黏菌素HPLC分析方法的研究進展

陳 曦 王觀悅 徐宗香 安麗娜 李 陽

（黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，齊齊哈爾 161006）

黏菌素HPLC分析方法的研究進展

陳 曦 王觀悅 徐宗香 安麗娜 李 陽

（黑龍江省獸醫(yī)科學研究所，齊齊哈爾 161006）

黏菌素是一類對革蘭氏陰性致病菌具有很強體外抗性的多肽抗生素，能治療由多重耐藥性病菌引起的多種疾病。黏菌素的分析方法主要有微生物學方法、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、毛細管電泳法（CE）及薄層層析法（TLC）等。本文主要綜述黏菌素的高效液相色譜（HPLC）分析方法的研究進展。

多黏菌素 分析方法 高效液相色譜法

黏菌素（colistin）是1947年從多黏菌素B.polymyxa 或產(chǎn)氣孢子桿菌B.aerobaillus 的培養(yǎng)濾液中得到的一種堿性多肽類抗生素。黏菌素又稱為多黏菌素E，黏桿菌素，克利斯汀和抗敵素，它是一種至少含有30多種不同成分的混合物，主要為黏菌素A和黏菌素B[1]。黏菌素是一種抗菌作用較強、毒性較低的多肽類抗生素，它對革蘭陰性菌具有強大抗菌作用，并能中和革蘭陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素，且具有殘留低，不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，因此，黏菌素是最有發(fā)展前途的抗菌素之一。

黏菌素是由七環(huán)和末端的三肽組成的十肽菌素，尾部的脂肪酸通過酰胺鍵連接到末端的三肽，七環(huán)有親水端和疏水端，三肽只有親水端。帶有正電荷的氨基酸和尾部的脂肪酸使黏菌素具有兼容性，可溶于水，也可溶于脂類[2]。黏菌素為白色結晶或結晶性粉末，干燥狀態(tài)下可長期保持穩(wěn)定。臨床上主要是用其硫酸鹽，硫酸黏菌素為白色或微黃色粉末，微臭或幾乎無臭，味苦，有吸濕性，易容于水和含水甲醇。英國藥典解釋為不溶于乙醚、丙酮和氯仿，美國藥典解釋為微溶于甲醇，不溶于乙醚和氯仿。硫酸黏菌素的水溶液呈左旋性，性能穩(wěn)定，可在 100 ℃下保存9 d，在 40℃下保存 60 d，活力不變。在 pH 值為3～7.5 較穩(wěn)定，在強酸性及堿性溶液中易分解，與茚三酮及雙縮脲呈陽性反應。耐熱，消化道不易吸收，排泄迅速，毒性小，無副作用，不易產(chǎn)生耐藥菌株[3]。硫酸黏菌素結構中不存在發(fā)色團，需衍生化后能用LC法測定。

目前國內(nèi)對硫酸黏菌素的研究主要集中在應用以及動物性食品中殘留檢測方法上，對其毒性及藥物代謝方面也有一些初步研究。黏菌素分析方法主要有微生物學方法、高效液相色譜法（HPLC）、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、毛細管電泳法（CE）及薄層層析法（TLC）等。Leroy等[4]（1989）運用微生物學方法和HPLC法檢測了小牛體內(nèi)黏菌素的含量，結果顯示微生物學方法缺乏敏感性，選擇性和檢測時間偏長（21h），而HPLC法非常靈敏，能夠分離黏菌素各組分。由于免疫原準備工作很復雜，所以很少有研究是應用酶聯(lián)免疫分析法進行黏菌素的殘留檢測。

微生物學方法和酶聯(lián)免疫分析法均不能分離黏菌素各組分，而薄層層析法（TLC）、毛細管電泳（CE）和高效液相色譜法（HPLC）能分離黏菌素（堿和硫酸鹽）A和B，但是不能與甲烷磺酸黏菌素區(qū)別開來，所以關于黏菌素的體內(nèi)分析方法國內(nèi)還存在著一些缺陷。

高效液相色譜法自上世紀70年代初應用于分析黏菌素以來，主要用于對黏菌素所含各組分的分離。Shigeru Terabe等[5]（1979）、T.J.Whall[6]（1980）、Cindy Govaerts[7]（2002）等相繼對此進行了報道，分離出的成分多達十三種。也有資料報道用HPLC法測定硫酸粘桿菌素的含量，其檢測限較高，最低為0.5μg/ml。

黏菌素主成分結構中具有多個伯胺基團，能與C18填料中殘留的硅醇基發(fā)生強烈相互作用，導致峰拖尾或峰形異常，所以流動相一般呈酸性，需含有高濃度的鹽或隱蔽劑以抑制硅醇基的吸附活性。Ikai[8]的研究結果表明：大孔徑填料和不含硅醇基的苯基填料對分離效果較好，峰形尖銳。大孔徑填料可能有利于高分子量黏菌素的自由擴散，傳質阻力較小。

解慶繽等[9]（1988）側洗脫液為乙晴，磷酸/甲酸鹽和乙酸鹽緩沖液，C18柱以23%的乙晴磷酸鹽緩沖液為流動相，紫外檢側，在1.0～100.0μg范圍內(nèi)濃度呈良好的線性關系。檢測限為5×10-7g，A、B的回收率分別為98.O%和97.1%。

Decolin等[10]（1997）測定牛組織（肌肉、肝臟、脂肪）及牛奶中粘桿菌素的殘留，10%（w/v）三氯乙酸為蛋白沉淀劑，在C18柱上固相純化，柱前洗脫液為乙晴：磷酸鹽緩沖液（pH7.0）65：35（V/V），分析柱洗脫液為68：32（V/V），熒光檢測，激發(fā)波長及發(fā)射波長分別為340nm和440nm。黏菌素A、B保留時間分別為14min、18min。黏菌素結構用HPLC法聯(lián)合質譜進行分析。結果表明：在10～500mg/L（牛奶）、50～1000mg/kg（肌肉、脂肪）、100～1000mg/kg（腎臟、肝臟）范圍內(nèi)的標準曲線相關系數(shù)大于0.990。在25 mg/L（牛奶）、100 mg/kg（組織）標準濃度相對偏差值低于10%（6個重復），回收率高于60%。

選擇適當檢測波長對成功建立測定方法相當關鍵，HPLC/UVD（200～254nm）由于組織中干擾黏菌素檢測的物質較多，其靈敏度和選擇性較難滿足黏菌素殘留分析要求，HPLC法分析中的進行衍生化反應可以提高檢測分析的靈敏度和選擇性。在室溫堿性條件下（pHl0.0）和2-疏基乙醇存在下，黏菌素結構中伯胺基團迅速與鄰二苯甲醉（OPA）發(fā)生縮合反應，生成具有強烈熒光，較穩(wěn)定的l-S-烷基-2-N-烷基異吲哚衍生物。

黏菌素呈弱堿性，易溶于水，在酸性溶液中較穩(wěn)定.Ikai[8]（1995）報道黏菌素的C18凈化方法，平衡：甲醇，水；洗滌：水，15%乙晴（含0.1%TFA）；洗脫：乙晴—0.017mol/LTFA（20+80），上述C18洗滌液對除去雜質很有效，回收率為64%，檢測限為0.2μg/g，該方法較低的回收率可能與待測物吸附和提取過程中基質的共沉淀有關。

Decolin等[10]（1997）建立的黏菌素衍生化LC/FLD方法中，組織樣品（牛肌肉，肝，腎，脂肪）的提取溶劑為甲醇-10%TCA（50+50），提取乳汁則僅使用10%TCA，提取液經(jīng)甲醇—0.01mol/LHCL（55+45）洗脫，OPA試劑衍生化，在線Cl8柱凈化后測定，回收率62%～78%，檢測限為0.002（乳）～0.02（組織）μg/g.黏菌素與組織結合較強，提取液中加入TCA可沉淀蛋白質和解離藥物，固體樣本需同時加入甲醇以改善提取效率。Li等[11]（2001）運用一種簡便、快速、靈敏的HPLC方法檢測血漿中的黏菌素（堿或硫酸鹽），即先運用熒光性的芴甲氧羰酰氯（FMOCCl）進行柱后衍生化，再采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）分離分析血漿中的黏菌素。通過此種方法，在檢測黏菌素的過程中就能排除通過此種方法，在檢測黏菌素的過程中就能排除甲烷磺酸衍生物的干擾，并且與運用鄰苯二甲醛（OPA）進行衍生化不同的是這些添加了FMOC的衍生物在室溫下可保持3d，而且此法能分離黏菌素A和黏菌素B。

高效液相色譜法具有很高的特異性、靈敏度以及較快的檢測速度，但由于硫酸粘桿菌素組成的多樣性及成分的不確定性，使得應用高效液相色譜法對其進行殘留分析還有待進一步的研究。

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