞死亡過程，表現(xiàn)許多獨特的細(xì)胞現(xiàn)象。在生化水平，凋亡過程中，細(xì)胞發(fā)生一系列的基因表達(dá)及蛋白合成。目前，發(fā)現(xiàn)許多相關(guān)的基因影響細(xì)胞凋亡，在神經(jīng)系統(tǒng)，現(xiàn)已知與凋亡相關(guān)的基因基本上分為兩大類:一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，如bax、bcl－xs等，另一類是抑制細(xì)胞凋亡的基因，如bcl－2、bcl－xl等。凋亡基因和抗凋亡基因之存在綜合平衡，平衡失調(diào)可啟動一系列生物事件的連鎖反應(yīng)，進(jìn)而改變細(xì)胞對凋亡的抵抗力〔13〕。

2.2 線粒體與細(xì)胞凋亡 近年來，人們對細(xì)胞凋亡的認(rèn)識逐漸深入，對細(xì)胞凋亡發(fā)生機制的了解越來越透徹，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控等方面都取得了顯著的進(jìn)展。尤其是對線粒體在細(xì)胞凋亡過程中重要作用的發(fā)現(xiàn)，更是引人注目，有人提出:線粒體在細(xì)胞凋亡中起決定性的作用〔14〕。

2.2.1 線粒體的功能 自1850年發(fā)現(xiàn)線粒體、1898年命名、1963年發(fā)現(xiàn)線粒體DNA(mDNA)后，人們又在線粒體中發(fā)現(xiàn)了RNA、DNA聚合酶、tRNA、核糖體、氨基酸活化酶等進(jìn)行 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯的全套裝備，表明線粒體具有獨立的遺傳體系。雖然線粒體也能合成蛋白質(zhì)，但是合成能力有限，線粒體中絕大部分蛋白質(zhì)都是核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)中合成后，定向轉(zhuǎn)運到線粒體的，因此線粒體是一種半自主性細(xì)胞器。真核細(xì)胞的線粒體是重要細(xì)胞器，是動物細(xì)胞生成ATP的主要場所。線粒體基質(zhì)的三羧酸循環(huán)酶系通過底物脫氫氧化生成NADH，NADH通過線粒體內(nèi)膜呼吸鏈氧化。與此同時，導(dǎo)致跨膜質(zhì)子移位形成跨膜質(zhì)子梯度和(或)跨膜電位。線粒體內(nèi)膜上的ATP合成酶利用跨膜質(zhì)子梯度能量合成ATP。合成的ATP通過線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體與細(xì)胞質(zhì)中ADP交換進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞的各種需能過程。

2.2.2 線粒體與細(xì)胞凋亡 線粒體是細(xì)胞的能量工廠，是真核細(xì)胞生存的基礎(chǔ)。越來越多的實驗證據(jù)表明，線粒體是細(xì)胞凋亡調(diào)控的活動中心。線粒體在細(xì)胞凋亡中的作用主要表現(xiàn)為〔15〕:①在凋亡發(fā)生過程中，多種促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白轉(zhuǎn)移至線粒體，從而使線粒體膜的通透性和完整性受到破壞。由于內(nèi)膜對氫離子的通透性增加引起線粒體膜電位消失;Bcl－2家族蛋白主要通過調(diào)節(jié)線粒體的功能來調(diào)控細(xì)胞的凋亡;②有多種凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體釋放，如細(xì)胞色素C、AIF、Smac/Diablo和 Caspase 前體蛋白 procaspase－2，－3，－8 和－9 等在凋亡發(fā)生過程中從線粒體膜間隙被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，隨后引起典型的凋亡變化;③有一些凋亡誘導(dǎo)物能夠誘導(dǎo)線粒體上的膜通透性轉(zhuǎn)變孔(PTP)開放，導(dǎo)致線粒體膜電位消失和釋放促凋亡蛋白。

2.3 線粒體通透性轉(zhuǎn)換與細(xì)胞凋亡

2.3.1 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔 線粒通透性轉(zhuǎn)運孔(MPTP)是一種跨膜多蛋白孔，其分子組成尚未完全清楚，目前認(rèn)為它是一個橫跨于線粒體外膜和內(nèi)膜之間的蛋白復(fù)合體。主要由位于線粒體外膜的孔蛋白，即電壓依賴的陰離子通道(VDAC)、內(nèi)膜的腺苷酸移位酶(ANT)、和基質(zhì)的親環(huán)蛋白D(CyD)組成三聯(lián)復(fù)合物。其功能受多種蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)，如膜間隙的肌酸肌酶，外膜的己糖激酶等。生理狀態(tài)的MPTP能通過小于1500 kD分子量的非特異性物質(zhì)，并允許質(zhì)子自由通過線粒體內(nèi)膜，從而在線粒體內(nèi)外造成電勢差，形成穩(wěn)定的膜電位，推動了線粒體ATP的合成。

2.3.2 線粒體通透性轉(zhuǎn)換與細(xì)胞凋亡 在受到特定刺激時(如鈣離子)，MPTP開放，直徑達(dá)2.0～2.6 nm，造成離子和一些凋亡活性物質(zhì)釋放，線粒體內(nèi)外電荷分布紊亂，線粒體膜除極化，導(dǎo)致膜電位下降，ATP生成減少，影響了呼吸鏈正常運轉(zhuǎn)。同時，基質(zhì)內(nèi)的吡啶核苷酸(PN)外流致使氧化代謝減弱，氧呼吸降低〔16〕。線粒體呼吸功能紊亂，組成線粒體抗氧化防御系統(tǒng)的PN－還原型煙酰胺二核苷酸(NAD(P)H)流失，都易使線粒體產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)。Ca2+也會從基質(zhì)通過MPTP釋放到線粒體外。由于線粒體基質(zhì)蛋白含量高，膠體滲透壓大，而內(nèi)膜通透性增加，使得水分子大量進(jìn)入線粒體基質(zhì)，離子的流動還可能造成線粒體基質(zhì)的晶體滲透壓增高，從而使線粒體膨脹，內(nèi)膜去折疊。由于內(nèi)膜面積遠(yuǎn)大于外膜，從而導(dǎo)致線粒體外膜破裂，使位于膜間隙的細(xì)胞色素C釋放。釋放出的細(xì)胞色素C則可能啟動casepase通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。腦缺血缺氧會引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)，從而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活凋亡程序。

3 細(xì)胞色素C與細(xì)胞凋亡

3.1 細(xì)胞色素C的釋放 線粒體是調(diào)控細(xì)胞凋亡的中心，細(xì)胞色素C是第一種被發(fā)現(xiàn)的線粒體釋放的促凋亡因子，細(xì)胞色素C釋放是線粒體凋亡途徑的標(biāo)志性事件。細(xì)胞色素C是水溶性的小分子物質(zhì)，分子量14.5 kU，核編碼的蛋白質(zhì)，是位于線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ和Ⅳ之間的基本組成部分，在傳遞電子和ATP生成過程中起重要作用。

生理情況下，線粒體內(nèi)膜對物質(zhì)通透具有高度選擇性，細(xì)胞色素C很難從內(nèi)膜進(jìn)入胞質(zhì)。關(guān)于細(xì)胞色素C釋放的機制，目前有不同的假說，但尚無定論。第一種是Bax依賴的線粒體外膜通透模型。鑒于Bax和Bak等在細(xì)胞色素C釋放中的不可或缺的作用，Bax可以在線粒體膜上形成多聚體并形成大通道使細(xì)胞色素C等促凋亡物質(zhì)從線粒體內(nèi)外膜之間釋放。也有人提出，Bax和Bak等正常情況不能與抑凋亡蛋白分子Bcl－2/Bcl－xL/Mcl－l相互結(jié)合。而僅含 BH3 結(jié)構(gòu)域的 Bcl－2 家族促凋亡蛋 白 tBid、Bim 等能與 Bcl－2/Bcl－Xl/Mcl－l 相互 作用，使Bax/Bak等從抑凋亡蛋白游離，進(jìn)而形成多聚體，促使線粒體膜通透，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。Shimizu等〔17〕認(rèn)為Bax或Bak與VDAC結(jié)合后，可以調(diào)節(jié)線粒體的膜電位，并導(dǎo)致細(xì)胞色素C從Bax/Bak和VDAC共同形成的大通道釋放，該小組應(yīng)用電生理方法檢測記錄到了這樣一個大通道的存在。目前有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡時，Bax從胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體上，促使細(xì)胞色素C釋放。同時發(fā)現(xiàn)Bax的62位半胱氨酸是其轉(zhuǎn)位所必需的，而126位半胱氨酸對其轉(zhuǎn)位沒有作用〔18〕。也有研究報道發(fā)現(xiàn)Bid/tBid也可以在人工脂質(zhì)體或平面上形成通道，Bid/tBid形成的通道有可能參與Bid/tBid誘導(dǎo)的線粒體釋放細(xì)胞色素C的過程〔19〕。盡管如此，還有報道在Bax/Bak缺失的細(xì)胞中，棉酚仍能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，很可能是通過誘導(dǎo)Bcl－2構(gòu)象變化來促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C釋放。這說明Bax和Bak對線粒體細(xì)胞色素C釋放不是絕對必需的。第二種模型認(rèn)為，PTP參與的外膜破裂，PTP開放使線粒體腫脹，外膜破裂，引起內(nèi)外膜間細(xì)胞色素C釋放。

3.2 細(xì)胞色素C啟動的細(xì)胞凋亡 最近的研究表明，活化的Casepase－3可以反過來作用于線粒體，引發(fā)線粒體細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C經(jīng)級聯(lián)反應(yīng)又可以激活Casepase－3，構(gòu)成細(xì)胞色素C釋放的正反饋調(diào)節(jié)機制〔20〕。有發(fā)現(xiàn)線粒體復(fù)合物Ⅲ的一個亞基能夠被活化的Casepase－3特異性切割介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放。線粒體細(xì)胞色素C釋放會促進(jìn)相應(yīng)的Casepase激活，同時激活的Casepase直接攻擊線粒體，進(jìn)一步引發(fā)更多的促凋亡因子從線粒體釋放，從而形成凋亡信號的正反饋。線粒體在這里成為細(xì)胞凋亡信號的放大器。在凋亡早期只有少量的細(xì)胞色素C的釋放，線粒體保持氧化磷酸化功能，提供凋亡需要的能量;一旦Casepase激活后反饋攻擊線粒體從而導(dǎo)致更多的線粒體細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中，導(dǎo)致凋亡信號放大，細(xì)胞線粒體功能喪失和細(xì)胞死亡。

caspase家族是一大類凋亡調(diào)節(jié)基因，已發(fā)現(xiàn)14種caspase蛋白，其中ccaspase－3是caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶。在正常情況下，caspase－3以無活性的酶原形式存在于哺乳動物的多種組織和細(xì)胞內(nèi)，其在免疫細(xì)胞、腦和胚胎起源的細(xì)胞中有高水平表達(dá)。凋亡是蛋白酶級聯(lián)切割的過程，不同的蛋白酶在凋亡的不同階段發(fā)揮功能。根據(jù)caspase在級聯(lián)反應(yīng)中的作用位置，分為始動caspase及效應(yīng)caspase，其中caspase－3為效應(yīng)caspase，且處于核心位置，發(fā)揮非常重要的作用。不同的蛋白酶切割caspase－3酶原，激活caspase－3，活化的caspase－3進(jìn)一步又切割不同的底物，導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)切割放大，最終使細(xì)胞走向凋亡。因此caspase－3被稱為死亡蛋白酶。

可見細(xì)胞色素 C釋放后激活 Casepase－9，而且 casepase－9處在casepase級聯(lián)的頂端〔21〕，啟動casepase的級聯(lián)反應(yīng)，活化Caspase在細(xì)胞中能夠切割400多種底物，如Lamins、信號分子如蛋白激酶、骨架蛋白、DNA修復(fù)酶以及包括調(diào)控mRNA剪切、DNA復(fù)制的功能蛋白。這些重要蛋白質(zhì)的降解和核酸酶的激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔22〕。因此CytC起始的casepase－9線粒體途徑在凋亡過程中起了關(guān)鍵性作用。

4 總結(jié)

雖然IPC的病理生理學(xué)過程及其生化機制目前尚不十分清楚，但是IPC的效應(yīng)提示腦組織具有自身保護(hù)機制。線粒體在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要作用正在不斷被認(rèn)識，最近研究提示膜受體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的信號最終都匯聚在線粒體通路中，轉(zhuǎn)移到線粒體膜將凋亡信號傳遞至線粒體，促進(jìn)CytC釋放，引起凋亡，而細(xì)胞色素C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟〔23〕。故可以設(shè)想MPT及CytC在細(xì)胞凋亡過程中起了“上游始動或開關(guān)”的作用。通過研究腦缺血預(yù)處理后線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔及細(xì)胞色素C變化，有望發(fā)現(xiàn)腦缺血預(yù)處理抑制凋亡的作用位點及作用機制，可以指導(dǎo)找到可外在干預(yù)的靶點，為臨床防治缺血性腦血管病提供新的有效途徑，延長缺血性卒中的治療時間窗，減輕其臨床后遺癥，為研發(fā)防治缺血性腦血管病藥物提供理論基礎(chǔ)。

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