蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用

戴旭東 孟 清 劉相欽

①博士研究生，②教授，東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620；③教授，Department of Biochemistry ＆Molecular Biology，F(xiàn)aculty of Medicine，Dalhousie University，Halifax，Nova Scotia，Canada B3H1X5

蛋白質(zhì)剪接（protein splicing）是由蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的在蛋白質(zhì)水平上翻譯后的加工過程。蛋白質(zhì)內(nèi)含子（intein）是指前體蛋白中的一段插入序列，它在蛋白質(zhì)翻譯后的成熟過程中能自我催化，使自身從前體蛋白中切除，并將其兩側(cè)的多肽片段以肽鍵連接，形成成熟的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)豐富了基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯成熟過程的理論，而且在蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程中有廣泛的應(yīng)用。本文試圖綜述蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)特異位點標(biāo)記、蛋白質(zhì)片段化標(biāo)記同位素、蛋白質(zhì)環(huán)化、蛋白質(zhì)芯片、基因治療等研究中的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)內(nèi)含子（intein）是指前體蛋白中的一段插入序列，它在蛋白質(zhì)翻譯后的成熟過程中能自我催化，使自身從前體蛋白中切除，并將其兩側(cè)稱為蛋白質(zhì)外顯子（extein）的多肽片段以正常的肽鍵連接形成有功能的成熟蛋白質(zhì)［1－2］。截至到2011年8月，已經(jīng)有500多種蛋白質(zhì)內(nèi)含子（intein）被發(fā)現(xiàn)（inbase，http：／／www.neb.com／neb／inteins.html）［3］。它們分布在單細(xì)胞真核生物、細(xì)菌、古細(xì)菌、噬菌體和病毒的基因組中，但是在多細(xì)胞生物中尚未發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子，而且它們主要分布在與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯有關(guān)的蛋白酶或轉(zhuǎn)移因子上，這可能有利于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的歸巢（homing）和生存［4］。由于蛋白質(zhì)剪接能把兩個多肽以一個天然肽鍵相連（splicing），形成成熟的有活性的蛋白質(zhì)，為蛋白質(zhì)合成和翻譯后修飾提供了新的途徑，因而蛋白質(zhì)剪接已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程中。例如，這項技術(shù)可以應(yīng)用到蛋白質(zhì)特異位點標(biāo)記、蛋白質(zhì)片段化標(biāo)記同位素、蛋白質(zhì)環(huán)化、基因治療、蛋白質(zhì)芯片等研究中［5－7］。

1 蛋白質(zhì)內(nèi)含子的生物學(xué)特性

1.1 蛋白質(zhì)內(nèi)含子

1990年，分別由Kane和Hirata領(lǐng)導(dǎo)的研究小組同時在酵母中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)剪接（protein splicing）［8－9］。1994年，Perler將“插入片段”正式命名為“intein”，即蛋白質(zhì)內(nèi)含子。并將其定義為：在蛋白質(zhì)成熟過程中被剪接掉的一段框內(nèi)融合于前體蛋白的氨基酸序列，蛋白質(zhì)內(nèi)含子兩端的序列稱為“extein”，即外顯子［10］（圖1）。

蛋白質(zhì)內(nèi)含子不同于RNA內(nèi)含子，前者存在于蛋白質(zhì)，后者則存在于mRNA前體。然而，蛋白質(zhì)內(nèi)含子與RNA內(nèi)含子（intron）也有相似之處。首先，它們都插入到基因中，通過自身剪接從前體中剪接下來，將兩邊的前體連接。另外，二者都包含核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，可以通過類似的歸巢機(jī)制在基因中轉(zhuǎn)移。

圖1 蛋白質(zhì)剪接示意圖［1］

1.2 蛋白質(zhì)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)

每一個蛋白質(zhì)內(nèi)含子都包含N端剪接結(jié)構(gòu)域和C端剪接結(jié)構(gòu)域。N端剪接結(jié)構(gòu)包含兩個序列模塊即A和B，C端剪接結(jié)構(gòu)包含兩個序列模塊即F和G。除此之外，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子在N端剪接結(jié)構(gòu)域和C端剪接結(jié)構(gòu)域之間還存在歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，由模塊C，D和E組成（圖2）。模塊A位于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端，其N端的第一個氨基酸殘基非常保守，一般是Cys或Ser；模塊G位于蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端，其C端的第一個氨基酸殘基非常保守，一般是Asn，第二個氨基酸殘基也非常保守，一般是His；模塊B中Thr－X－X－His序列的Thr和His非常保守，X是任何氨基酸殘基；另外，C端蛋白質(zhì)外顯子的第一個氨基酸殘基非常保守，一般是Cys，Ser或Thr。越來越多的證據(jù)，特別是突變分析和一些蛋白質(zhì)內(nèi)含子晶體結(jié)構(gòu)的解析表明這些保守的氨基酸殘基參與了蛋白質(zhì)的剪接，如果它們發(fā)生突變，將會影響蛋白質(zhì)剪接活性［11］。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖［1］。兩端分別是蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接結(jié)構(gòu)域，中間部分是歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。A，B，C，D，E，F(xiàn)，G是蛋白質(zhì)內(nèi)含子的保守模塊。

1.3 蛋白質(zhì)的順式剪接（cis－splicing）與反式剪接（trans－splicing）

蛋白質(zhì)內(nèi)含子根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征可分為三類：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子（canonical intein），微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子（miniintein）和斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子（split intein）（圖3）。標(biāo)準(zhǔn)蛋白內(nèi)含子含有大約400個氨基酸并包括一個歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，而微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子只有大約140個氨基酸不包含歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，只有蛋白剪切的功能。雖然很多蛋白內(nèi)含子在序列上沒有同源性，但是它們的晶體結(jié)構(gòu)非常接近。微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的晶體結(jié)構(gòu)包括12個β折疊，它們形成一個圓盤狀的蛋白質(zhì)，其剪切活性中心位于圓盤的中央［11－12］。對于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子和微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子來說，蛋白質(zhì)內(nèi)含子和蛋白質(zhì)外顯子位于同一多肽鏈上，這時發(fā)生的蛋白剪接稱為順式剪接（cis－splicing）。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子是蛋白質(zhì)內(nèi)含子中部區(qū)域特定位點發(fā)生斷裂，被分裂成兩部分即N端區(qū)域（IN）和C端區(qū)域（IC），分別由不同的開放閱讀框（ORF）編碼。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IN和IC在剪接時相互識別，然后重建催化活性中心，進(jìn)而發(fā)生蛋白質(zhì)反式剪接（protein trans－splicing）。

圖3 蛋白質(zhì)的順式剪接（cis－splicing）與反式剪接（trans－splicing）。IN：蛋白質(zhì)內(nèi)含子N端剪接結(jié)構(gòu)域，IC：蛋白質(zhì)內(nèi)含子C端剪接結(jié)構(gòu)域，EN：歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。

1.4 蛋白質(zhì)內(nèi)含子的剪接機(jī)制

蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白質(zhì)剪接是一個自我催化過程，只與蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接活性中心的保守氨基酸和C端外顯子的第一個氨基酸有關(guān)。內(nèi)含子可以不依賴其他任何因素催化蛋白質(zhì)就可以剪接。

蛋白質(zhì)順式剪接（cis－splicing）包括4步親核反應(yīng)（圖4）［13－14］。第一步，蛋白質(zhì)內(nèi)含子 N－端的第一個保守氨基酸Cys或Ser引起酰基化重排（acyl rearrangement），N－端蛋白質(zhì)外顯子與蛋白質(zhì)內(nèi)含子之間的肽鍵被打開，形成硫酯鍵或酯鍵。第二步，C－端蛋白質(zhì)外顯子的第一位氨基酸Cys，Ser或Thr的巰基或羥基攻擊第一步反應(yīng)形成的硫酯鍵或酯鍵，導(dǎo)致N－端蛋白質(zhì)外顯子以硫酯鍵或酯鍵連接到C－端蛋白質(zhì)外顯子的第一位氨基酸殘基的側(cè)鏈上。蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N－端剪接點被切斷，形成分支中間體（branched intermediate）。第三步，蛋白質(zhì)內(nèi)含子C－端的Asn或Gln側(cè)鏈上的酰胺基攻擊C－端剪接點的肽鍵，導(dǎo)致該剪接點斷裂。至此，蛋白質(zhì)內(nèi)含子與兩側(cè)的蛋白質(zhì)外顯子分開。第四步，通過自發(fā)的S－N或O－N之間的?；嘏牛瑑蓚€蛋白質(zhì)外顯子之間的硫酯鍵或酯鍵轉(zhuǎn)變成正常的肽鍵。這樣，就完成了標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)。

斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導(dǎo)的反式剪接（trans－splicing）起始于斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子IN和IC的相互識別和結(jié)合。IN和IC緊密結(jié)合后，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子正確折疊而重建活性中心，之后按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)剪接途徑完成蛋白質(zhì)外顯子的連接［15－17］。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接機(jī)制［18］

2 天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子和人工斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子

2.1 尋找天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子

蛋白質(zhì)反式剪接（trans－splicing）是基于斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的一種剪接方式。斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子分為兩種：一種是天然存在的，另一種是通過基因工程的方法斷裂微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子的方式獲得。1998年，Paul Liu實驗室在藍(lán)藻sp.PCC6803的DnaE蛋白中首次發(fā)現(xiàn)了天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子，IN和IC在不同的閱讀框中表達(dá)，二者在基因組中相距745226 bp［15］。這種兩段蛋白組成的斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在許多藍(lán)藻中也被發(fā)現(xiàn)［19－20］。天然斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)，暗示了標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子在進(jìn)化中丟失了歸巢內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致兩端的剪接結(jié)構(gòu)域在不同的閱讀框中表達(dá)，而且這兩段蛋白可以重新組裝成為有活性的蛋白質(zhì)內(nèi)含子，這為構(gòu)建人工斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子提供了理論依據(jù)。

2.2 構(gòu)建人工斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子

歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的作用是使蛋白質(zhì)內(nèi)含子基因可以在基因組中自由轉(zhuǎn)移，與蛋白質(zhì)剪接功能無關(guān)，而且科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)內(nèi)含子去除核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域后也有剪接活性［15，17，21］，蛋白質(zhì)內(nèi)含子的晶體結(jié)構(gòu)解析也證明了核酸內(nèi)切酶是獨立的結(jié)構(gòu)域，不參與蛋白質(zhì)剪接［22］。所以科學(xué)家們通過基因工程的方法去除標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，并以此為斷裂位點將微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子斷裂，使IN和IC在不同的閱讀框中表達(dá)，構(gòu)建了一系列人工斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子［17，23－24］。

2.3 新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子

典型蛋白質(zhì)內(nèi)含子去除歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域后，N端有110～130個氨基酸，C端有35～40個氨基酸。在蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)研究中，蛋白質(zhì)內(nèi)含子可以被應(yīng)用于蛋白質(zhì)的半合成。因為現(xiàn)有的多肽合成技術(shù)不能合成多于100aa的多肽，所以只有C端可以通過化學(xué)方法合成，而N端不可以通過化學(xué)合成的方式獲得。

為了將N端合成多肽也能連接到與其互補(bǔ)的重組表達(dá)蛋白上，Paul Liu實驗室首先在典型斷裂位點（S0）以外設(shè)計了一系列斷裂位點（圖5），其中S0是歸巢核酸內(nèi)切酶的位置，其余大部分?jǐn)嗔盐稽c是在預(yù)測的β－折疊之間的環(huán)狀區(qū)域［25］。通過他們的測試，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)內(nèi)含子的四個斷裂位點（S1，S6，S7和S8）具有蛋白質(zhì)反式剪接活性。其中S1型的IN只有11個氨基酸，IC有125個氨基酸。隨后，Paul Liu實驗室又驗證了在微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp GyrB中S11斷裂位點處有高剪接活性［26］。S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的IC只有6個氨基酸，IN有150個氨基酸。

新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子S1和S11的構(gòu)建拓寬了蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用。可以把熒光基團(tuán)、多聚物等化學(xué)修飾分子直接通過合成到化學(xué)合成多肽上，通過反式剪接把帶有蛋白修飾分子的多肽連接到重組蛋白上。新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的構(gòu)建成功，使斷裂位點不再局限于S0位點，為人們設(shè)計斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子拓寬了思路。由于化學(xué)法合成多肽對氨基酸數(shù)目有限制，所以蛋白質(zhì)內(nèi)含子IN和IC的氨基酸數(shù)目越少，那么與IN或IC一同合成的目的蛋白的氨基酸數(shù)目就越多，尋找更小的IN或IC仍然是蛋白質(zhì)內(nèi)含子研究的一個方向。

圖5 斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子序列中的斷裂位置。154 aa長的微小蛋白質(zhì)內(nèi)含子Ssp DnaB，每隔10個位置空一格排列，選出的13個斷裂位點（S1－S13）用箭頭在上方標(biāo)示，S0是歸巢核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的位置，是典型的斷裂位點。下劃線的是β－折疊（β1－β12）［25］。

3 蛋白質(zhì)剪接的應(yīng)用

蛋白質(zhì)剪接的獨特性能是它能將兩個多肽以一個天然肽鍵相連（splicing），為蛋白質(zhì)合成和修飾提供了新的途徑，因而在蛋白質(zhì)工程及其他領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。在蛋白質(zhì)反式剪接中，斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的兩個片段可以分別表達(dá)或合成，每個片段自身不能發(fā)生剪接反應(yīng)，只有兩個片段相互識別，重新構(gòu)建活性中心才能發(fā)生反式剪接。蛋白質(zhì)剪接可以應(yīng)用涉及到蛋白質(zhì)化學(xué)修飾、蛋白片段標(biāo)記同位素、蛋白質(zhì)環(huán)化、蛋白芯片、基因治療等領(lǐng)域。

3.1 蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)化學(xué)修飾中的應(yīng)用

在蛋白質(zhì)工程和蛋白質(zhì)研究中，蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾技術(shù)是非常重要的。對蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾的分子可以是熒光基團(tuán)、多聚物、非天然氨基酸、酶的輔基、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的基團(tuán)等?；瘜W(xué)修飾過的蛋白質(zhì)會擁有一些新的性質(zhì)：用生物物理探針修飾蛋白質(zhì)，可以研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；用多聚物修飾蛋白質(zhì)藥物，可以增加蛋白藥物的穩(wěn)定性，提高蛋白藥物的利用度等。

氨基修飾或巰基修飾是常見的化學(xué)修飾方法，但是標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)標(biāo)記方法做不到特異位點標(biāo)記。氨基（N端氨基和Lysε位氨基）在蛋白質(zhì)中的頻率較高，如果一個蛋白質(zhì)中的多個氨基被標(biāo)記，就會出現(xiàn)蛋白沉淀和熒光猝滅。雖然在蛋白質(zhì)中低頻率出現(xiàn)的Cys使飽和修飾成為可能，但是如果Cys在一種蛋白中出現(xiàn)多次或者Cys位于蛋白的活性中心，就不能做到位點特異性標(biāo)記。

有些新的化學(xué)方法可以進(jìn)行特異位點標(biāo)記，但是這些方法僅限于N端氨基的標(biāo)記，而且還要求蛋白的N端是暴露在外面的，也就是說能否被標(biāo)記還要依賴N端氨基酸殘基的特點［27－29］。有些方法已經(jīng)可以標(biāo)記重組蛋白，但是這些方法存在不足之處，其中有一種方法是用一種配體與多肽標(biāo)簽共價相連，通過配體與重組蛋白的非共價結(jié)合達(dá)到標(biāo)記的目的，這種方法很簡便，但是非共價鍵標(biāo)記不穩(wěn)定，而且多肽標(biāo)簽對目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有影響［30－31］。蛋白質(zhì)反式剪接為蛋白質(zhì)特異位點修飾提供了另一種方法。選擇特定的位點，將目的蛋白斷裂成兩段，分別與IN和IC融合表達(dá)。目的蛋白斷裂位點的選擇根據(jù)蛋白的不同而不同，其中一段目的蛋白只含有一個Cys或Lys。把要標(biāo)記的化學(xué)分子標(biāo)記到Cys或Lys上，再通過蛋白質(zhì)反式剪接將目的蛋白的兩個片段連接在一起［32－34］（圖6）。由于S1型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的N端僅含有11個氨基酸，S11型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的C端僅含有6個氨基酸，易于化學(xué)合成，使重組蛋白質(zhì)的N－末端或C－末端標(biāo)記更加方便?？梢詫⒁獦?biāo)記的分子和目的蛋白的片段直接通過化學(xué)合成的方法合成到IN或IC上，通過反式剪接將合成的片段和重組表達(dá)的片段拼接到一起。

圖6 利用蛋白質(zhì)反式剪接對蛋白質(zhì)進(jìn)行特異位點修飾［35］。第一步，將目的蛋白（protein of interest，POI）斷裂，分別與IN和IC融合表達(dá)，與IC融合表達(dá)的片段只含有一個Cys。第二步，將標(biāo)記物選擇性的標(biāo)記到半胱氨酸上。第三步，兩段蛋白發(fā)生反式剪接，形成帶有標(biāo)記物的蛋白。

3.2 蛋白質(zhì)剪接在NMR中的應(yīng)用

NMR（nuclear magnetic resonance，核磁共振）技術(shù)是繼x射線晶體衍射技術(shù)后研究蛋白3D結(jié)構(gòu)的又一重大進(jìn)步，這項技術(shù)在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和材料學(xué)中將是至關(guān)重要的。NMR技術(shù)除了可以研究蛋白的3D結(jié)構(gòu)以外，還可以對蛋白的構(gòu)象變化以及蛋白間的相互作用進(jìn)行研究。但是，NMR技術(shù)受限于被檢測蛋白的分子量，原因是分子量增大會造成譜峰重疊，橫向弛豫時間減少（線寬增加）。傳統(tǒng)的NMR技術(shù)很難用于研究溶液和活細(xì)胞中30kDa以上的蛋白質(zhì)。

對蛋白質(zhì)進(jìn)行片段化同位素標(biāo)記使NMR技術(shù)得到進(jìn)一步的改善，可以檢測更大的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)片段化標(biāo)記的方法有天然化學(xué)連接（NCL）、表達(dá)蛋白連接（EPL）和反式剪接（PTS）等幾種方法。天然化學(xué)連接（NCL）和表達(dá)蛋白連接（EPL）反應(yīng)中包含兩個蛋白，這兩個蛋白分別含有a－thioester和a－Cyseine，a－thioester與a－Cyseine發(fā)生反應(yīng)將兩個蛋白片段連接在一起［36］。

圖7 利用蛋白質(zhì)反式剪接對蛋白質(zhì)進(jìn)行片段化標(biāo)記同位素［37］。a.含有Tag與IC的質(zhì)粒首先在普通培養(yǎng)基中被誘導(dǎo)表達(dá)。b.更換含有同位素的培養(yǎng)基后，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白（protein of interest，POI）與IN。c.在體內(nèi)發(fā)生反式剪接。d.經(jīng)過純化，得到有片段被標(biāo)記的蛋白。

體內(nèi)（in vivo）反式剪接簡化了標(biāo)記步驟，成功的對多結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行片段同位素標(biāo)記［37－38］（圖7）。在這種方法中，兩個前體蛋白在同一細(xì)胞內(nèi)兩個不同的質(zhì)粒中表達(dá)，兩個質(zhì)粒的誘導(dǎo)方式不一樣。第一個質(zhì)粒在含有同位素的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，然后把培養(yǎng)基換成不含同位素的培養(yǎng)基，緊接著誘導(dǎo)另一的前體蛋白。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)兩種前體之后，會自發(fā)剪接反應(yīng)。經(jīng)過破碎細(xì)胞和純化，得到片段標(biāo)記的蛋白質(zhì)。Hideo Iwai研究組利用這種方法分別檢測了Src homology結(jié)構(gòu)域和酵母中Sup35p蛋白的3D 結(jié)構(gòu)［37－38］。

3.3 蛋白質(zhì)剪接在蛋白質(zhì)環(huán)化中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)環(huán)化是指將線性蛋白質(zhì)的N端和C端連接形成環(huán)形蛋白質(zhì)骨架，是設(shè)計新酶和新藥以及研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的新方法。蛋白質(zhì)環(huán)化之后限制了蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，降低了熵值，環(huán)化后的蛋白質(zhì)有更高的生物活性和更長的藥物半衰期［39］。

通常利用化學(xué)方法環(huán)化蛋白質(zhì)，這些方法包括：在N端和C端氨基酸殘基間形成二硫鍵、肽鍵或是通過連接內(nèi)部氨基酸的側(cè)鏈。但是，這些化學(xué)方法一般只用于較小的蛋白質(zhì)，不易應(yīng)用于較大的蛋白質(zhì)環(huán)化［40］。

Paul Liu和Ming－Qun Xu實驗室利用蛋白質(zhì)反式剪接技術(shù)分別對麥芽糖結(jié)合蛋白（42 kDa），?；d體蛋白（9 kDa）和綠色熒光蛋白（27 kDa）等蛋白進(jìn)行了成功的環(huán)化（圖8）［41－43］。在這種方法中，IN和IC分別與目的蛋白質(zhì)的C末端和N末端融合表達(dá)，經(jīng)過蛋白質(zhì)反式剪接之后，目的蛋白的N末端與C末端以肽鍵相連，形成環(huán)形蛋白質(zhì)。

圖8 利用蛋白質(zhì)反式剪接技術(shù)環(huán)化蛋白質(zhì)［41］。IN和IC分別與目的蛋白（protein of interest，POI）的C末端和N末端融合表達(dá)。經(jīng)過蛋白質(zhì)反式剪接之后，目的蛋白的N末端與C末端以肽鍵相連，形成環(huán)形蛋白質(zhì)。

3.4 蛋白質(zhì)剪接在基因治療中的應(yīng)用

在基因治療研究中，由于有些基因治療載體對外源基因的大小有限制，導(dǎo)致分子量大的外源基因不能應(yīng)用到基因治療中。Paul liu實驗室利用蛋白質(zhì)反式剪接成功的解決了這個問題，為基因治療中蛋白表達(dá)提供了新的方法（圖9）［44］。在實驗中，選擇分子量比較大的肌營養(yǎng)不良蛋白基因（dystrophin gene）和腺病毒載體（AAV）。6.3 kb的肌營養(yǎng)不良蛋白基因（dystrophin gene）不能被腺病毒載體（AAV）帶入宿主細(xì)胞。肌營養(yǎng)不良蛋白基因cDNA被斷裂成兩段，并分別與斷裂內(nèi)含子的IN和IC的基因融合表達(dá)，將兩段基因克隆到兩個載體中，將兩個載體共轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞中，蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)，通過蛋白質(zhì)反式剪接形成成熟的蛋白，行使基因治療的功能。

圖9 蛋白質(zhì)反式剪接在基因治療中的應(yīng)用［44］

3.5 蛋白質(zhì)剪接在其他方面的應(yīng)用

蛋白質(zhì)反式剪接還可以應(yīng)用到蛋白質(zhì)研究的其他領(lǐng)域。利用反式剪接獲得對宿主細(xì)胞有毒性的蛋白的全長序列，例如I－Tev I核酸內(nèi)切酶［45］和b－amyloid（Ab）［46］；可以利用蛋白質(zhì)反式剪接重構(gòu)球蛋白的活性，可以基于這個方法檢測蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用［47］；利用反式剪接重新構(gòu)建herbicide－resistance蛋白活性，確保轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性［48］；利用蛋白質(zhì)反式剪接把目的蛋白固定到芯片上，應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究［49］。

4 小結(jié)與展望

蛋白質(zhì)剪接技術(shù)為蛋白質(zhì)研究和蛋白質(zhì)工程提供了新工具，在蛋白質(zhì)特異位點標(biāo)記、蛋白質(zhì)片段化同位素標(biāo)記、蛋白質(zhì)環(huán)化和基因治療等方面取得了一些成果。另外，蛋白質(zhì)剪接技術(shù)可以應(yīng)用在毒性蛋白的表達(dá)、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白固定等方面。新型斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大了斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子的應(yīng)用范圍，提供了在目的蛋白質(zhì)的N－末端或C－末端標(biāo)記任意化學(xué)基團(tuán)的潛力。隨著蛋白質(zhì)剪接技術(shù)的日趨完善，蛋白質(zhì)剪接還會應(yīng)用在蛋白質(zhì)研究的其他領(lǐng)域。

然而，蛋白質(zhì)剪接技術(shù)還存在一些限制。例如，蛋白質(zhì)內(nèi)含子剪接活性受外顯子的影響，所以會在目的蛋白的斷裂位點插入一些外源氨基酸，這些氨基酸可能會對目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生影響。所以在設(shè)計目的蛋白的斷裂位點時要充分考慮到這一點。另外，有些人工構(gòu)建的蛋白質(zhì)內(nèi)含子與有些蛋白融合表達(dá)時，會得到很少的可溶性蛋白，要經(jīng)過變復(fù)性才能使蛋白質(zhì)內(nèi)含子有活性。盡管有這些限制，蛋白質(zhì)剪接技術(shù)還是應(yīng)用到了蛋白質(zhì)研究與蛋白質(zhì)工程的很多領(lǐng)域。

（2011年9月30日收到）

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