人肝微粒體中CYP3A4對氯胺酮代謝的催化作用

趙蕓慧，田阿勇，馬 虹，王俊科

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧沈陽 110001)

氯胺酮(ketamine)是臨床常用靜脈麻醉藥，特別是廣泛用于小兒短小手術(shù)的麻醉和術(shù)前基礎(chǔ)麻醉。已知氯胺酮進(jìn)入體內(nèi)之后，大部分經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450代謝，形成去甲氯胺酮。有必要進(jìn)一步研究氯胺酮的代謝機(jī)制和影響其代謝的遺傳機(jī)制。

1 材料與方法

1.1一般資料本研究進(jìn)行人體組織實驗已獲得中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。20例人體肝臟組織來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科肝臟部分切除手術(shù)，患者(8男，12女)的平均年齡為(49±12)歲，并已排除急慢性肝炎、肝硬化和長期吸煙酗酒史病例。取直徑為1～2 cm的正常肝臟組織(經(jīng)病理形態(tài)學(xué)證實)，10 min內(nèi)液氮冰凍，－70℃冰箱保存?zhèn)溆?。肝臟微粒體通過差速離心法制備，所有試劑及器械均需冰盒內(nèi)預(yù)冷。

1.2孵育條件孵育混合液包括400mg·L－1微粒體稀釋液，100 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液(pH 7.4)和在聚乙烯試管中孵育過的0.5 ml底物，37℃水浴搖床先預(yù)孵育3min，反應(yīng)從加入1 mmol·L－1NADPH 輔酶再生系統(tǒng)(0.5 mmol·L－1NADP+，5 mmol·L－1G6P，2 000 U·L－1G6PDH，6 mmol·L－1MgCl2)開始，分別孵育 0、5、10、20、40、60 min。各管中加入1 ml 0.1 mol·L－1的冷NaOH放入－20℃冰箱中止反應(yīng)。每個樣本重復(fù)實驗3次

1.3樣品處理加入10 μl內(nèi)標(biāo)布比卡因混勻，加入750 μl乙腈沉淀蛋白，振蕩混勻，10 800×g離心10 min，取上清50 μl進(jìn)樣。采用高效液相色譜法(HPLC)測定各時點氯胺酮的濃度。與CYP3A4的特異底物硝苯地平(nifedipine)和抑制劑孕二烯酮(gestodene)作相關(guān)分析。熒光檢測波長為211 nm，流速 1 ml·min－1，流動相 ∶乙腈 ∶0.025 mol·L－1KH2PO4∶三乙胺(40 ∶60 ∶0.02)。

1.4氯胺酮及硝苯地平代謝速率的測定肝臟微粒體中氯胺酮的代謝速率可通過下面公式計算，其中C為氯胺酮在孵育液中的初始濃度為氯胺酮在孵育液中的消除半衰期:消除速度r=C×0.693/氯胺酮消除半衰期是從各時間點氯胺酮剩余濃度的均值對時間作半對數(shù)圖形進(jìn)行線性相關(guān)分析計算而得。

1.5抑制性研究應(yīng)用CYP3A4特異性抑制劑孕二烯酮對微粒體中氯胺酮的代謝進(jìn)行抑制性研究。這些抑制劑溶解在甲醇溶液當(dāng)中，在孵育反應(yīng)開始前，10 μmol·L－1孕二烯酮 20 μl分別與 400 mg·L－1肝微粒體和0.05 mmol·L－1氯胺酮在磷酸緩沖液當(dāng)中預(yù)孵育3 min，反應(yīng)從加入NADPH(1 mmol·L－1)工作液開始持續(xù)60 min，其余步驟同前述。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示。氯胺酮的代謝速率與加入特異性底物硝苯地平的代謝速率行相關(guān)性分析，氯胺酮代謝速率與加入特異性抑制劑孕二烯酮后的代謝速率比較采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

20例人肝臟微粒體中氯胺酮的代謝速率相差最大約1倍，平均為(12.6±3.8)μmol·min－1·g－1protein。該速率與CYP3A4活性探針硝苯地平代謝速率呈正相關(guān)(r=0.917，P＜0.01)。加入特異性抑制劑組，氯胺酮的平均代謝速率都明顯低于正常孵育組(P＜0.01)，為(4.7±1.6)μmol·min－1·g－1protein，抑制率為62.7%。

3 討論

實驗結(jié)果表明，氯胺酮在微粒體孵育液的代謝速率和CYP3A4的活性探針硝苯地平的代謝速率呈明顯正相關(guān);CYP3A4酶活性特異性抑制劑孕二烯酮對氯胺酮在微粒體孵育液的代謝速率有明顯的抑制作用;CYP3A4對氯胺酮的代謝具有催化作用;適用于藥物體外代謝速率的研究。

在人類 P450家庭中，主要有 3族(CYP1、CYP2、CPY3)19種同工酶參與外來化學(xué)物的代謝［1］。CYP 1，2，3 家族約占肝 P450 總含量的70%，并負(fù)責(zé)大多數(shù)藥物的代謝。已知CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9三種酶在肝微粒體中均具有較高活性［2－3］，遺傳多態(tài)性、酶抑制、酶誘導(dǎo)及生理因素均可引起細(xì)胞色素P450活性的改變，有一定的臨床意義。因為這會引起藥物藥代動力學(xué)的改變，導(dǎo)致藥物效應(yīng)改變，因代謝減少或毒性代謝物生成增多而增加藥物毒性，以及導(dǎo)致藥物的相互作用。Hijazi等［4］認(rèn)為人肝臟微粒體中氯胺酮的代謝主要是由CYP2B6催化。而 Hijazi等［5］的研究指出 P450 CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9三種酶同時代謝氯胺酮，CYP3A4占主導(dǎo)地位，CYP2B6僅占很小一部分。Mssner等［6］發(fā)現(xiàn) CYP3A4、CYP 2B6、CYP 2C9 的抑制劑都降低了氯胺酮的代謝，CYP3A4的抑制劑對氯胺酮的代謝抑制作用最強(qiáng)。究竟有幾種P450酶參與氯胺酮的代謝和哪一種酶起到?jīng)Q定性作用目前還沒有定論，有待于進(jìn)一步的研究。本研究的結(jié)果提示CYP3A4參與了氯胺酮的代謝，CYP3A4特異性抑制劑孕二烯酮抑制了氯胺酮的代謝，和國外相關(guān)文獻(xiàn)報道的結(jié)果是一致的［4－6］。

CYP3A4是人體含量最豐富的P450酶，大約占人肝P450總含量的30% ，參與市場上50% 以上的藥物代謝［7］。在CYP3A亞家族中，對CYP3A4的研究較多。CYP 3A4參與一系列臨床治療藥的代謝，包括抗心律失常藥、鈣通道阻滯劑、三環(huán)類抗抑郁藥(tricyclic antidepressants)及5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotomin reuptake inhibitors)、環(huán)孢霉素、氯氮平、苯二氮卓類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、糖皮質(zhì)激素及孕(雌)激素、吡喹酮、卡馬西平、醋氨酚等及某些致癌物等［8］。上述許多藥物的療效及不良反應(yīng)與體內(nèi)藥物濃度密切相關(guān)，而CYP3A4的活性亦存在個體差異，了解患者體內(nèi)CYP3A4活性，對合理應(yīng)用這些藥物會有一定的幫助。

CYP3A4基因位于人類第7號染色體q21.1，基因全長分別為27.2 kb，有13個外顯子，編碼502個氨基酸，CYP3A4的活性與CYP3A mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)，表明影響CYP3A4表達(dá)主要是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，CYP3A5活性的差異主要是由單核苷酸的多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)造成的［9］。CYP3A4 SNPs研究表明個體間 CYP3A4活性的差異85%是由遺傳因素決定，探尋CYP3A4基因變異也成為詮釋酶活性差異的另外一個研究熱點［10］。

隨著CYP3A4分子藥理學(xué)的深入研究，將從基因水平闡述CYP3A4的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其個體差異性的產(chǎn)生機(jī)制［11－12］。

［1］賀全仁.人類細(xì)胞色素P450同工酶與藥物代謝［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)雜志，1997，2(4):307－10.

［1］He Q R.Human Cytochromes P450 isozyme and drug metabolism［J］.Chin J Clin Pharmacol Therap，1997，2(4):307 －10.

［2］Ekins S，Wrighton S A.The role of CYP2B6 in human xenobiotic metabolism［J］.Drug Metab Rev，1999，31:719 －54.

［3］周宏灝.藥理學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:87.

［3］Zhou H H.Pharmacogenetics［M］. Beijing:Science Press，2001:87.

［4］Yanagihara Y，Kariya S， Ohtani M， et al. Involvement of CYP2B6 in N-demethylation of ketamine in human liver microsomes［J］.Drug Metab Dispos，2001，29:887 －90.

［5］Hijazi Y，Boulieu R.Contribution of CYP3A4，CYP2B6，and CYP2C9 isoforms to N-demethylation of ketamine in human liver microsomes［J］.Drug Metab Dispos，2002，30(7):853 －8.

［6］Mssner LD，Schmitz A，Theurillat R，et al.Inhibition of cytochrome P450 enzymes involved in ketamine metabolism by use of liver microsomes and specific cytochrome P450 enzymes from horses，dogs，and humans［J］.Am J Vet Res，2011，72(11):1505 －13.

［7］谷 元 ，司端運(yùn) ，劉昌孝.CYP3A4酶介導(dǎo)的人類藥物代謝性別差異［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(9):1121－4.

［7］Gu Y，Si D Y，Liu C X.Human gender difference of drug metabolism mediated by CYP3A4 enzyme［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(9):1121 －4.

［8］彭 華，程澤能.細(xì)胞色素P4503A4相關(guān)的藥物相互作用［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2001，17(5):379 －85.

［8］Peng H，Cheng Z N.Drug interactions related to Cytochrome P450［J］.Chin J Clin Pharmacol，2001，17(5):379 －85.

［9］Kuehl P，Zhang J，Lin Y，et al.Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the genetic basis of polymorphic CYP3A5 expression［J］.Nat Genet，2001，27(4):383 －91.

［10］Lamba J K，Lin Y S，Schuetz E G，et al.Genetic contribution to variable human CYP3A-mediated metabolism［J］.Adv Drug Deliv Rev，2002，54(10):1271 －94.

［11］Chen J T，Chen R M.Mechanisms of ketamine-involved regulation of cytochrome P450 gene expression［J］.Expert Opin Drug MetabToxicol，2010，6(3):273 －81.

［12］胡永芳，翟所迪，邱 雯.CYP3A5*3和CYP3A4*18B基因多態(tài)性對腎移植患者環(huán)孢素藥代動力學(xué)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(3):378－82.

［12］Hu Y F，Zhai S D，Qiu W.Effect of CYP3A5*3 and CYP3A4*18B genetic polymorphisms on cyclosporine pharmacokinetics in renal transplant patients［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(3):378－82.