全反式維甲酸對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬Aβ蛋白沉積的影響

郭 玫， 翟蘊(yùn)新， 孟令慧

全反式維甲酸對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬Aβ蛋白沉積的影響

郭 玫1， 翟蘊(yùn)新2， 孟令慧1

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的主要臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶障礙，組織病理上可見(jiàn)老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)和基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失［1］，其中老年斑的主要成分為β淀粉樣蛋白(β－amyloid protein，Aβ)。AD的病因還不是很清楚，很多學(xué)者認(rèn)為Aβ的沉積是AD的始發(fā)因素，因此，針對(duì)Aβ的治療措施將成為一種很有潛力的治療方法。近年來(lái)，有研究［2］證明全反式維甲酸(all－trans retinoic acid，ATRA)具有抑制Aβ沉積的作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)AD模型大鼠行為學(xué)水平的評(píng)價(jià)和海馬Aβ蛋白沉積的檢測(cè)，探討全反式維甲酸對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及相應(yīng)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器設(shè)備 大鼠立體定位儀(日本東京成茂科學(xué)器械研究所);水迷宮(北京新天地公司);切片機(jī)(德國(guó)Leica);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus);顯微圖像分析儀(日本Olympus)。

1.2 主要藥品和試劑 Aβ1－40試劑(美國(guó)Sigma公司); ATRA(美國(guó)Sigma公司);兔抗大鼠Aβ1抗(美國(guó)Sigma公司);羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程公司);SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 220～250g健康雄性SD大鼠(購(gòu)于中國(guó)醫(yī)大動(dòng)物部)，于造模前進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練3d，剔除差異明顯者，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、AD模型組和對(duì)照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組:大鼠制成AD模型3d后，按20mg/kg的劑量腹腔注射ATRA，每周3次，連續(xù)注射8w。AD模型組:大鼠制成AD模型3d后，腹腔注射等容積溶解液，每周3次，連續(xù)注射8w。對(duì)照組:大鼠大腦海馬區(qū)注射5μl生理鹽水3d后，再腹腔注射等容積溶解液，每周3次，連續(xù)注射8w。

1.4 AD動(dòng)物模型的制作 首先孵育Aβ1－40，用生理鹽水溶解Aβ1－40，配成10μg/μl的溶液。37℃孵育1w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的 Aβ1－40。大鼠經(jīng) 10%水合氯醛腹腔麻醉(300mg/kg)后，固定于立體定位儀上，常規(guī)備皮消毒，切開(kāi)頭部皮膚，暴露硬腦膜。定位海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)(前囟后3.0mm，中線旁開(kāi)2.2mm，顱骨表面下2.8mm)，微量進(jìn)樣器自腦表面垂直進(jìn)針，將Aβ1－401μl緩慢注入，注射速度為5μl/ h，留針10min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，縫合切口，所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。對(duì)照組注入等體積生理鹽水。術(shù)后動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，3d后進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)者為造模成功。

1.5 水迷宮試驗(yàn) 參照Morris［3］方法進(jìn)行。大鼠在造模前訓(xùn)練3d，記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間，此時(shí)間稱逃避潛伏期，每一時(shí)間段內(nèi)4次潛伏期的算術(shù)平均數(shù)為這一時(shí)段的成績(jī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)第3天成績(jī)剔除差異明顯者。造模3d后進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，檢測(cè)造模是否成功。給藥8w后再次行水迷宮試驗(yàn)，檢測(cè)ATRA對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1.6 免疫組化法檢測(cè)Aβ蛋白 水迷宮實(shí)驗(yàn)后次日即進(jìn)行Aβ蛋白免疫組化染色。10%水合氯醛腹腔麻醉，經(jīng)左心室灌注生理鹽水，沖凈體內(nèi)血液，然后用4%多聚甲醛液灌流固定，取腦，取材范圍為前囟后2.3～3.8mm，置于4%多聚甲醛中后固定24h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，每隔100μm連續(xù)作6μm厚腦冠狀面石蠟切片。常規(guī)脫蠟至水，3%的去離子水孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡3min，滴加山羊血清室溫孵育lh，傾去。滴加1∶600稀釋的兔抗大鼠Aβ蛋白一抗，4℃過(guò)夜。PBS沖洗3min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃作用30min。PBS洗3min ×3次，滴加試劑SABC，37℃20min。PBS洗5min×4次，滴加DAB顯色劑，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片。每個(gè)標(biāo)本取3張切片，顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，細(xì)胞漿中呈棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。在400倍高倍鏡下，隨機(jī)觀察海馬區(qū)不重疊的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞面積百分比并分別計(jì)算其算術(shù)平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果 造模3d后，AD模型組(25.7± 3.93s)和實(shí)驗(yàn)組(27.3±3.91s)逃避潛伏期均較對(duì)照組(10.3±2.24s)明顯延長(zhǎng)(P＜0.05);給藥8w后，AD模型組(36.6±5.27s)和實(shí)驗(yàn)組(22.4±3.85s)逃避潛伏期均明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(8.9±1.96s)(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期明顯短于AD模型組(P＜0.05)。

2.2 Aβ在腦內(nèi)沉積情況 對(duì)照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)則、緊密，形態(tài)完整，未見(jiàn)Aβ沉積，AD模型組和實(shí)驗(yàn)組海馬神經(jīng)元缺失，可見(jiàn)Aβ沉積;實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性細(xì)胞(4.54± 0.68%)顯著少于AD模型組(6.98±0.69%)(P＜0.05)。

3 討論

在阿爾茨海默病(AD)病理機(jī)制的研究中，淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說(shuō)是廣為接受的一個(gè)學(xué)說(shuō)。該假說(shuō)基本觀點(diǎn)為Aβ的聚集和沉積及其伴隨的神經(jīng)元損害是老年癡呆病理機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。Aβ在腦組織沉積會(huì)形成老年斑，同時(shí)引起tau蛋白高度磷酸化，繼而形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)。Aβ的沉積還能引起各種免疫炎癥反應(yīng)和神經(jīng)毒性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致以海馬和大腦皮質(zhì)為主的廣泛的神經(jīng)元變性、死亡，出現(xiàn)漸進(jìn)性的神經(jīng)遞質(zhì)主要是膽堿能和多巴胺能遞質(zhì)減少，最終導(dǎo)致記憶和認(rèn)知功能障礙，產(chǎn)生AD癥狀。

全反式維甲酸(ATRA)是維生素A在體內(nèi)的活性代謝物，維生素A具有強(qiáng)大的抗氧化和抗細(xì)胞變性的作用，而氧化和細(xì)胞變性是一系列神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病包括AD的病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)缺乏維生素A會(huì)導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)Aβ的聚集［4］和嚙齒類動(dòng)物記憶的下降［5］?？臻g學(xué)習(xí)和記憶的下降不僅見(jiàn)于維生素A缺乏的動(dòng)物，也見(jiàn)于老齡嚙齒類動(dòng)物［6］，給予繼甲酸(維生素A酸，retinoic acid，RA)可使癥狀得到改善。進(jìn)一步的臨床研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)存在類維生素A轉(zhuǎn)運(yùn)和功能的缺陷［7］，提示提高腦內(nèi)類維生素A的利用可能預(yù)防或減少與Aβ相關(guān)的神經(jīng)變性［7，8］。維生素A在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)化為ATRA［9］，盡管RA具有多種立體異構(gòu)體，但多以ATRA的形式存在。在試管中［2］，RAα受體信號(hào)系統(tǒng)可阻止細(xì)胞內(nèi)外Aβ的沉積，這種作用與金屬蛋白10的表達(dá)增加有關(guān)，金屬蛋白10是一種α分泌酶，通過(guò)使淀粉前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)進(jìn)入到無(wú)淀粉通路，阻止Aβ形成。ATRA還可在試管中減少新鮮的Aβ向纖維狀A(yù)β轉(zhuǎn)化［10］，減少Aβ沉積。連續(xù)8w給予5月齡APP/PS－1轉(zhuǎn)基因小鼠ATRA［11］，發(fā)現(xiàn)ATRA可通過(guò)下調(diào)p35的水平調(diào)節(jié)Aβ的軸突運(yùn)輸，減少Aβ的沉積，同時(shí)ATRA可下調(diào)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(Cyclin dependent kinase，CDK)的水平，而在既往的研究中［12～14］，CDK在神經(jīng)元APP的磷酸化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。

以上的研究表明ATRA作用于Aβ沉積的多個(gè)步驟，減少Aβ的生成，抑制Aβ的聚集和沉積，但鮮少有研究證明ATRA對(duì)AD確有治療效果。本研究利用立體定位海馬內(nèi)注射Aβ建立AD動(dòng)物模型，通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶能力的改變，免疫組化方法檢測(cè)海馬Aβ蛋白沉積，探討ATRA對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及病理的改變。結(jié)果顯示ATRA組水迷宮逃避潛伏期較AD模型組明顯縮短，同時(shí)AD模型組和治療組海馬神經(jīng)元缺失，周圍出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)，且ATRA組海馬Aβ的沉積明顯少于AD模型大鼠，表明ATRA可以改善AD動(dòng)物模型的認(rèn)知功能，這種治療作用可能與海馬Aβ的沉積減少有關(guān)，這與Ding等［11］的研究結(jié)果一致。Ding發(fā)現(xiàn)ATRA在抑制APP/PS－1轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ沉積的同時(shí)，還可能通過(guò)下調(diào)CDK5的水平減少tau蛋白磷酸化，同時(shí)顯著減少活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞。ATRA還能夠克服由 Aβ肽介導(dǎo)的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的下降［15］，使膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶維持在正常水平，以保證膽堿能遞質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)和功能。

目前AD治療研究的方向都是抑制Aβ產(chǎn)生、促進(jìn)其降解或加強(qiáng)其從腦內(nèi)清除。Aβ1－40肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗Aβ抗體，可以使腦內(nèi)Aβ沉積顯著減少，改善轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能［16］，但多中心的臨床試驗(yàn)因患者出現(xiàn)腦膜腦炎的副反應(yīng)而被中止［17］。神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)損傷神經(jīng)元具有保護(hù)和修復(fù)作用，然而由于血腦屏障的緊密連接，常規(guī)給藥腦內(nèi)濃度極低。尼莫地平對(duì)老年癡呆癥和腦血管痙攣有效，但肝首過(guò)效應(yīng)嚴(yán)重，在腦內(nèi)靶位的含量更低。ATRA作為脂溶性小分子，能夠輕易跨越細(xì)胞膜屏障，全身給藥后在腦組織高度集中［18］，且毒理學(xué)性質(zhì)已確立，若能確定對(duì)AD的治療作用，是一種可行性極高的治療手段。我們應(yīng)加大樣本量，繼續(xù)探索ATRA對(duì)AD動(dòng)物模型的作用及機(jī)制，為AD的臨床治療提供理論依據(jù)。

［1］Glenner GG，Wong CW.Alzheimer’s disease:initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein［J］.Biochem Biophys Res Commun，1984，120(3):885－890.

［2］Jarvis CI，Goncalves MB，Clarke E，et al.Retinoic acid receptor－α signalling antagonizes both intracellular and extracellular amyloid－β production and prevents neuronal cell death caused by amyloid－β［J］. Eur J Neurosci，2010，32(8):1246－1255.

［3］Morris RG，Carrud P，Raulins JN，et al.Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions［J］.Nature，1982，297(5868):681－683.

［4］Corcoran JP，So PL，Maden M，et al.Disruption of the retinoid signalling pathway causes a deposition of amyloid beta in the adult rat brain［J］.Eur J Neurosci，2004，20(4):896－902.

［5］Cocco S，Diaz G.，Stancampiano R.，et al.Vitamin A deficiency produces spatial learning and memory impairment in rats［J］.Neuroscience，2002，115(22):475－482.

［6］Etchamendy N，Enderlin V，Marighetto A.，et al.Alleviation of a selective age－related relational memory deficit in mice by pharmacologically induced normalization of brain retinoid signaling［J］.J Neurosci，2001，21(16):6423－6429.

［7］Goodman AB，Pardee AB.Evidence for defective retinoid transport and function in late onset Alzheimer’s disease［J］.Proc.Natl Acad Sci USA，2003，100(5):2901－2905.

［8］Goodman AB.Retinoid receptors，transporters and metabolizers as therapeutic targets in late onset Alzheimer’s disease［J］.Cell Physiol，2006，209(3):598－603.

［9］Sandell LL，Sanderson BW，Moiseyev G，et al.RDH10 is essential for synthesis of embryonic retinoic acid and is required for limb，craniofacial，and organ development［J］.Genes Dev，2007，21(9):1113－1124.

［10］Ono K，Yoshiike Y，Takashima A，et al.Vitamin A exhibits potent antiamyloidogenic and fibril－destabilizing effects in vitro［J］.Exp Neurol，2004，189(2):380－392.

［11］Ding Y，Qiao A，Wang Z，et al.Retinoic acid attenuates beta－amyloid deposition and rescues memory deficits in an Alzheimer’s disease transgenic mouse model［J］.J Neurosci，2008，28(45):11622－11634.

［12］Iijima K，Ando K，Takeda S，et al.Neuron－specific phosphorylation of Alzheimer’s beta－amyloid precursor protein by cyclin－dependent kinase 5［J］.J Neurochem，2000，75(3):1085－1091.

［13］Liu F，Su Y，Li B，et al.Regulation of amyloid precursor protein (APP)phosphorylation and processing by p35/Cdk5 and p25/ Cdk5［J］.FEBS Lett，2003，547(1－3):193－196.

［14］Wen Y，Planel E，Herman M，et al.Interplay between cyclin－dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase 3 beta mediated by neuregulin signaling leads to differential effects on tau phosphorylation and amyloid precursor protein processing［J］.J Neurosci，2008，28 (10):2624－2632.

［15］Sahin M，Karauzum SB，Perry G，et al.Retinoic acid isomers protect hippocampal neurons from amyloid－beta induced neurodegeneration［J］.Neurotox Res，2005，7(3):243－250.

［16］Schenk D，Barbour R，Dunn W，et al.Immunization with amyloid－beta attenuates Alzheimer－disease－like pathology in the PDAPP mouse［J］.Nature，1999，400(6740):173－177.

［17］Orgogozo JM，Gilman S，Dartigues JF，et al.Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Aβ42 immunization［J］.Neurology，2003，61(1):46－54.

［18］Le Doze F，Debruyne D，Albessard F，et al.Pharmacokinetics of alltrans retinoic acid，13－cis retinoic acid，and fenretinide in plasma and brain of rat［J］.Drug Metab Dispos，2000，28(2):205－208.

1003－2754(2012)06－0549－02

R742

2012－02－29;

2012－05－28

(1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽(yáng)110002;2.沈陽(yáng)市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽(yáng)110002)