靶向釋放智能納米載體的研究進(jìn)展＊

顧君彤，徐維平，陸 楊 ，徐婷娟，黃向華，張勇強(qiáng)

(1.安徽中醫(yī)學(xué)院研究生部，安徽 合肥 230038; 2.安徽省立醫(yī)院，安徽 合肥 230001;3.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥 230026)

納米尺度的載體在藥物靶向釋放研究中的應(yīng)用，為疾病的預(yù)防、診斷和治療提供了新的途徑。納米技術(shù)在生物應(yīng)用、靶向藥物載體中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以有效地減少藥物在臨床治療中的副作用，并提高療效[1]。大多數(shù)抗腫瘤藥物在治療時(shí)不具有選擇性，也會(huì)殺傷正常組織，而納米載體可將藥物或基因靶向傳輸?shù)饺梭w中不同的治療部位，提高藥物在治療部位的有效濃度，提高細(xì)胞對(duì)藥物攝取率和藥物透過細(xì)胞膜的能力，降低不良反應(yīng)發(fā)生率。

1 納米靶向傳輸系統(tǒng)

納米靶向傳輸系統(tǒng)是目前最理想、最有發(fā)展前途的給藥方式。它通過載體將藥物選擇性輸送到特定的靶向部位，然后載體解體并釋放藥物，分為納米主動(dòng)靶向傳輸系統(tǒng)和納米被動(dòng)靶向傳輸系統(tǒng)。

納米被動(dòng)靶向傳輸系統(tǒng)是指納米載體對(duì)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)具有靶向性，藥物在特定的給藥部位聚集，使其可在肝臟和脾被動(dòng)靶向釋放生物活性物質(zhì)。刺激-響應(yīng)型控制釋放給藥系統(tǒng)只有在信號(hào)刺激下納米載體才會(huì)釋放載附物。例如，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)或聚氧化乙烯(polyethylene oxide，PEO)修飾的長(zhǎng)循環(huán)納米粒在靜脈注射給藥后，基于實(shí)體瘤的通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))，使得載體在腫瘤組織周圍聚集[2]。

納米主動(dòng)靶向傳輸系統(tǒng)是經(jīng)過修飾的藥物載體定向靶向至特定的治療部位。由于腫瘤細(xì)胞增殖迅速，一些特定的受體表達(dá)增強(qiáng)，使細(xì)胞對(duì)葉酸、維生素和糖的攝取增加。配體修飾納米載體技術(shù)是對(duì)人體腫瘤細(xì)胞主動(dòng)靶向的一個(gè)重要方法[3]。一些研究小組利用鐵離子結(jié)合-轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)納米載體進(jìn)行主動(dòng)靶向修飾。

2 智能納米載體

納米載體由無機(jī)和有機(jī)的材料組成，包括可降解或不可降解的聚合物、類脂等自組裝，自組裝雙嗜性分子，樹枝狀高分子材料，金屬和無機(jī)半導(dǎo)納米晶體[1]。選擇何種材料作為載體主要依據(jù)診斷疾病的類型、治療的目的、材料的安全性、給藥的方式。近年來，將納米粒、脂質(zhì)體、納米囊、納米膠束、樹枝狀高分子等作為藥物或基因靶向傳輸系統(tǒng)中的載體受到了學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。

智能納米載體亦稱刺激-響應(yīng)型納米載體，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ乃幬镙d體，能夠滿足某些特定的釋放要求，能被人體內(nèi)生物信號(hào)如pH、溫度、氧化還原電位等信號(hào)激發(fā)釋放藥物或基因治療片段到特定的部位[5]。此外，還有一些可以通過外界刺激信號(hào)(如磁場(chǎng)、光、聲)激發(fā)，靶向釋放藥物和基因片段。以下就刺激響應(yīng)納米載體在藥物和基因靶向傳輸系統(tǒng)中的研究進(jìn)展，尤其是近年來興起的智能載體—氧化-還原刺激響應(yīng)納米載體展開介紹。

1)氧化-還原刺激響應(yīng)型納米載體

細(xì)胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽(glutathiose，GSH)水平約是細(xì)胞外的100～1 000倍[6]，氧化-還原型納米載體是基于該區(qū)別設(shè)計(jì)的，也稱谷胱甘肽響應(yīng)型納米載體。當(dāng)納米載體進(jìn)入細(xì)胞后，胞內(nèi)的GSH濃度高于胞外，二硫鍵在還原環(huán)境中不穩(wěn)定，隨即釋放藥物和基因治療片段，如阿霉素(dox-orubicin，DOX)、DNA質(zhì)粒、RNA干擾片段、寡聚核苷酸等。

氧化-還原刺激響應(yīng)型納米粒:納米粒(nanoparicles)是粒徑在1～1 000 nm之間的固態(tài)膠體粒子。Lai等[6]在2002年首先明確提出了氧化-還原刺激響應(yīng)控制釋放體系的概念。在介孔內(nèi)修飾2-丙基硫烷基乙胺活性功能基團(tuán)的介孔硅(mesoporous silica nanoparticles，MSN)，載附萬古霉素后，與巰基乙酸的衍射物CdS通過二硫鍵進(jìn)行連接。在以磷酸鹽緩沖液為釋放介質(zhì)的體外累積釋放率試驗(yàn)中，12 h后萬古霉素的體外累積釋放率小于1%;加入還原劑二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)后，體外累積釋放率達(dá)到了85%。Luo等[7]在 Lai研究的基礎(chǔ)上，制備了聚乳酸(lactobionic acid，LA)受體介導(dǎo)的LA-COL-linker-MSN型介孔硅，用異硫氰酸熒光素(FIFC)進(jìn)行熒光標(biāo)記。將 LA-COL-linker-MSN/FIFC納米粒與MSN/FIFC納米粒的HepG 2細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，前者2 h透細(xì)胞膜的效率是后者3倍。

基因傳輸系統(tǒng)成功靶向至細(xì)胞的關(guān)鍵，是其在血液循環(huán)中具有高度穩(wěn)定性，這可以通過聚合物分子鏈與聚合物納米載體之間形成共價(jià)鍵結(jié)合，即分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，從而使聚合物納米粒穩(wěn)定，避免解離和提前釋放質(zhì)粒DNA。但殼聚糖高分子主鏈與巰基結(jié)合后易于氧化，在細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境中打開二硫鍵，釋放質(zhì)粒DNA。但殼聚糖-巰基氨基丁烷-DNA納米粒在Caco-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率的研究表明，其作為基因傳遞系統(tǒng)中的新型載體具有良好的應(yīng)用前景[8]。

氧化-還原刺激響應(yīng)型脂質(zhì)體:脂質(zhì)體(lipsome)在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，可作為藥物傳遞載體、生物傳感器和催化劑等，是為數(shù)不多的已經(jīng)在臨床上使用的靜脈注射藥物的載體。氧化-還原刺激響應(yīng)型脂質(zhì)體作為實(shí)現(xiàn)靶向釋放的一種重要途徑，是由普通磷脂、親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)通過二硫鍵連接的類脂組成。脂質(zhì)體在血液循環(huán)中均很穩(wěn)定，在還原環(huán)境下，二硫鍵還原成巰基，釋放脂質(zhì)體內(nèi)的組分[9]。Wanlop研究小組[10]制備的脂質(zhì)體由1-(2，3-二油酰基)-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸鹽、磷脂酰膽堿、聚乙二醇組成，具有良好的生物安全性。將反義核苷酸G3139通過二硫鍵與脂質(zhì)體連接，在人體口腔癌KB細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境中，二硫鍵還原成巰基，釋放出反義核苷酸G3139，從而降低了抑凋亡基因(bcl-2)的表達(dá)。二硫鍵修飾脂質(zhì)體與未經(jīng)二硫鍵修飾的脂質(zhì)體相比，前者抑制bcl-2基因的表達(dá)更顯著。

氧化-還原刺激響應(yīng)型納米囊:納米囊(nanocapsules，NCs)有著獨(dú)特的物理以及膠體性質(zhì)，內(nèi)部含有1個(gè)或多個(gè)空腔的微球，可由1種聚合物組成，也可以由多種聚合物組成。Zhao等[11]用吸附胱冬肽酶-3(caspase 3，CP-3)的丙烯酰胺單體通過二硫鍵與N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸連接，制備外層為聚合物電解質(zhì)，內(nèi)核為CP-3的S-S納米囊(S-SNCs)。S-SNCs的粒徑為11.3 nm，zeta電位為(3.6±0.1)mV。在含2 mmol/L GSH的磷酸鹽緩沖液中2 h后，平均粒徑降至為5.3 nm，zeta電位變?yōu)樨?fù)值，結(jié)果NCs的二硫鍵在還原環(huán)境下幾乎全部解開，透射電子顯微鏡中也未觀察到呈球形的納米囊。細(xì)胞抑制率試驗(yàn)證實(shí)，載附CP-3的S-SNCs誘導(dǎo)了HeLa，U87MG等細(xì)胞株的凋亡。Kim等[12]通過二硫鍵連接制備了內(nèi)部為空心結(jié)構(gòu)、外部為厚2 nm的聚合物電解質(zhì)層，平均粒徑約為70 nm的納米囊，經(jīng)體外釋放試驗(yàn)結(jié)果證明，在100 mmol/L的DTT溶液中，納米囊迅速的釋放羧基熒光標(biāo)記物。

氧化-還原刺激響應(yīng)型水凝膠:納米水凝膠(nanogels)具有可調(diào)節(jié)的粒徑、三維的結(jié)構(gòu)、良好的力學(xué)性能、高水溶性和生物相容性等特點(diǎn)，在生物工程、藥物制劑和生物材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用，可作為抗癌藥物、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒DNA等的載體。新型巰基化修飾的透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)納米水凝膠包覆 siRNA[13]，與HCT-116細(xì)胞中表面的特異性CD44受體結(jié)合后，可迅速被細(xì)胞攝取。電泳檢測(cè)游離siRNA在模擬人體血液環(huán)境下，4 h后迅速降解，而siRNA/HA納米水凝膠中，siRNA在24 h后都很穩(wěn)定。此外，Matyjaszewski及其團(tuán)隊(duì)[14]研究了具有用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)還原性敏感功能基團(tuán)修飾的水凝膠，這些水凝膠可以載附各種水溶性的生物大分子如抗腫瘤藥、蛋白質(zhì)等。包覆DOX的納米水凝膠，載藥率約為50% ～70%，且不具有毒性。當(dāng)Hela細(xì)胞中的GSH達(dá)到20wt%時(shí)，Hela細(xì)胞的增殖被抑制。Groll等[15]利用巰基修飾的超支化聚縮水甘油和聚環(huán)氧乙烷聚環(huán)氧丙烷單丁基醚制備出還原敏感型水凝膠，且通過L929細(xì)胞的MTT試驗(yàn)表明，這種水凝膠具有良好的生物相容性。這些納米凝膠在10 mmol/L濃度的GSH溶液中迅速降解。

氧化-還原刺激響應(yīng)型納米膠束:納米膠束(nanomicelles)由兩親性嵌段共聚物組成，具有表面親水、內(nèi)部疏水的獨(dú)特殼核結(jié)構(gòu)，具有溶解度高、載藥量高、毒性低的特性。納米膠束具有的小尺寸效應(yīng)，可以避免過快地被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)攝取和經(jīng)腎臟代謝，延長(zhǎng)了膠束在血液循環(huán)的時(shí)間，使其容易被動(dòng)靶向聚集在腫瘤組織。Wen等[16]制備氨基化修飾的聚乙二醇(mPEG)和聚芐氧羰基賴氨酸(polyε-benzyloxycarbonyl-L-lysine，PzLL)通過二硫鍵連接形成新型納米膠束-mPEG-SS-PzLL，并載附抗腫瘤藥物DOX。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞攝取率試驗(yàn)中，將FITC熒光標(biāo)記的DOX納米膠束與MCF-7乳腺癌細(xì)胞在10 mmol/L GSH組共培養(yǎng)4 h后，其熒光強(qiáng)度是0 mmol/L GSH組的1.68倍，二者的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)mPEG-SS-PzLL納米膠束具有谷胱甘肽響應(yīng)性。

樹枝狀高分子:樹枝狀高分子材料(dendrimers)由聚合物高度接枝組成，具有高度支化、單分散性、高對(duì)稱性的特點(diǎn)[17]。Harth及其研究小組[18]研究制備了載附多肽的樹枝狀高分子材料，粒徑大小約為 5～10 nm。Kurtoglu[19]用聚酰胺(poly a-midoamine，PAMAM)樹枝狀高分子材料作為藥物和基因傳遞的載體，提高了腫瘤組織的EPR效應(yīng)。N-乙?；腚装彼?N-acetylcysteine，NAC)通過二硫鍵與PAMAM樹枝狀高分子材料連接后，能提高藥物療效、減少用藥劑量、避免藥物與血漿蛋白結(jié)合。在模擬血循環(huán)GSH濃度的體外釋放試驗(yàn)中，NAC的體外累積釋放率幾乎為零;在模擬細(xì)胞內(nèi)GSH濃度下，NAC的體外累積釋放率約為66%。熒光標(biāo)記的PAMAM-NAC在小膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取試驗(yàn)中，材料與細(xì)胞共培養(yǎng)2 h后，熒光強(qiáng)度增加了兩倍。將載體與配體結(jié)合后，可以很好地靶向釋放藥物到特定細(xì)胞內(nèi)。

2)pH敏感型納米載體

感染組織、原發(fā)腫瘤和繼發(fā)腫瘤組織的pH都比正常組織低。這是由于腫瘤組織迅速的增殖，腫瘤的脈管系統(tǒng)經(jīng)常不能充分的供給營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣給大量的腫瘤細(xì)胞。不充分的供養(yǎng)使得腫瘤組織缺氧，產(chǎn)生乳酸和ATP水解，產(chǎn)生一個(gè)酸性的微環(huán)境，使得腫瘤組織的pH低于正常組織[20]。許多實(shí)體瘤組織比周圍正常組織的pH要低。根據(jù)此性質(zhì)，可設(shè)計(jì)pH敏感型的刺激響應(yīng)型藥物或者基因靶向傳輸系統(tǒng)。pH敏感型β-聚氨基酯(poly betaamino ester，PbAE)是新型生物可降解的陽(yáng)離子型聚合物的一種，可作為特異性藥物和基因傳遞系統(tǒng)。在腫瘤組織酸性的微環(huán)境中，PbAE迅速解體并釋放載附物。以PbAE納米粒作為藥物載體，腫瘤組織的紫杉醇量明顯高于用非pH敏感型聚己丙酰胺納米粒載體的是[21]，有效提高了紫杉醇的治療效果。

3)溫度敏感型納米載體

在過去的20年中，隨著熱生物學(xué)及溫度檢測(cè)器技術(shù)的發(fā)展，在治療實(shí)體腫瘤的化學(xué)療法或放射性療法中，利用腫瘤組織局部溫度過高的治療思路越來越受到關(guān)注。腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞對(duì)熱損傷更為敏感。Han等[22]用聚異丙基丙烯酰胺-丙烯酰胺單體(poly N-isopropylacrylamide-co-acrylamide，PNIPAM-AAM)和聚乙二醇對(duì)脂質(zhì)體的表面進(jìn)行修飾，在聚合物的相變溫度下，提高了PNIPAAm-AAM/PEG修飾的脂質(zhì)體釋放DOX的量。此外，研究表明，修飾后的脂質(zhì)體在血液循環(huán)中比未修飾的脂質(zhì)體更穩(wěn)定。

4)其他刺激響應(yīng)型納米載體

磁場(chǎng)響應(yīng)性納米載體，尤其是磁敏感水凝膠能夠在外磁場(chǎng)環(huán)境產(chǎn)生變化時(shí)通過折疊、膨脹或收縮等方式對(duì)外界刺激產(chǎn)生響應(yīng)，因而在生物相關(guān)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景[23]。近年來，超聲在靶向給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用越來越受到一些學(xué)者的關(guān)注。注射含有藥物的膠束后，通過聲裂釋放藥物，這種技術(shù)可以使膠束均勻分布在腫瘤組織中[24]。光敏型納米載體也是近年來研究的熱點(diǎn)，特定波長(zhǎng)的可見光可使膠束解體而釋放藥物[25]。

3 展望

以智能納米載體為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)載附抗癌藥物、抗氧化劑、多肽、蛋白質(zhì)和核酸等的靶向釋放系統(tǒng)，可提高治療效果、避免耐藥性、減少不良反應(yīng)。但現(xiàn)有的研究中還有許多問題有待解決，納米載體進(jìn)入細(xì)胞的方式尚未明確，有報(bào)道指出是通過溶酶體和內(nèi)涵體介導(dǎo)的胞吞的途徑進(jìn)入細(xì)胞，但這種說法存在爭(zhēng)議，未達(dá)成一致意見;現(xiàn)有的研究未對(duì)智能納米載體在體內(nèi)的穩(wěn)定性和降解方式做出明確解釋;許多學(xué)者報(bào)道的不是在臨床范圍內(nèi)可應(yīng)用的可生物降解或生物相容性材料。值得關(guān)注的是，最近關(guān)于星形聚合物、阿拉伯糖醇的可降解衍生物聚氨基甲酸酯和線性可降解的聚合物等相關(guān)報(bào)道，為納米載體修飾提供了更多的選擇。我們深信，設(shè)計(jì)合理的智能納米載體，最終將被廣泛地應(yīng)用于人類重大疾病的預(yù)防、診斷和靶向治療。

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