DNA甲基化在肺癌早期診斷中的研究進(jìn)展

邱小明 喬艷潔 劉斌 李洋 尤嘉琮 綜述 周清華 審校

肺癌是當(dāng)今世界上對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤，也是臨床治療療效最差的惡性腫瘤。據(jù)估計(jì)2008年全世界有160萬人被診斷為肺癌，占所有腫瘤的13%，約140萬人死于肺癌，占所有腫瘤死亡的18%[1]。2010年在美國(guó)約有16萬人死于肺癌，在男性和女性均位列首位。其中，男性因肺癌死亡8.6萬人，占所有腫瘤死亡的29%，超過了位列第2-4位的前列腺癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌死亡人數(shù)的總和；女性肺癌死亡7.1萬人，占所有腫瘤死亡的26%，超過了位于第2、3位的乳腺癌和結(jié)直腸癌死亡人數(shù)的總和[2]。肺癌總的5年生存率僅為16%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于男性發(fā)病首位的前列腺癌（100%）和女性發(fā)病首位的乳腺癌（90%）。肺癌如果在局限期得到發(fā)現(xiàn)，則其5年生存率能提高到53%，然而目前僅有15%的患者能在早期發(fā)現(xiàn)。

與前列腺癌和乳腺癌相比，肺癌目前缺乏理想的早期篩查手段。胸片和痰細(xì)胞學(xué)檢測(cè)已用于肺癌的篩查，具有經(jīng)濟(jì)和方便的優(yōu)勢(shì)，但其敏感性和特異性不高，而且在高危人群進(jìn)行篩查并不能降低肺癌的死亡率[3,4]。低劑量螺旋CT有很高的敏感性，能發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)數(shù)毫米的微小病變，新篩查出的肺癌病例80%以上為I期[5-7]，如果立即手術(shù)其10年生存率達(dá)92%，而所有未治療的I期患者均在5年內(nèi)死亡[8]。然而應(yīng)用低劑量螺旋CT進(jìn)行肺癌篩查也存在一些問題：首先作為大規(guī)模篩查手段其費(fèi)用較高；其次敏感性很高，能檢查出大量非鈣化結(jié)節(jié)，其中非腫瘤性結(jié)節(jié)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腫瘤性結(jié)節(jié)，特異性不高。有研究[9]顯示低劑量螺旋CT發(fā)現(xiàn)的非鈣化結(jié)節(jié)中實(shí)際為腫瘤的結(jié)節(jié)不到2%，而確定這些結(jié)節(jié)的良惡性需要定期的CT隨訪檢查、活檢或者手術(shù)，對(duì)大部分良性結(jié)節(jié)患者這將造成巨大的精神負(fù)擔(dān)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)甚至身體創(chuàng)傷。

由于影像學(xué)技術(shù)在肺癌早期篩查中未能顯示出良好的效果，人們開始將目光轉(zhuǎn)向肺癌早期診斷的分子標(biāo)志物，遺憾的是迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)一個(gè)敏感性和特異性較高的分子標(biāo)志物。近年來肺癌表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展特別是DNA甲基化的研究[10]發(fā)現(xiàn)，肺癌發(fā)生早期就存在很多特有的腫瘤相關(guān)基因（其中包括癌基因和腫瘤抑制基因）甲基化程度的改變，為肺癌的早期診斷標(biāo)志物的探索提供了新的契機(jī)。

1 DNA甲基化的原理及應(yīng)用

DNA甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA中CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾現(xiàn)象[11]。DNA甲基化通常發(fā)生在基因的5'端啟動(dòng)子和第1外顯子“CpG島”區(qū)域，長(zhǎng)約1 kb，能夠引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[12,13]。近來研究[14]發(fā)現(xiàn)DNA甲基化還發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2 kb左右稱為“CpG島岸”（CpG island shore）的區(qū)域，絕大部分組織特異性的DNA甲基化發(fā)生在“CpG島岸”而非“CpG島”區(qū)域，在結(jié)腸癌中大部分腫瘤特異的DNA甲基化差異區(qū)域分布在“CpG島岸”。由于DNA甲基化出現(xiàn)在幾乎所有腫瘤中，并且發(fā)生在癌前病變和癌變?cè)缙?，因此是腫瘤早期診斷的理想標(biāo)志物[15,16]。DNA甲基化檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于，通過PCR擴(kuò)增可以檢測(cè)很微量的組織DNA，具有很高的敏感性，并且DNA發(fā)生甲基化的區(qū)域明確，便于設(shè)計(jì)引物或探針檢測(cè)。某些基因的甲基化還可以在體液中檢測(cè)到，因此非常適合無創(chuàng)檢測(cè)應(yīng)用于腫瘤的早期診斷[17,18]。然而近年來通過高通量的芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)每個(gè)基因都有一個(gè)以上的甲基化位點(diǎn)，任何一個(gè)位點(diǎn)的甲基化都沒有出現(xiàn)在所有腫瘤中，某一位點(diǎn)的檢測(cè)只能診斷出一個(gè)亞類的腫瘤，而且不同人的甲基化模式也不相同，因此對(duì)于基因的表達(dá)和腫瘤的發(fā)生起到關(guān)鍵作用的甲基化位點(diǎn)和模式還需要進(jìn)一步的研究[14,19-21]。近年來已有大量DNA甲基化的研究[20-22]，特別是腫瘤中單個(gè)或多個(gè)基因的甲基化的檢測(cè)，結(jié)合分析其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用以及與臨床病理特征的關(guān)系，可以用于疾病的早期篩查、預(yù)防、診斷治療與預(yù)后分析。

2 DNA甲基化在肺癌早期診斷中的應(yīng)用

DNA甲基化改變常發(fā)生于腫瘤形成過程，包括全基因組水平DNA低甲基化和CpG島高甲基化[23]。腫瘤組織中全基因組水平DNA低甲基化可以激活原來保持沉默的原癌基因表達(dá)，而高甲基化使DNA轉(zhuǎn)錄受到抑制，使經(jīng)典抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因和DNA錯(cuò)配修復(fù)基因不表達(dá)或低表達(dá)從而引發(fā)腫瘤[24-27]。因此檢測(cè)這些基因是否有高甲基化將有望在肺癌發(fā)生的早期發(fā)現(xiàn)腫瘤。對(duì)于DNA甲基化在肺癌早期診斷中的應(yīng)用探索，也經(jīng)歷了從單基因檢測(cè)到多基因聯(lián)合檢測(cè)、從肺癌組織中檢測(cè)到各種無創(chuàng)微創(chuàng)介質(zhì)檢測(cè)的發(fā)展過程。

2.1 肺癌組織DNA甲基化的檢測(cè) DNA甲基化標(biāo)志物要作為早期診斷的指標(biāo)，首先必須證實(shí)其與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在肺癌組織中有高甲基化，并且最好能在早期肺癌甚至原位癌或者癌前病變中就能檢測(cè)到。而腫瘤的發(fā)生是多步驟、多因素并涉及很多基因改變的復(fù)雜過程，其中抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生的重要分子基礎(chǔ)，早期的研究集中驗(yàn)證了各個(gè)已知的抑癌基因在肺癌組織中的甲基化和基因表達(dá)情況，并分析其與腫瘤類型、分期等的關(guān)系，以期作為早期篩查的標(biāo)志物。

抑癌基因p16是重要的細(xì)胞周期調(diào)控基因，能負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及分裂，一旦失活則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖發(fā)生惡性腫瘤。Belinsky等[28]用甲基化特異性PCR（methylation specific PCR, MSP）的方法檢測(cè)了18例肺鱗癌患者，發(fā)現(xiàn)11例（61.1%）患者的p16啟動(dòng)子發(fā)生了較高水平的甲基化，并且在其中75%的癌旁原位癌組織中檢測(cè)到p16啟動(dòng)子甲基化，甚至在很早期癌前病變基底細(xì)胞增生（17%）和鱗狀上皮化生（24%）中就發(fā)現(xiàn)p16啟動(dòng)子甲基化，因此被認(rèn)為可作為肺癌早期診斷的標(biāo)志物。而另外的報(bào)道有不同的結(jié)果，Kim等[29]檢測(cè)了185例肺癌組織，其中僅50例（27%）發(fā)現(xiàn)p16啟動(dòng)子甲基化，其中鱗癌（41%）的甲基化陽性率高于腺癌（22%）。不同文獻(xiàn)[30-42]報(bào)道的p16甲基化的陽性率差異較大（21.9%-80.2%），其差異可能是由于檢測(cè)的方法、選擇的人群、肺癌的病理類型及檢測(cè)樣本量的不同引起。

抑癌基因APC通過調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性，影響細(xì)胞遷移能力，起到維持染色體穩(wěn)定性的作用，其失活與結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Brabender等[43]報(bào)道，在91例非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的腫瘤組織中，86例（95%）檢測(cè)到APC啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性，而且這些患者的正常肺組織中也檢測(cè)到80例（88%）陽性，而在10例正常對(duì)照組人群肺組織標(biāo)本中僅2例（20%）陽性，差異明顯，有望成為診斷標(biāo)志物。Usadel等[44]也報(bào)道了在99例原發(fā)性肺癌組織中發(fā)現(xiàn)95例（96%）有APC啟動(dòng)子甲基化。而大部分其它研究報(bào)道的陽性率則不高，Kim等[45]檢測(cè)了99例外科切除肺癌組織，其中僅48例（48%）發(fā)現(xiàn)APC啟動(dòng)子甲基化。而Lin等[46]檢測(cè)了123例I期NSCLC，其中僅49例（40%）檢測(cè)到APC啟動(dòng)子區(qū)域甲基化。Virmani等[47]用MSP的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)106例NSCLC組織和細(xì)胞系中56例（53%）甲基化，50例小細(xì)胞肺癌中13例（26 %）甲基化，而68例非癌組織中3例（4%）甲基化。Zhang等[48]檢測(cè)了78對(duì)NSCLC組織和配對(duì)的癌旁組織中APC基因甲基化的情況，其中肺癌中甲基化率為56%（44例），而癌旁組織中僅為13%（10例），盡管陽性率不高，但是在正常組織和癌組織中差異明顯，仍有可能成為早期診斷的標(biāo)志物。

RASSF1A作為一個(gè)腫瘤抑制基因，能夠通過穩(wěn)定微管、調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生的作用[49]。Dammann等[50]從3號(hào)染色體短臂上克隆并證實(shí)RASSF1A基因在肺癌中表達(dá)缺失，并且主要與啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化有關(guān)。Endoh等[51]檢測(cè)了100例NSCLC組織，發(fā)現(xiàn)其中42例（42%）有RASSF1A甲基化，但其結(jié)果提示RASSF1A甲基化與腫瘤的類型、分期等沒有相關(guān)性。但Tomizawa等[52]檢測(cè)110例I期肺腺癌發(fā)現(xiàn)35例（32%）有RASSF1A甲基化，并且與胸膜、血管侵犯和分化差相關(guān)。Zhang等[48]檢測(cè)78例NSCLC組織和配對(duì)的癌旁組織中RASSF1A基因甲基化的情況，其中肺癌中甲基化率為39.7%（31例），而癌旁組織中僅為7.7%（6例）。其它報(bào)道[53-57]的肺癌中RASSF1A基因甲基化率在29%-41%。

其它研究較多的抑癌基因和腫瘤相關(guān)基因包括DAPK、FHIT、DLEC1、RARβ、hMLH1、MGMT、CDH1、CDH13、CADM1、CALCA等[58]，經(jīng)過這些研究大量基因被證實(shí)在肺癌組織中存在不同程度的甲基化，其差異可能源于采取的檢測(cè)方式、檢測(cè)的人群以及病理類型的不同，但總的來說單個(gè)基因甲基化的陽性率不高，無法達(dá)到肺癌早期篩查的標(biāo)準(zhǔn)。而且大多數(shù)研究?jī)H僅檢測(cè)腫瘤組織的甲基化情況，缺乏對(duì)照，無法評(píng)價(jià)其作為診斷指標(biāo)的敏感性和特異性。因此進(jìn)一步的研究還需要探索和發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性更高的DNA甲基化標(biāo)志物，或者聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物，以提高其作為早期診斷指標(biāo)的敏感性和特異性。

隨著研究的深入和技術(shù)的進(jìn)步，近年來DNA甲基化的研究則側(cè)重于運(yùn)用高通量檢測(cè)技術(shù)以驗(yàn)證和評(píng)價(jià)多個(gè)已知的甲基化位點(diǎn)作為肺癌早期診斷的價(jià)值，并探索和發(fā)現(xiàn)新的肺癌甲基化標(biāo)志物。甲基化熒光定量PCR（MethyLight）是一種熒光實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR技術(shù)，通過引物和探針設(shè)計(jì)，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因的甲基化情況。Feng等[59]應(yīng)用MehtyLight技術(shù)檢測(cè)了49對(duì)NSCLC組織和癌旁組織的27個(gè)基因甲基化情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)RASSF1、DAPK1、BVES、CDH13、MGMT、KCNH5、RARβ和CDH1的甲基化情況在肺癌組織中陽性率為80%，而在癌旁組織中僅為14%。Jin等[60]檢測(cè)了72例肺癌患者腫瘤和癌旁組織的p16、APC、CDH13、RARβ、RASSF1、RUNX3和MYOD1 7個(gè)基因甲基化情況，發(fā)現(xiàn)鱗癌和腺癌的甲基化模式有差異。Tsou等[61]應(yīng)用MehtyLight技術(shù)檢測(cè)了51例肺腺癌，38例肺癌患者的遠(yuǎn)癌肺組織和11例非肺癌患者的肺組織的28個(gè)甲基化位點(diǎn)，其中CDH13、CDKN2A EX2、CDX2、HOXA1、OPCML、RASSF1、SFPR1和TWIST1在腺癌中高甲基化，而聯(lián)合CDKN2A EX2、CDX2、HOXA1和OPCML用于檢測(cè)肺腺癌和癌旁組織的敏感性達(dá)到94%，特異性達(dá)到90%。Anglim等[62]應(yīng)用MehtyLight技術(shù)檢測(cè)了45對(duì)鱗癌和癌旁組織的42個(gè)甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)鱗癌中GDNF、MTHFR、OPCML、TNFRSF25、TCF21、PAX8、PTPRN2和PITX2這8個(gè)基因甲基化程度明顯高于癌旁組織，聯(lián)合這8個(gè)基因的甲基化對(duì)于檢測(cè)鱗癌達(dá)到95.6%的敏感性和特異性。甲基化發(fā)生在腫瘤發(fā)生的非常早期，Selamat等[63]分析了249例組織樣本的15個(gè)甲基化位點(diǎn)，包括正常的癌旁組織、非典型腺瘤樣增生（atypical adcnomatous hyperplasia, AAH）組織、原位腺癌（adenocarcinoma insitu, AIS）和侵襲性腺癌組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDKN2A EX2和PTPRN2的甲基化程度在AAH時(shí)已經(jīng)明顯升高，而2C35、EYA4、HOXA1、HOXA11、NEUROD1、NEUROD2和TMEFF2的甲基化程度在AIS時(shí)明顯升高，而CDH13、CDX2、OPCML、RASSF1、SFRP1及TWIST1的高甲基化和全基因組低甲基化主要出現(xiàn)在侵襲性腺癌中，這些結(jié)果將有助于癌前病變和早期肺癌的診斷。

Ehrich等[64]利用以質(zhì)譜分析為基礎(chǔ)的胞嘧啶甲基化譜分析（cytosine methylation profiles）技術(shù)分析了96例患者肺癌和癌旁組織的47個(gè)甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)CLEC3B、MGP、RASSF1、SDK2、SERPINB5和XAGE1A這6個(gè)基因的甲基化在肺癌組織中明顯高于相應(yīng)癌旁正常肺組織。限制性標(biāo)記基因組掃描（restriction landmark genomic scanning）通過二維電泳在一塊膠上最多可以分析2,000個(gè)啟動(dòng)子序列，運(yùn)用該技術(shù)Dai等[65]對(duì)1,184個(gè)CpG島的研究發(fā)現(xiàn)11個(gè)基因和6個(gè)ESTs在肺癌和正常組織中甲基化有差異，其中GNAL和PDX1基因的甲基化比例超過50%。

芯片技術(shù)的發(fā)展為DNA甲基化研究提供了更好的平臺(tái)，具有高通量、大規(guī)模、高靈敏性等特點(diǎn)。甲基化芯片能將所有已知的甲基化位點(diǎn)集成在一張芯片上，同時(shí)檢測(cè)整個(gè)腫瘤甲基化的變化，從而更深入地理解肺癌發(fā)生發(fā)展中DNA甲基化的模式，篩選出在肺癌中有診斷價(jià)值的新的DNA甲基化標(biāo)志物[66,67]。Field等[68]運(yùn)用甲基化芯片技術(shù)設(shè)計(jì)檢測(cè)59個(gè)候選基因的245個(gè)甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)鱗癌中ADPRH、GP1BB、RARβ和TMEFF2高甲基化，腺癌中CDKN1C、MGMT和TMEFF2高甲基化。Fukasawa等[69]運(yùn)用類似方法研究分析288個(gè)腫瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)28個(gè)潛在的甲基化標(biāo)志物，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PAX3和ASC在肺癌組織中有很高的甲基化率。Rauch等[70,71]使用含有12,192個(gè)CpG島的甲基化芯片，發(fā)現(xiàn)包括肺癌中包括DLEC1和PAX7等基因在內(nèi)的50個(gè)甲基化位點(diǎn)有明顯差異，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HOXA9和HOXA7等基因可作為鱗癌診斷的標(biāo)志物。Bibikova等[72]應(yīng)用基于磁珠的液相甲基化芯片技術(shù)在腺癌中對(duì)807個(gè)基因的1,505個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一組特異性的甲基化譜包括ASCL2、CDH13、HOXA11、HOXA5、NPY、RUNX3、TERT和TP73。目前最新的甲基化芯片包括了近3萬個(gè)甲基化位點(diǎn)，能覆蓋了整個(gè)基因組范圍95%以上的甲基化位點(diǎn)。

基因表達(dá)譜芯片技術(shù)也被用于探索潛在的甲基化位點(diǎn)，通過基因表達(dá)譜芯片對(duì)比甲基化抑制劑5-Aza-dC處理前后基因表達(dá)譜的變化，可以篩選出大量甲基化基因。Shames等[73]通過這種方法發(fā)現(xiàn)132個(gè)腫瘤特異性的甲基化位點(diǎn)，其中7個(gè)（ALDH1A3、BNC1、CCNA1、CTSZ、LOX、MSX1和NRCAM）在肺癌和癌旁組織中差異明顯，可作為肺癌診斷標(biāo)志物。

通過這些高通量的檢測(cè)方法可以迅速地篩選出很多潛在的甲基化標(biāo)記物，但是這些新的標(biāo)記物必須通過傳統(tǒng)方法在原發(fā)腫瘤組織中進(jìn)行驗(yàn)證。目前不同文獻(xiàn)報(bào)道的甲基化位點(diǎn)各不相同，很多基因并沒有重復(fù)性，因此還需要更多的試驗(yàn)進(jìn)行探索和驗(yàn)證，并盡可能地排除人種、腫瘤病理類型和數(shù)據(jù)分析方法等因素的影響。

DNA甲基化作為肺癌早期診斷的分子標(biāo)志物，其敏感性和特異性是研究關(guān)注的焦點(diǎn)。在以往的研究中DNA甲基化對(duì)肺癌診斷的敏感性和特異性也存在很大的差異，目前尚未發(fā)現(xiàn)敏感性和特異性非常高的DNA甲基化標(biāo)志物。在不斷探索和篩選敏感性和特異性更高的DNA甲基化標(biāo)志物的同時(shí)，人們也在不斷優(yōu)化組合現(xiàn)有的DNA甲基化標(biāo)志物，通過多基因聯(lián)合檢測(cè)以提高早期診斷的敏感性和特異性。Shivapurkar等[74]報(bào)道了HS3ST2、DAPK和TNFRSF10C組合區(qū)分肺癌和癌旁組織的受試者工作特征曲線的曲線下面積達(dá)到0.959，用于診斷肺癌有很高的敏感性和特異性。Ehrich等[64]報(bào)道的6個(gè)基因的組合分辨肺癌和癌旁組織的敏感性和特異性均大于95%。而Bibikova等[72]報(bào)道的55個(gè)基因的組合區(qū)分腺癌和癌旁組織的敏感性達(dá)到100%，特異性達(dá)到92%。Tsou等[61]報(bào)道了5個(gè)基因的組合診斷肺腺癌的敏感性達(dá)94%，特異性達(dá)90%。Anglim等[62]報(bào)道了8個(gè)基因組合檢測(cè)鱗癌達(dá)到95.6%的敏感性和特異性。Zhang等[48]報(bào)道了5個(gè)基因的組合用于診斷肺癌的敏感性達(dá)到83.64%，特異性達(dá)74.0%。盡管這些報(bào)道非常鼓舞人心，但是這些結(jié)果還需要更大量的人群進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，肺癌組織的檢測(cè)并不能用于肺癌的早期篩查中，因此這些標(biāo)志物還需要在早期篩查中常用的無創(chuàng)微創(chuàng)介質(zhì)如血液、痰液中進(jìn)行驗(yàn)證，以評(píng)價(jià)其敏感性和特異性。

2.2 血液中DNA甲基化的檢測(cè) 外周血是肺癌早期篩查和診斷比較理想的樣本，腫瘤患者血液中存在腫瘤細(xì)胞釋放的高水平的循環(huán)DNA，并且與原發(fā)腫瘤有著相同的基因改變[75,76]。Usadel等[44]在47%的肺癌患者血清中發(fā)現(xiàn)APC基因甲基化。Ulivi等[40]報(bào)道肺癌患者血清中p16和CDH13的甲基化陽性率分別為26%和23%。Liu等[41]報(bào)道肺癌患者血清中p16甲基化為72%，Bearzatto等[77]報(bào)道肺癌患者血清中p16甲基化為55%。Wang等[78]也報(bào)道肺癌患者血清中RASSF1A甲基化為33.8%（27/80），而在良性肺疾病患者和正常人血清中沒有檢測(cè)到。Kneip等[79]報(bào)道了SHOX2甲基化診斷肺癌的敏感性為60%，特異性達(dá)到90%，且分期越晚，敏感性越高。

同樣也有大量研究聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)甲基化標(biāo)志物，以提高診斷的敏感性和特異性。Esteller等[76]檢測(cè)了22例肺癌患者的腫瘤組織和血清中DNA的p16、DAPK、GSTP1和MGMT的甲基化情況，結(jié)果顯示15例（68%）的患者至少有1個(gè)基因甲基化，而在這些患者血液中11例（72%）患者發(fā)現(xiàn)基因甲基化。Fujiwara等[80]檢測(cè)了91例肺癌患者，發(fā)現(xiàn)血清中MGMT甲基化為18.7%，p16為15.4%，RASSF1A為12.1%，DAPK為11.0%，RARβ為6.6%；以這5個(gè)基因作為診斷指標(biāo)檢測(cè)肺癌的敏感性為49.5%，特異性為85.0%。其中1個(gè)基因甲基化陽性患肺癌的相對(duì)危險(xiǎn)度為5.28。Tan等[81]檢測(cè)了肺癌患者血漿中RUNX3甲基化為55%（11/20），p16為50%（10/20），RASSF1A為30%（6/20），CDH1為20%（4/20），以這4個(gè)基因?yàn)闃?biāo)志物檢測(cè)肺癌陽性率為90%（19/20）。Hsu等[82]篩選6個(gè)基因組合（BLU、CDH13、FHIT、p16、RARβ和RASSF1A），其腫瘤和血漿樣本甲基化的一致率分別為86%、87%、80%、75%、76%和84%，以其中血漿中檢測(cè)到兩個(gè)基因甲基化為診斷標(biāo)準(zhǔn)篩查肺癌的敏感性為73%，特異性為82%。Ostrow等[83]選擇4個(gè)基因組合（DCC、Kif1a、NISCH和Rarβ）檢測(cè)肺癌的敏感性為73%，特異性為71%，結(jié)合CT能更好的診斷肺癌。Begum等[84]篩選了6個(gè)基因組合（APC、CDH1、MGMT、DCC、RASSF1A和AIM），其中DCC 1個(gè)基因的檢測(cè)敏感性為35.5%，特異性為100%，而6個(gè)基因的組合檢測(cè)敏感性增加到75%，而特異性下降到73%。

然而血液中DNA甲基化檢測(cè)的最大不足之處是缺乏組織特異性，目前檢測(cè)的這些甲基化的基因標(biāo)志物不僅在肺癌中有甲基化，在很多其它腫瘤中也有甲基化，尚未發(fā)現(xiàn)1個(gè)標(biāo)志物只在肺癌中有甲基化。因此血液中的甲基化檢測(cè)異常的結(jié)果還需要結(jié)合特異性更高的影像學(xué)檢查，以確定腫瘤的位置。目前隨著甲基化芯片、焦磷酸測(cè)序等技術(shù)用于肺癌基因甲基化的研究中，期望能發(fā)現(xiàn)肺癌特異性的甲基化標(biāo)志物。另外，在肺來源的檢測(cè)介質(zhì)中檢測(cè)DNA甲基化有望增加檢測(cè)的特異性。

2.3 痰液中DNA甲基化的檢測(cè) 痰液含有來自肺和下呼吸道的脫落細(xì)胞，具有一定的特異性，痰液中的甲基化檢測(cè)也有較多報(bào)道。Belinsky等[28]最早在痰液中檢測(cè)了p16甲基化，在7例肺癌患者中發(fā)現(xiàn)3例有p16甲基化，而26例對(duì)照僅有5例發(fā)現(xiàn)p16甲基化，有明顯差異。隨著檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)和敏感性的提高，Palmisano等[85]報(bào)道肺癌發(fā)生前3年在所有鱗癌患者的痰液中就能檢測(cè)出p16和/或MGMT的甲基化。Liu等[41]檢測(cè)了50例肺癌患者，其中痰液中p16甲基化率為76%，并發(fā)現(xiàn)只有腫瘤組織有p16甲基化的肺癌患者痰液中檢測(cè)到p16甲基化。Wang等[86]報(bào)道肺癌中hMLH1啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率為55.8%，而在痰液中檢測(cè)的一致率為72%。Olaussen等[87]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了95.5%的肺癌患者痰液中細(xì)胞學(xué)檢測(cè)陰性，而DNA甲基化檢測(cè)卻有陽性發(fā)現(xiàn)。Belinsky等[88]檢測(cè)了肺癌患者和吸煙者痰液中的p16、MGMT、RASSF1A和DAPK等7個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)＞3個(gè)基因甲基化陽性肺癌患者是吸煙者的6.2倍。進(jìn)一步設(shè)計(jì)病例對(duì)照研究[89]發(fā)現(xiàn)，基因甲基化隨著診斷肺癌的時(shí)間接近而增加，以p16、MGMT、DAPK、RASSF1A、PAX5b和GATA5這6個(gè)基因作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中≥3個(gè)基因甲基化陽性肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加6.5倍，篩查肺癌的敏感性和特異性達(dá)到65%。其它在痰液中評(píng)價(jià)的基因還有ASC/TMS1[90]和HOXA9[91]。但是痰液作為檢測(cè)介質(zhì)的局限主要來自中央大氣道，因此對(duì)于鱗癌的診斷價(jià)值比較大，而對(duì)于主要在肺周圍的腺癌則可能不太適合。

2.4 支氣管灌洗液中DNA甲基化的檢測(cè) 同痰液類似，支氣管灌洗液（bronchoalveolar lavage, BAL）來源于肺的特定肺葉，可能含有肺癌細(xì)胞或者DNA可用于肺癌早期診斷。雖然獲取支氣管灌洗液無創(chuàng)，但需要借助氣管鏡，對(duì)于患者來說還是一項(xiàng)比較痛苦的操作，因此限制了其在大規(guī)模篩查中的應(yīng)用。但是對(duì)于懷疑肺癌的高危患者，氣管鏡是必做的檢查，因此對(duì)于這部分人群BAL還是容易獲得和理想的檢查介質(zhì)。Ahrendt等[92]最早檢測(cè)了BAL中的p16甲基化，發(fā)現(xiàn)50例患者的肺癌組織中有19例發(fā)現(xiàn)p16甲基化，這19例患者中11例在BAL中檢測(cè)到p16甲基化。Grote等[93,94]報(bào)道在支氣管灌洗液中APC甲基化診斷肺癌的敏感性達(dá)98.5%，而特異性為39%，聯(lián)合p16和RARβ2診斷肺癌敏感性69%，特異性達(dá)87%。Kim等[95]檢測(cè)了85例NSCLC患者的BAL發(fā)現(xiàn)68%的樣本至少檢出p16、RARβ、H-cadherin和RASSF1A其中之一的甲基化。Topaloglu等[96]報(bào)道了聯(lián)合檢測(cè)APC、MGMT、RASSF1A、p16等8個(gè)基因，在肺癌患者BAL中的陽性率為68%。Schmiemann等[97]的一項(xiàng)回顧性病例對(duì)照研究中報(bào)道247例可疑肺癌患者（確診89例）的BAL中，聯(lián)合APC、p16和RASSF1A甲基化檢測(cè)的診斷敏感性為53%，特異性為99%。

2.5 呼出氣冷凝液中DNA甲基化的檢測(cè) 呼出氣檢測(cè)是近年來處于探索階段的比較新的無創(chuàng)檢測(cè)方式，在診斷哮喘、慢性阻塞性肺病等肺疾病中已初步體現(xiàn)出應(yīng)用價(jià)值。呼出氣冷凝液（exhaled breath condensate, EBC）中除了大部分水蒸氣外，還含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等，可用于肺癌的診斷[98]。而目前在EBC中檢測(cè)DNA甲基化的報(bào)道較少，Han等[99]檢測(cè)17例肺癌患者和37例健康對(duì)照的EBC中DAPK、RASSF1A和PAX5β啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，初步證實(shí)了EBC中DNA來源于肺，檢測(cè)其基因甲基化模式可以區(qū)分出肺癌患者和吸煙對(duì)照人群。呼出氣冷凝液中DNA甲基化檢測(cè)在肺癌診斷中的價(jià)值尚需要更多研究探索。

3 問題與展望

盡管近年來DNA甲基化用于早期肺癌診斷受到廣泛的關(guān)注，對(duì)大量的DNA甲基化標(biāo)志物應(yīng)用于肺癌診斷的價(jià)值也進(jìn)行了探索和驗(yàn)證，但是目前DNA甲基化分子標(biāo)志物應(yīng)用于臨床肺癌診斷還存在著一些問題。首先由于采取的檢測(cè)方式、檢測(cè)的人群以及病理類型的不同，各個(gè)基因在不同報(bào)道中的甲基化陽性率有較大差異；其次作為腫瘤標(biāo)記物，單個(gè)基因的陽性率不高，特異性很高的位點(diǎn)極少，達(dá)不到用于肺癌早期篩查的標(biāo)準(zhǔn)；另外，用于臨床診斷和篩查的標(biāo)本應(yīng)該是無創(chuàng)或微創(chuàng)方式得到的介質(zhì)，如痰液、血液等，而大量的DNA甲基化標(biāo)志物尚未在這些標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證。隨著研究的不斷深入和各種高通量研究手段的應(yīng)用，更多敏感性和特異性高的DNA甲基化標(biāo)志物有望被發(fā)現(xiàn)并用于肺癌早期診斷試劑盒的開發(fā)，成為肺癌早期診斷的有力工具。