循環(huán)腫瘤細(xì)胞在肺癌中的研究進(jìn)展

李慧 崔洪霞 綜述 程穎 審校

肺癌是我國(guó)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，手術(shù)、化療、放療及分子靶向治療使肺癌的治療有了很大的提高，但其5年總生存率仍徘徊在10%-15%。源于肺癌腫瘤細(xì)胞的不斷增殖，通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT）等形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞會(huì)分泌胞外酶降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM），造成細(xì)胞間及細(xì)胞與周?chē)|(zhì)間相互附著力下降，從而利于腫瘤細(xì)胞逃離組織束縛進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，成為具有侵襲轉(zhuǎn)移能力的CTCs[1]。近年來(lái)隨著腫瘤的研究和治療技術(shù)的提高，發(fā)現(xiàn)許多腫瘤患者雖然在治療后臨床上檢測(cè)不到殘余的腫瘤細(xì)胞，但最終患者因腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而死亡，這可能與單獨(dú)用影像學(xué)技術(shù)不能檢測(cè)到微小殘留腫瘤細(xì)胞有關(guān)。這些細(xì)胞存在于外周血、骨髓、淋巴結(jié)中，在一定條件下增殖浸潤(rùn)，引起腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。這些復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞表型和表達(dá)譜與原發(fā)灶相似，因此CTCs作為一種代表原發(fā)腫瘤的“液態(tài)活檢標(biāo)本”為肺癌患者實(shí)施實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)提供了資源。而且研究[2-6]發(fā)現(xiàn)檢測(cè)CTCs有助于肺癌的早期診斷、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、判定療效、制訂個(gè)體化治療方案及判斷預(yù)后。

目前隨著對(duì)肺癌驅(qū)動(dòng)基因、癌基因、抑癌基因等基因組學(xué)的研究以及對(duì)腫瘤生物標(biāo)志物表達(dá)、缺失、差異性表達(dá)的研究，使肺癌治療進(jìn)入了針對(duì)分子標(biāo)志物化療、靶向治療的時(shí)代。但目前我們面臨的是如何提高藥物療效并減少毒性反應(yīng)、如何克服耐藥性以及解決腫瘤異質(zhì)性問(wèn)題，這些難題的攻克均需要我們提供組織標(biāo)本。但單次組織活檢由于受腫瘤的基因組變異引起的異質(zhì)性影響，可能會(huì)造成個(gè)體化診斷和分子標(biāo)志物分析的偏差。特別是在腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中，如何檢測(cè)與轉(zhuǎn)移或耐藥相關(guān)的新的分子變異很重要。目前開(kāi)展實(shí)時(shí)活檢在臨床中難以被患者接受，但隨著基因組技術(shù)的進(jìn)步，特別是CTCs的研究進(jìn)展，未來(lái)理想有可能變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

1 CTCs的檢測(cè)方法

盡管在多種腫瘤患者的外周血中能夠檢測(cè)到CTCs，但總體上來(lái)說(shuō)，血液中CTCs的數(shù)量非常少，而且在不同腫瘤患者之間或是同一腫瘤的不同患者之間CTCs數(shù)目具有較大差異。目前的主流理念是先對(duì)外周血中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行富集，然后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。富集方法主要是利用腫瘤細(xì)胞獨(dú)特的表面標(biāo)志或物理特性來(lái)進(jìn)行。后續(xù)的檢測(cè)包括基因水平的檢測(cè)或細(xì)胞水平的檢測(cè)，其中基因水平檢測(cè)的方法主要是實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR （quantitative reverse-transcription PCR, qRT-PCR），細(xì)胞水平的檢測(cè)方法有流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)（fluocytometry, FCM）、Cellsearch、CTC芯片（CTC-chip）和膜濾過(guò)分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)（isolation by size of epithelial tumor cells, ISET）等。各種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。

1.1 qRT-PCR法 秉承了PCR技術(shù)的靈敏度，可在1×107個(gè)-1×108個(gè)外周血細(xì)胞中檢測(cè)出單個(gè)腫瘤細(xì)胞，但該方法是通過(guò)腫瘤標(biāo)志物的含量推測(cè)CTCs的數(shù)目，并不能真實(shí)反映CTCs的個(gè)數(shù)。因?yàn)椴煌腃TCs之間腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平不同，因而腫瘤標(biāo)志物的含量與腫瘤細(xì)胞的實(shí)際個(gè)數(shù)并不總是具有正相關(guān)性[7]。

1.2 FCM法 采用熒光標(biāo)記相應(yīng)抗體來(lái)檢測(cè)CTCs，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速、數(shù)據(jù)精確。缺點(diǎn)是FCM不能提供細(xì)胞形態(tài)方面的信息，無(wú)法區(qū)分帶有同樣標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。由于FCM檢測(cè)靶細(xì)胞的敏感度僅為1/10萬(wàn)，而外周血中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量常少于1/100萬(wàn)，因此該方法的價(jià)值在很大程度上依賴于可分析的細(xì)胞數(shù)量，極大地限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用[8]。

1.3 Cellsearch法 Cellsearch系統(tǒng)是將細(xì)胞富集后再進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)，其生物學(xué)原理是依據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞表達(dá)的表面蛋白不同而將二者區(qū)分開(kāi)來(lái)。來(lái)源于中胚層的白細(xì)胞表達(dá)CD45，來(lái)源于外胚層的癌細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）和細(xì)胞角蛋白（cytokeratin, CK），但不表達(dá)CD45。該系統(tǒng)首先通過(guò)正選擇將血液中表達(dá)EpCAM的細(xì)胞分離出來(lái)，然后進(jìn)行免疫熒光染色，將EpCAM+CK+DAPI+CD45-的細(xì)胞界定為CTCs。應(yīng)用Cellsearch系統(tǒng)可以檢測(cè)7.5 mL的血液樣本（約含400多億的血細(xì)胞）中單一的CTCs，因此具有敏感度高、可操作性強(qiáng)、高度自動(dòng)化檢測(cè)、數(shù)據(jù)精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)。但該檢測(cè)系統(tǒng)會(huì)遺漏缺失上皮細(xì)胞表面標(biāo)志的腫瘤細(xì)胞，例如經(jīng)過(guò)EMT后的間質(zhì)細(xì)胞。此外，在檢測(cè)團(tuán)塊狀的CTCs方面也不具有優(yōu)勢(shì)[9]。

1.4 CTC-chip法 CTC-chip技術(shù)的生物學(xué)原理與Cellsearch基本相同，也是將CTCs認(rèn)定為帶有EpCAM和CK的表達(dá)但不帶有CD45表達(dá)的細(xì)胞群。CTC-chip技術(shù)具有更高的靈敏性，可以在1 mL血液中檢測(cè)出循環(huán)腫瘤細(xì)胞。第一代的CTCs芯片是基于微流體學(xué)原理，在硅片上面覆蓋眾多的顯微位點(diǎn)，每一個(gè)位點(diǎn)上都包被著能夠捕獲CTCs的抗體。當(dāng)血液樣品通過(guò)微流芯片時(shí)，CTCs就能被捕獲到[4]。因?yàn)榈谝淮腃TCs芯片僅適用于小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室研究，而不能應(yīng)用于大規(guī)模的臨床研究，第二代的CTCs芯片又名herringbone（HB）芯片應(yīng)運(yùn)而生。改進(jìn)之處在于將微芯片安裝在標(biāo)準(zhǔn)載玻片上，不但可以利用常規(guī)病理檢測(cè)方法對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行鑒別，也加大了樣本的處理量并提高了捕獲團(tuán)塊狀CTCs的能力[10]。

1.5 ISET法 ISET聯(lián)合激光掃描細(xì)胞計(jì)量?jī)x技術(shù)的原理是首先利用上皮源性的腫瘤細(xì)胞比血液中的其它細(xì)胞大的特性，采用孔徑為8 μm的濾膜，將腫瘤細(xì)胞從血液中分離出來(lái)，然后通過(guò)熒光標(biāo)記細(xì)胞來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，常用的熒光抗體包括抗CK抗體或者抗lineage-specific抗體。采用此方法已成功地在乳腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的外周血中檢測(cè)出CTCs[11]。但采用此方法檢測(cè)的CTCs數(shù)目與采用Cellsearch技術(shù)檢測(cè)的數(shù)目之間存在不一致性，可能有假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)[12]。該方法的優(yōu)勢(shì)之一是可以將失去上皮細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞分離出來(lái)，例如經(jīng)過(guò)EMT的間質(zhì)細(xì)胞等。

2 CTCs在肺癌中的臨床應(yīng)用

2.1 CTCs與肺癌早期診斷 肺癌的早期診斷對(duì)治療效果至關(guān)重要，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療是提高生存率的關(guān)鍵。研究[3,13]顯示CTCs對(duì)肺癌早期診斷具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，在無(wú)明顯臨床癥狀和轉(zhuǎn)移灶的I期患者體內(nèi)也可檢測(cè)到CTCs，說(shuō)明現(xiàn)有臨床分期的早期就已存在肺癌細(xì)胞的播散[14]，并能在大量聚集后形成具有高度轉(zhuǎn)移潛能的循環(huán)腫瘤微栓。

Allard等[15]最先采用Cellsearch系統(tǒng)檢測(cè)了99例肺癌患者（主要是NSCLC）的168個(gè)樣品，發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血中CTCs數(shù)目≥2、≥5、≥10和≥50的患者分別占總患者的20%、14%、10%和6%。隨后Nagrath等[4]采用CTC-chip檢測(cè)了55例肺癌患者外周血中CTCs，結(jié)果顯示所有患者的血液中均檢測(cè)出5個(gè)以上的腫瘤細(xì)胞，其中每毫升血液中CTCs數(shù)目為5-20、21-50、51-100和＞100的陽(yáng)性率分別為20%、20%、20%及40%。2009年后關(guān)于肺癌患者外周血中CTCs的論文不斷涌現(xiàn)。Wu等[16]檢測(cè)了47例肺癌患者，其中41例為初治患者，6例為復(fù)發(fā)患者；3例為I期-II期，22例為III期，22例為IV期；按病理類(lèi)型可分為腺癌27例，鱗癌7例，小細(xì)胞肺癌（small-cell lung cancer, SCLC）13例。結(jié)果顯示每7.5 mL血液中CTCs數(shù)目≥2的患者在初治的III期腺癌中為78%，III期鱗癌中為75%，III期SCLC中為60%，在IV期腺癌和IV期SCLC中，CTCs陽(yáng)性率分別為46%和71%，復(fù)發(fā)的患者CTCs陽(yáng)性率高達(dá)83%。

2.2 CTCs與肺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移 肺癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的重要原因，而外周血中存活的腫瘤細(xì)胞可能是造成肺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)制之一。因此研究CTCs的生物學(xué)特性可以為抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供有價(jià)值的理論依據(jù)。

日本的Tanaka等[5]檢測(cè)了125例肺癌患者外周血中的CTCs，其中包括85例腺癌，22例鱗癌，9例SCLC，9例其它病理類(lèi)型的肺癌。結(jié)果顯示在30.6%的肺癌患者中檢測(cè)到CTCs，但在12%的非惡性腫瘤患者（n=25）中也發(fā)現(xiàn)相同表型的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明CTCs數(shù)目間的差異不足以區(qū)分肺癌和非惡性腫瘤。在納入該研究的患者中，31例伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，94例無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CTCs水平與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者體內(nèi)CTCs數(shù)目升高，檢測(cè)出CTCs＞1的敏感性和特異性分別為71%和83%。通過(guò)該研究作者認(rèn)為CTCs是一個(gè)有用的、可監(jiān)測(cè)肺癌轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。

2.3 CTCs與肺癌療效 當(dāng)前對(duì)肺癌的治療是基于腫瘤病理分級(jí)、患者一般狀況及腫瘤發(fā)展趨勢(shì)等因素之上的綜合治療。但遵循統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)建立的治療方案缺乏個(gè)體化。隨著對(duì)CTCs研究的深入，發(fā)現(xiàn)其可反映腫瘤組織基因的表達(dá)變化，有助于監(jiān)測(cè)療效及建立個(gè)體化的治療方案。

Nagrath等[4]發(fā)現(xiàn)在評(píng)估化療的療效上，CTCs數(shù)量的改變與按照實(shí)體瘤的療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）進(jìn)行計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）檢查的結(jié)果具有高度一致性。Wu等[16]應(yīng)用Cellsearch對(duì)12例化療2個(gè)周期的肺癌患者跟蹤隨訪，也發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量與化療后影像學(xué)的應(yīng)答存在相關(guān)性，提示CTCs可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肺癌患者化療的療效。

采用CTCs作為生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)藥物療效的一項(xiàng)II期臨床試驗(yàn)[17]正在進(jìn)行。該研究納入了39例復(fù)發(fā)和耐藥的SCLC患者，采用替莫唑胺治療前，患者CTCs為0-929，7例為0，13例為1-4，19例≥5；存在肝轉(zhuǎn)移的患者較非轉(zhuǎn)移患者CTCs數(shù)目更高；出現(xiàn)新轉(zhuǎn)移灶的患者較原有病灶進(jìn)展的患者CTCs水平高（P=0.008）；治療第1周期末的CTCs數(shù)目與采用RECIST進(jìn)行的療效評(píng)價(jià)結(jié)果具有相關(guān)性（P=0.041），CTCs增高的患者總生存期（overall survival, OS）縮短（5個(gè)月 vs 8個(gè)月），但是基線CTCs不能預(yù)測(cè)治療反應(yīng)，也不能預(yù)測(cè)無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival, PFS）。

肺癌組織基因的表達(dá)或突變可在治療過(guò)程中發(fā)生變化，從而導(dǎo)致藥物敏感性的改變，如耐藥基因T790M的出現(xiàn)可導(dǎo)致初始對(duì)吉非替尼敏感的NSCLC患者的治療失敗。Maheswaran等[6]檢測(cè)了接受吉非替尼治療的NSCLC患者的CTCs中表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變情況，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤組織具有高度一致性，例如同樣存在T790M突變。在治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)CTCs，發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量的改變可以反映患者病情的變化趨勢(shì)和治療的療效。

2.4 CTCs與肺癌預(yù)后 在肺癌患者中，CTCs數(shù)目與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)，尤其伴隨腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而升高。因此，對(duì)肺癌CTCs研究顯示CTCs具有重要的預(yù)后價(jià)值[5,18,19]。

英國(guó)的Hou等[18]檢測(cè)了50例SCLC患者（20例局限期和30例廣泛期）外周血中的CTCs，這些患者都是初次應(yīng)用化療藥物（如鉑類(lèi)聯(lián)合依托泊苷），放療和預(yù)防性腦照射在第2個(gè)化療周期開(kāi)始并與化療同時(shí)進(jìn)行或是在第6個(gè)化療周期后進(jìn)行，在第1個(gè)療程的第1天及第15天進(jìn)行早期療效評(píng)估。化療前86%的患者中檢測(cè)到CTCs，經(jīng)過(guò)化療后患者CTCs陽(yáng)性率下降至60%。在化療后第22天時(shí)檢測(cè)到的中位CTCs為1，持續(xù)升高的CTCs預(yù)示著患者的預(yù)后差（P=0.01）。進(jìn)一步對(duì)15例樣本（CTCs數(shù)目為0-5,884）進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，所有被檢測(cè)出CTCs的樣本中均可見(jiàn)CD56陽(yáng)性細(xì)胞。CD56屬于神經(jīng)粘附分子且在小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，因此該數(shù)據(jù)說(shuō)明循環(huán)血液中的CTCs具有與組織中原發(fā)腫瘤相似的特性，即具有上皮-神經(jīng)內(nèi)分泌的雙重特征。此外，CTCs的水平與病理分期及功能狀態(tài)評(píng)分相關(guān)。廣泛期患者的中位CTCs為237，局限期為2，7例未檢測(cè)到CTCs的患者均為局限期患者。CTCs的數(shù)量也與肝轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，肝轉(zhuǎn)移患者與非轉(zhuǎn)移患者中位CTCs分別為1,197和4。CTCs水平與患者的生存相關(guān)，是一個(gè)預(yù)后因子，CTCs數(shù)目＞300的患者中位生存時(shí)間為134 d，CTCs數(shù)目＜2的患者中位生存時(shí)間為443 d（P＜0.005）。該研究報(bào)道的CTCs陽(yáng)性率明顯高于Allard等報(bào)道的陽(yáng)性率（86% vs 20%），作者分析這與SCLC增殖快、轉(zhuǎn)移發(fā)生得早及惡性度高有關(guān)。隨后，該研究小組擴(kuò)大了檢測(cè)的人群[20]，通過(guò)分析97例SCLC患者，發(fā)現(xiàn)85%患者外周血中存在CTCs?；熐癈TCs數(shù)目≥50的患者和＜50的患者相比，OS分別為5.4個(gè)月和11.5個(gè)月（P=0.002） ，這證明基線CTCs數(shù)量是SCLC獨(dú)立的預(yù)后因素。通過(guò)探索性分析53例患者在治療前后CTCs數(shù)目的變化，研究人員還發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)目變化是預(yù)測(cè)生存最明顯的變量（在調(diào)整了基線CTCs水平和其它的臨床預(yù)后因子后），化療1周期后CTCs數(shù)目不能降低到50以下的患者預(yù)后不良。

對(duì)于晚期NSCLC患者，研究人員[21]發(fā)現(xiàn)IV期患者血液中CTCs數(shù)目為0-146，IIIb期為0-3，而IIIa期檢測(cè)不到CTCs?；熐癈TCs數(shù)目＜5和≥5的患者的PFS分別是6.8個(gè)月和2.4個(gè)月，OS分別是8.1個(gè)月和4.3個(gè)月，多因素分析結(jié)果顯示CTCs數(shù)目是最強(qiáng)的預(yù)測(cè)NSCLC總生存期的指標(biāo)（P＜0.001），如果聯(lián)合參考治療前（基線）和第1次化療結(jié)束后外周血中CTCs數(shù)目，危險(xiǎn)比值更高（P＜0.001）。Das等[22]研究了17例轉(zhuǎn)移性NSCLC患者CTCs中切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair cross complementation1, ERCC1）的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。入組患者的特征包括：接受過(guò)鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療；CTCs數(shù)目≥2；可檢測(cè)到ERCC1表達(dá)。結(jié)果顯示以ERCC1表達(dá)水平1為臨界值，無(wú)ERCC1表達(dá)的患者PFS延長(zhǎng)，ERCC1表達(dá)水平高的患者PFS縮短（266 d vs 172 d, P＜0.02）。

3 問(wèn)題與展望

已有大量臨床試驗(yàn)表明，腫瘤細(xì)胞脫落、侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)是實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，CTCs具有重要臨床意義。但目前CTCs檢測(cè)的臨床應(yīng)用仍存在諸多問(wèn)題：①如何提高檢測(cè)方法和分子標(biāo)志物的敏感性和特異性；②多少個(gè)CTCs能夠代表腫瘤病灶的特征；③陰性結(jié)果中尚不能完全排除發(fā)生播散的陰性表達(dá)細(xì)胞，部分檢測(cè)陰性的患者也在近期出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；④檢測(cè)的合適時(shí)間該如何選擇，或者對(duì)CTCs陽(yáng)性患者如何綜合治療。此外原發(fā)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血循環(huán)后是否基因表型與原發(fā)腫瘤完全一致仍需進(jìn)一步研究來(lái)論證。

雖然CTCs檢測(cè)存在一系列問(wèn)題，且對(duì)CTCs的研究多集中在CTCs數(shù)量分析上，但CTCs作為新的檢測(cè)手段，其在腫瘤早期診斷、檢測(cè)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、判定療效和預(yù)后等方面的重要作用已得到了大量研究證實(shí)[23-25]。而且有學(xué)者開(kāi)始關(guān)注CTCs本身的差別，如CTCs表面的蛋白表達(dá)或其基因突變與臨床的關(guān)系。目前個(gè)體腫瘤間生物學(xué)特性的差異是個(gè)體化治療的基礎(chǔ)，如分子亞型指導(dǎo)下肺腺癌中檢測(cè)EGFR、磷脂酰肌醇激酶-3 （phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide, PIK3CA）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、c-Met等基因變異的個(gè)體化治療。而個(gè)體內(nèi)的瘤內(nèi)異質(zhì)性可能是敏感性差異和獲得性耐藥的原因之一，因此腫瘤異質(zhì)性是我們目前面臨的難題；另外探討最關(guān)鍵的分子通路和探尋新的分子標(biāo)志物是未來(lái)的研究重點(diǎn)。CTCs被視為替代原發(fā)腫瘤“液體活檢標(biāo)本”，可能有助于臨床分子檢測(cè)、分析耐藥分子機(jī)制及解決腫瘤異質(zhì)性的問(wèn)題。