碳納米管在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用及其安全性

張敬如，趙 凱，黃復(fù)生，王 昆

（中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病原生物學(xué)教研室，重慶 400038）

納米科學(xué)是目前全球關(guān)注的熱點前沿科技領(lǐng)域，人類的生活已不知不覺步入了“納米時代”。當(dāng)前已有數(shù)十種納米材料應(yīng)用于日常生活中，碳納米管可謂其中的佼佼者。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)碳納米管在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，但由于其粒徑小，可在人體主要器官分布沉積，因此其可能產(chǎn)生的生物效應(yīng)與安全性問題也逐漸成為關(guān)注的焦點。在此就相關(guān)研究作一綜述。

1 概述

碳納米管（carbon nanotube，CNT）又稱巴基小管，是由日本NEC公司的Iijima于1991年發(fā)現(xiàn)的新型納米材料，是由碳原子形成的石墨片繞中心軸按一定的螺旋角卷曲而成的無縫、中空的管體。碳納米管結(jié)構(gòu)與球烯和石墨類似，與金剛石、石墨、富勒烯同屬碳的同素異形體，按結(jié)構(gòu)可分為單壁碳納米管（SWCNT）和多壁碳納料管（MWCNT）。單壁碳納米管由單層石墨構(gòu)成，直徑0.4～2 nm，長度一般可達數(shù)十微米，甚至長達20 cm，具有較好的對稱性和單一性；多壁碳納米管由多個同心石墨圓柱體組成，層數(shù)在2～50層之間，層間距為0.34 nm，直徑2～30 nm，長度為0.1～50μm。它們的抗張強度高，質(zhì)量極輕，熱和化學(xué)穩(wěn)定性很高，并有金屬導(dǎo)體和半導(dǎo)體電學(xué)性質(zhì)。目前碳納米材料全球年產(chǎn)量已達幾百噸，產(chǎn)品涉及很多領(lǐng)域，這使得研究者、生產(chǎn)者和普通消費者都將有更多的機會接觸到碳納米管。人們在生活中可能接觸到碳納米管，主要來自含碳材料燃燒產(chǎn)生的煙塵，生產(chǎn)碳納米管時逸散出的顆粒物，以及在醫(yī)藥領(lǐng)域中以診斷和治療為目的直接注入人體的碳納米管。

2 在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 作為藥物載體

作為納米材料，碳納米管的空腔管體可容納生物特異性分子和藥物，優(yōu)良的細胞穿透性能使其可作為載體運送生物活性分子及藥物進入細胞或組織。原始碳納米管不溶于任何溶劑，而功能化修飾可改善碳納米管的溶解性和生物相容性，作為藥物、疫苗、基因等的運送載體，其應(yīng)用與研究日益深入。

熒光標(biāo)記的胺基化碳納米管與人早幼粒白血病細胞在37℃共培養(yǎng)1h后，應(yīng)用熒光顯微鏡可以觀察到，細胞表面有較多的熒光聚集，同時細胞內(nèi)也可觀察到熒光，這說明碳納米管能進入細胞內(nèi)[1]。采用異硫氰酸熒光素（isothiocyanato fluorescein，F(xiàn)ITC）標(biāo)記胺基化碳納米管及肽偶聯(lián)的碳納米管，考察這兩種修飾碳納米管的細胞穿透能力，發(fā)現(xiàn)它們均可穿透細胞膜：標(biāo)記的胺基化碳納米管主要分布于細胞質(zhì)，進入細胞核較慢；而肽偶聯(lián)的碳納米管可以快速地進入細胞核[2－3]。聚乙二醇修飾的多壁碳納米管能在不損傷質(zhì)膜的情況下進入哺乳動物細胞，其在胞內(nèi)的蓄積不僅不影響細胞增殖和周期，更重要的是對多重耐藥癌細胞和敏感細胞效果相同[4]。將抗腫瘤藥物鹽酸多柔比星裝載于羧基化碳納米管內(nèi)，由于高表面積和氫鍵作用，其吸附能力更強、性能更穩(wěn)定，載藥量和體內(nèi)吸收都較好[5]。Ito等[6]采用碳納米管作為紅細胞生成素口服制劑載體，發(fā)現(xiàn)短的碳納米管可運載更多紅細胞生成素到靶細胞，證明細胞攝取碳納米管有長度選擇。也有研究表明，不同的修飾碳納米管可穿透不同細胞，進入細胞部位也有可能不同[7]。

2.2 作為新型生物材料

碳納米管具有相當(dāng)高的強度和韌性，不能進行生物降解，細胞可以在其表面生長繁殖并沉淀新的活性物質(zhì)，再轉(zhuǎn)變成正常的功能性骨組織。原始的碳納米管不能吸附鈣離子，需先將其功能化，才能作為骨組織再生支架。作為一種新型生物材料，碳納米管在骨組織工程方面發(fā)展迅速，它可以單獨作為支架，也可以與高分子有機物或無機物復(fù)合形成支架，促進成骨細胞的增長。

羥基磷灰石是目前國際上公認的硬組織植入材料，但其力學(xué)性能較差，不能用作承重植入體。碳納米管與羥基磷灰石復(fù)合，有望在保持生物相容性的同時，改善羥基磷灰石脆性大、抗折強度低的不足。Balani等[8]把多壁碳納米管均勻包覆在羥基磷灰石上，包覆后的羥基磷灰石斷裂韌度提升了56％，而結(jié)晶度提升了27％；將磷灰石修飾的多壁碳納米管與人成骨細胞MG－63共培養(yǎng)，成骨細胞活力可達到67.23％，細胞增殖明顯提高。

2006年，Zanello等[9]率先用碳納米管作支架培養(yǎng)成骨細胞，發(fā)現(xiàn)成骨細胞在多壁碳納米管和單壁碳納米管上均有很高的細胞生長率。將碳納米管與聚碳酸酯共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)碳纖維可促進成骨細胞的黏附，而降低平滑肌細胞、成纖維細胞、軟骨細胞的黏附[10]。Usui等[11]使碳納米管緊鄰骨組織以探究其對骨的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其幾乎不引起局部炎癥反應(yīng)，并可協(xié)助骨產(chǎn)生。

碳納米管獨特的電學(xué)性質(zhì)促進了其在神經(jīng)應(yīng)用方面的研究。純化的多壁碳納米管能促進神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的電信號傳導(dǎo)[12]。用多壁碳納米管包裹傳統(tǒng)的鎢和不銹鋼等金屬電極，碳納米管層對神經(jīng)電極的記錄和電刺激信號有增強效果[13]。作為神經(jīng)再生支架，不僅要有導(dǎo)電性，還要能促進神經(jīng)元再生。研究表明，碳納米管可促進神經(jīng)組織的再生和修復(fù)，減少瘢痕的產(chǎn)生。Mattson等[14]研究發(fā)現(xiàn)，多壁碳納米管能促進神經(jīng)細胞的黏附和生長，化學(xué)修飾后的功能化碳納米管具有促神經(jīng)再生作用，可與神經(jīng)營養(yǎng)因子共價鍵結(jié)合，促進軸突的生長；在多壁碳納米管表面涂一層生物活性分子4－羥基壬烯酸（4－HNE），與未修飾多壁碳納米管比較，神經(jīng)軸突長度增加近2倍，軸突分支增加近3倍。美國研究的“納米腳手架”可以引導(dǎo)神經(jīng)祖細胞選擇性分化為神經(jīng)細胞，這一成果有望促進產(chǎn)生治療中樞系統(tǒng)癱瘓的新方法。碳納米管除具有促神經(jīng)再生作用外，還可減少神經(jīng)組織瘢痕產(chǎn)生。研究者將碳納米纖維與聚氟乙烯的混合物壓縮成平板，用來培養(yǎng)與瘢痕產(chǎn)生有關(guān)的星細胞，發(fā)現(xiàn)隨著碳納米管含量的增加，聚氟乙烯含量的減少，星細胞的黏附也呈減少趨勢。

3 毒性作用及其主要機制

3.1 肺臟毒性

由于碳納米管質(zhì)量輕，可通過呼吸道途徑進入人體，并在肺部沉積，造成肺部肉芽腫、纖維化或炎癥[15]。肺泡巨噬細胞廣泛分布于肺泡內(nèi)及呼吸道上皮表面，具有吞噬、清除異物和保護肺的功能，是呼吸道的第一道防線。碳納米管進入肺臟后主要是通過肺泡巨噬細胞清除。碳納米管被巨噬細胞吞噬后，更多地沉積在肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)，發(fā)生肉芽腫性炎癥，其損害機制可能與碳納米管的物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，尤其是小尺寸效應(yīng)，使沉積部位較深，更容易滲透進入肺深部組織[16]。研究表明，碳納米管尺寸越小，巨噬細胞越難以快速將其清除，碳納米管的粒徑和數(shù)目與造成的肺部損傷有著密切聯(lián)系。

將單壁碳納米管與炭黑和石英作對比研究時發(fā)現(xiàn)，在染毒劑量相同的情況下，單壁碳納米管的毒性超過碳黑和石英。Lam等[17]將含單壁碳納米管懸浮液通過氣管滴注方式注入小鼠肺部，同時以碳黑和石英為對照，發(fā)現(xiàn)注入0.5mg碳納米管小鼠均出現(xiàn)嚴重肺部炎癥。組織病理學(xué)檢驗結(jié)果表明，第7天后，所有顆粒都會以一定方式進入肺泡，有些顆粒甚至在長達90 d后仍停留在肺部。碳黑顆粒只引起小鼠肺部輕微炎癥；而單壁碳納米管則引起肺部上皮細胞肉芽腫形成，其毒性明顯高于對照組，并且表現(xiàn)出劑量依賴性。

3.2 細胞毒性

目前對碳納米管致細胞毒性作用的機制尚無清楚的認識，現(xiàn)階段研究認為，這與碳納米管引起的氧化應(yīng)激存在密切關(guān)系。劉穎等[18]研究了多壁碳納米管對RAW26417巨噬細胞的毒性，發(fā)現(xiàn)染毒24h后，部分細胞出現(xiàn)皺縮變形、細胞間隙變大等形態(tài)學(xué)改變。多壁碳納米管在其與組織細胞接觸的巨大表面上可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基，發(fā)生氧化損傷，破壞細胞膜的完整性，滲漏出大量總蛋白（TP）和乳酸脫氫酶（LDH），產(chǎn)生一氧化氮，從而啟動氧化應(yīng)激機制，引起細胞損傷或凋亡。單壁碳納米管對PC12細胞也顯示出較強毒性，可引起細胞活力下降，抑制細胞增殖。通過流式細胞技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，細胞被阻滯在G2/M期，S期細胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)細胞凋亡且細胞凋亡率呈劑量依賴性。其可能機制是，碳納米管作用細胞后向線粒體發(fā)生轉(zhuǎn)移，使線粒體結(jié)構(gòu)損傷及膜電位下降，導(dǎo)致細胞活性氧過量產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激。過量的活性氧可以通過直接破壞細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA，也可通過影響細胞信號傳導(dǎo)、基因調(diào)控間接引起細胞損傷。同時研究還發(fā)現(xiàn)，長單壁碳納米管較短單壁碳納米管毒性作用更大[19]。Cui等[20]的研究也與此結(jié)果相似，但細胞被阻滯在G1期，可能與碳納米管的類型或細胞株的不同有關(guān)。從碳納米管本身特性來看，粒徑越小，毒性作用可能越大[21]。顆粒尺寸越小，其表面積體積比就越大，表面原子數(shù)越多，不飽和鍵數(shù)目增多，使其具有很強的吸附能力和很高的化學(xué)活性，從而產(chǎn)生大量的活性氧自由基，干擾細胞的抗氧化防御機制，引發(fā)機體細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的產(chǎn)生。

4 展望

碳納米管具有許多優(yōu)良的物理和化學(xué)性質(zhì)，在納米材料的研究中具有重要地位，近年來，作為藥物載體和再生材料，在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛。然而，碳納米管卻是一把雙刃劍，廣泛應(yīng)用的同時也對人們健康和安全帶來一定的負面影響。研究認為，碳納米管的毒性作用與其粒徑、表面積、制備方法等有關(guān)。相信隨著研究的不斷深入，碳納米管對人類健康的影響將越來越小，它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域的作用將會逐漸凸顯。

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