連接臂對適體與凝血酶相互作用影響的電化學阻抗研究

彭亞鴿

(寧夏大學 化學化工學院，寧夏 銀川 750021)

適體是利用SELEX體外篩選技術從核酸分子文庫中獲得的單鏈DNA或RNA。適體能與氨基酸、蛋白、藥物、有機小分子、無機離子等靶物質特異性、高選擇性結合［1，2］。適體作為分子識別物質，比大分子的抗體相比較，不僅具有分子量小，結構簡單，能保證合成的精確性及易連接其它分子進行修飾等優(yōu)點，而且還可以變性、復性且速度快，可反復使用、長期保存［3，4］。基于適體的這些優(yōu)點，將適體作為生物傳感器的識別元件，制成的適體生物傳感器，具有不可替代的優(yōu)勢。適體生物傳感器在蛋白質與DNA的相互作用、藥物檢測、醫(yī)學診斷和治療、分子開關等方面得到廣泛應用［5－7］。非標記型電化學適體傳感器以其簡單、靈敏而倍受研究者的青睞。電化學交流阻抗技術是一種對電極界面性質變化十分敏感而便捷的檢測技術，能夠提供有關電極界面電子傳遞電阻，雙電層電容等多種界面參數的大量信息。因此，電化學交流阻抗技術己被廣泛應用于研究電化學反應過程及電極界面性質變化［8，9］。

凝血酶(Thrombin)是由39個氨基酸殘基的輕鏈和259個氨基酸殘基的重鏈組成的絲氨酸蛋白水解酶［10］。凝血酶的濃度及活性是衡量凝血機制的重要指標，對揭示腫瘤的發(fā)生機制，腫瘤細胞的早期診斷、療效及預后判斷等具有重大意義［11］。利用凝血酶適體設計檢測凝血酶的電化學適體傳感器近年來得到了研究者的關注［12－14］。但是連接臂的不同對適體與凝血酶之間的結合能力有比較大的影響。因此，本研究擬以三條連接臂長度不同的凝血酶適體作為識別分子，將其自組裝于金電極上，以凝血酶為研究對象，結合巰基自組裝技術，利用電化學交流阻抗技術，研究了連接臂對適體與凝血酶相互作用的影響，以期獲得理想的凝血酶適體。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

電化學測量系統(tǒng)為CHI 660電化學工作站(上海辰華儀器公司)。實驗采用三電極系統(tǒng)，組裝適體傳感器或金電極(φ=2 mm)作為工作電極，鉑絲作為對極，Ag/AgCl(飽和KCl)作為參比電極。電化學阻抗法(Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS)使用CHI660電化學工作站。所有電位均以該參比電極電位為標準。

巰基己醇(MCH，97%)、Tween－20均購自美國Sigma公司。凝血酶(Human－thrombin Mw=36700 g/mol，pI=7.0～7.6)購自上海 Haematologic公司。鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀購自于上?；瘜W試劑廠。所有試劑均為分析純。所有儲備液和緩沖溶液均使用二次去離子超純水(France)配制。0.10 mol/LPBS磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)、固定結合緩沖液(Immobilization－Binding Buffer，I－B 緩沖溶液)為0.10 mol/L磷酸緩沖溶液(PB，pH=7.00包含10 mmol/L KCl和2 mmol/L MgCl2)、檢測溶液為0.10 mol/L PBS(pH=7.40，包含 10 mmol/L NaCl，10 mmol/LK3［Fe(CN)6］－ 10 mmol/LK4［Fe(CN)6］)。凝血酶適體(Thrimbin－Binding Aptamer)購自上海生物工程公司。

表1 凝血酶適體序列

1.2 電化學適體傳感器的制備

金電極的預處理:先將金電極浸泡在Piranha溶液中(30%H2O2∶濃 H2SO4=1∶3 v/v)5 min，取出后用二次水沖洗干凈;隨后用0.03·μmAl2O3溶膠研磨，然后依次分別用乙醇、二次水超聲清洗;再將金電極在0.1 mol/L H2SO4溶液中在電位范圍－0.2～1.5 V循環(huán)伏安掃描直到得到標準金的還原峰，用二次水沖洗。微量移液器將20 μL預處理后(90℃水浴加熱180 s，然后冰浴中迅速冷卻，以獲得適體的折疊結構)的適體溶液仔細滴涂在處理過的金電極表面(為了避免溶液蒸發(fā)使用合適的塑料帽覆蓋電極表面)，室溫下靜置適當的時間，電極表面用水沖洗;然后用2.0 μL 1.0×10－3mol/L巰基己醇(MCH)封閉30 min，以封閉電極表面沒有被適體占據的空白位點，防止電極表面的非特異性吸附。封閉結束用沖洗緩沖溶液沖洗，得到本工作中的凝血酶適體傳感器。

1.3 電化學測量方法

將適體傳感器浸入100 μL一定濃度的凝血酶溶液中，室溫下放置適當時間后，傳感器用大量水沖洗以移走吸附的凝血酶，然后傳感器置于含有2.0 mL0.10 mol/LPBS －10 mmol/LK4［Fe(CN)6］－ 10 mmol/LK3［Fe(CN)6］ － 10 mmol/L NaCl(pH=7.40)溶液的電化學池中進行電化學阻抗(EIS)測定。EIS 測定的偏電位0.226 V，通過［Fe(CN)6］3－/4－平衡電對的式電位來決定，頻率范圍100 kHz～1.0 Hz，每10倍頻采12個點，振幅為5.0 mV。以電子傳遞電阻△Ret為分析信號，對凝血酶進行定量測定。如果沒有特殊說明，電化學實驗均在室溫下進行(25±1℃)。

2 結果與討論

2.1 電化學適體傳感器的表征

采用電化學阻抗法對適體傳感器進行表征。圖1 為裸金電極(曲線 1)，固定 5＇－C6－T5－A1 鏈的金電極(曲線2)，組裝的適體傳感器(曲線3)，適體傳感器與凝血酶相互作用50 min后獲得的法拉第阻抗圖譜(曲線4)。從圖1可以看出，裸金電極幾乎為一直線，［Fe(CN)6］3－/4－向電極的表面的擴散不存在阻礙。當 5＇－C6－T5－A1 鏈固定在金電極表面上后，阻抗圖譜上高頻區(qū)半圓直徑大大增加，電子傳遞電阻 Ret增大，這是由于 5＇－C6－T5－A1 鏈磷酸骨架上帶的負電荷排斥帶負電荷的［Fe(CN)6］3－/4－平衡電對，阻礙平衡電對向電極表面?zhèn)鬟f，使電極表面電子傳遞電阻 Ret增大，說明 5＇－C6－T5－A1 鏈已經成功的固定在金電極表面。組裝好的傳感器用巰基已醇(MCH)封閉后，電極在高頻區(qū)半圓繼續(xù)增大，原因是MCH為短鏈的巰基分子，它可以有效地占據沒有被適體占據的電極表面的空白位點，減少電極表面非特異性吸附。同時也說明［Fe(CN)6］3－/4－在電極上的電子傳遞更困難。當適體傳感器結合凝血酶分子50 min后，阻抗圖譜上表現(xiàn)為高頻區(qū)半圓繼續(xù)增大，表明適體傳感器與凝血酶結合，使得［Fe(CN)6］3－/4－平衡電對在電極上的電子轉移速率常數越小，傳感器上電子傳遞電阻Ret顯著增大。因此，可以使用交流阻抗法對凝血酶進行測定。

2.2 適體傳感器測量條件優(yōu)化

2.2.1 自組裝時間優(yōu)化

圖1 適體傳感器在［Fe(CN)6］3－/4－溶液中的交流阻抗圖

考察了不同適體鏈固定時間對電子傳遞電阻Ret的影響。以 5＇－C6－T5－A1 鏈為例，結果表明，電子傳遞電阻 Ret隨 5＇－C6－T5－A1 鏈固定時間增長而明顯增加，當固定時間為5.0 h時，Ret達到穩(wěn)定值。這表明在金電極表面的 5＇－C6－T5－A1 的固定量，隨著固定時間的增加慢慢達到飽和。固定時間為6.0～8.0時，Ret幾乎與5.0 h時的Ret值相等。因此，本實驗選擇凝血酶適體的固定時間為6.0 h。

2.2.2 適體傳感器與凝血酶相互作用時間優(yōu)化

考察了凝血酶與適體傳感器相互作用時間對傳感器響應信號△Ret的影響。實驗結果顯示，相互作用時間在5～40 min之間增加時，△Ret顯著增加，40 min時△Ret達到穩(wěn)定值，40～60 min之間，△Ret變化不大，說明40 min相互作用時間足夠凝血酶與適體的結合，為了保證適體與凝血酶的完全結合，在隨后實驗中選擇適體傳感器與凝血酶相互作用時間為50 min。

2.3 三條適體鏈結合反應的線性范圍和檢出限

在優(yōu)化實驗條件下，將三條不同長度連接臂修飾的凝血酶適體組裝的電化學適體傳感器對凝血酶進行測定。圖 2 為 5＇－C6－T0－A1 組裝適體傳感器對不同濃度(0.1～8.0 nmol/L)凝血酶測定的交流阻抗圖。內插圖為△Ret隨凝血酶濃度變化圖。從內插圖可以看出△Ret與凝血酶的濃度在0.1～0.8 nmol/L之間呈良好的線性關系，線性回歸方程為△Ret=1363.1 c－78.51(c/nmol/L)，R2=0.9845。檢出限0.05 nmol/L。

圖2 5＇－C6－T0－A1電化學適體傳感器的復平面阻抗圖及其線性關

圖 3 為 5＇－C6－T5－A1 組裝適體傳感器對不同濃度(0.1～8 nmol/L)凝血酶測定的交流阻抗圖。內插圖為△Ret隨凝血酶濃度變化圖。從內插圖可以看出△Ret與凝血酶的濃度在0.1－1.0 nmol/L之間呈良好的線性關系，線性回歸方程為ΔRet=67.12+1719.4 c(c/nmol/L)，R2=0.9923。檢出限為0.07 nmol/L。

圖 3 5＇－C6－T5－A1 電化學適體傳感器的復平面阻抗圖及其線性關系

圖 4 為 5＇－C6－T10－A1組裝適體傳感器對不同濃度(0.1～8 nmol/L)凝血酶測定的交流阻抗圖。內插圖為△Ret隨凝血酶濃度變化圖。從內插圖可以看出△Ret與凝血酶的濃度在0.1～0.8 nmol/L之間呈良好的線性關系，線性回歸方程為△Ret=395.29+1618.8 c(c/nmol/L)，R2=0.9982。檢出限為0.05 nmol/L。

比較3種傳感器的線性回歸方程的斜率，其靈敏度為 5＇－C6－T5－A1 ＞ 5＇－C6－T10－A1 ＞ 5＇－C6－T0－A1 ＞5＇－C6－T20－A1。3 種傳感器的靈敏度區(qū)別可能是由于不同的適體與凝血酶結合能力有差異引起的。

圖 4 5＇－C6－T10－A1 電化學適體傳感器的復平面阻抗圖及其線性關系

圖 5 Ret/Ret，0 與(A)5＇－C6－T0－A1，(B)5＇－C6－T5－A1and(C)5＇－C6－T10－A1 的線性關系

2.4 適體與凝血酶結合常數的測定

根據 Szymánska等［16］報道利用電化學交流阻抗法檢測免疫反應的平衡常數。利用交流阻抗法測定了3種凝血酶適體與凝血酶的結合常數。以△Ret/Ret，0對凝血酶濃度c作圖，得到一條直線，根據直線斜率，可以計算出適體與凝血酶的結合常數Ka。由圖5可知，3條鏈的結合常數Ka分別為0.32 nM－1，0.84 nM－1，0.67 nM－1，5＇－C6－T5－A1 ＞ 5＇－C6－T10－A1 ＞5＇－C6－T0－A1。文獻里曾有報道隨著連接臂的增加自組裝單層的適體傳感器表面密度逐漸降低［15］。分析其原因，從 5＇－C6－T0－A1 到 5＇－C6－T5－A1結合常數增加，是由于凝血酶有更多機會與適體結合。而隨著胸腺嘧啶連接臂長度的增加，結合能力整體有所下降，是因為適體的表面密度逐漸降低和連接臂的空間位阻加大所致。最終由于適體鏈變長，導致凝血酶距離電極越遠，使得電子傳遞效率更加困難。

3 結論

設計了連接臂長度逐漸增加的適體鏈5＇－C6－T0－A1、5＇－C6－T5－A1 和 5＇－C6－T10－A1，將其自組裝于金電極上構成電化學適體傳感器，利用交流阻抗技術，分別以這3種適體為識別分子測定凝血酶的線性范圍和檢出限，比較了三者靈敏度的差異。利用濃度平衡法計算了適體與凝血酶形成的結合常數。并通過動力學方法進行了驗證。實驗結果表明，5＇－C6－T5－A1組裝的傳感器靈敏度最好，與凝血酶的結合常數最大。本研究對適體－目標蛋白質之間結合過程的機理有一個更深的理解，將有助于我們進一步揭示核酸與蛋白這兩種生命中最關鍵物質之間的相互作用和關系，對于我們更好地理解基本的生物過程和預測設計適體生物檢測方法，發(fā)展用于疾病診斷的方法有著重要的意義。

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