發(fā)芽糙米γ－氨基丁酸的檢測(cè)及研究進(jìn)展

劉紅梅，魏淘濤，劉行丹，劉建豐

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生理與分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128)

糙米的發(fā)芽過程是一個(gè)酶解過程［1］，大量的酶被激活和釋放，并從結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，這特定的生理活性化過程，使發(fā)芽糙米具有多種藥理功能。其中，在谷氨酸脫羧酶的作用下由谷氨酸轉(zhuǎn)化而成的γ－氨基丁酸 (GABA，又名氨酪酸)，是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動(dòng)植物及其各部位中，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，具有降低血壓，抗動(dòng)脈硬化，使腦部血液流量活躍，促進(jìn)乙醇代謝，降血脂、防止肥胖、消除體臭的作用［2，3］。

1GABA的含量檢測(cè)

對(duì)發(fā)芽糙米GABA的研究，含量檢測(cè)是各項(xiàng)工作的基礎(chǔ)，尤為重要。國內(nèi)外學(xué)者探索過的GABA測(cè)定方法有改良的Berthelot比色法［4］、氨基酸分析儀法［5］、改良紙層析法［6］、液相色譜法［7］、薄層掃描法［8］、毛細(xì)管電泳電化學(xué)法［9］、柱層析熒光法［9］、紙電泳比色［9］等。前 4種方法應(yīng)用較普遍，分述如下。

1.1 比色法

Berthelot比色反應(yīng)是利用苯酚和次氯酸鈉與游離氨反應(yīng)形成藍(lán)綠色化合物，常用來測(cè)定不同體系中微量氨及其鹽類。由于GABA反應(yīng)靈敏，α－氨基酸響應(yīng)低，利用兩者的響應(yīng)差別懸殊，進(jìn)行GABA的鑒定。陳恩成等［4］應(yīng)用此法，用60%乙醇溶液提取糙米和發(fā)芽糙米粉中的GABA，在70℃下回流提取2 h，其離心上清液以重蒸苯酚和次氯酸鈉溶液作為顯色劑顯色反應(yīng)，在645 nm處比色測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照計(jì)算樣品中GABA的含量。結(jié)果表明:該法簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)0.98%，平均回收率99.4%，適合于批量分析GABA。

1.2 改良紙層析法

張暉等［6］應(yīng)用改良紙層析法分析GABA，結(jié)果表明:點(diǎn)樣量在8～40 μg，點(diǎn)樣線距濾紙2.0 cm，樣品間距2.0 cm，展開體系 (正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶3，0.4 g/d L茚三酮)，90℃烘干顯色 10 min，洗脫液 (1 g/L硫酸銅∶75%乙醇=2∶38)，10～50 min內(nèi)520 nm處比色能得到較好的結(jié)果。此法簡單易行，耗費(fèi)低廉，可作為GABA分析檢測(cè)的方法之一。

1.3 氨基酸分析儀

錢愛萍等［5］用氨基酸自動(dòng)分析儀比較了53 min標(biāo)準(zhǔn)程序與30 min短程序快速測(cè)定發(fā)芽糙米和中藥材中的GABA含量。用0.02 mol/L檸檬酸緩沖液配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品粉碎過篩，用0.02 mol/L鹽酸溶液溶解并加入6%磺基水楊酸15 mL于沸水浴中加熱回流5 min，振蕩30 min后，用pH 2.2檸檬酸緩沖液定容至50 mL，室溫下靜置1 h后，取離心上清液，用0.45 μm過濾膜過濾后待上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明:兩種程序測(cè)定結(jié)果相對(duì)誤差小于3%，峰位置和峰面積重現(xiàn)性變異系數(shù)分別為0.17%和0.23%，回收率97.89%～101.2%。該改良方法穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確，適于GABA的測(cè)定。

1.4 液相色譜法

因GABA本身對(duì)紫外光吸收不靈敏，所以液相色譜法一般采用柱前衍生引入具有強(qiáng)紫外吸收的基團(tuán)，再進(jìn)行檢測(cè)。衍生試劑類型很多，常用的有鄰苯二甲醛 (OPA)、丹酰氯 (Dansyl－Cl)、2，4－二硝基氟苯 (FDNB)、異硫氰酸苯酯 (PITC)、氯甲酸芴甲酯 (FMOC)、6－氨基喹啉基－N－羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯 (AQC)和2，4－二硝基氯苯 (CDNB)等。其中，房克敏等［7］采用AQC為柱前衍生試劑，Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱，梯度洗脫，紫外檢測(cè)波長248.0 nm，分析了16種發(fā)芽糙米，得到GABA保留時(shí)間23.051 min，線性范圍0.10～1.0 μmol/mL，線性方程為y=3.0 106x－7877.6，r=0.9999，回收率為 99.0% ～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.1%。該法抗干擾能力強(qiáng)，且易于操作、穩(wěn)定、靈敏、準(zhǔn)確。

2 發(fā)芽糙米GABA研究進(jìn)展

2.1 國外研究概況

1964年日本曾提倡國民食用糙米，每天一餐，但終因口感差而難以推廣。1994年T.Saikusa［10］在改善稻米食用品質(zhì)試驗(yàn)中，首先發(fā)現(xiàn)糙米發(fā)芽后，游離氨基酸的組成和含量發(fā)生了顯著變化，其中主要集中在胚芽部分的GABA含量大幅度提高。同年，T.Saikusa又檢測(cè)了日本10個(gè)不同品種的稻米胚芽富集GABA的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種的米胚芽富集GABA的能力有很大差異，其中GABA富集最高的是巨胚米。

2001年，日本農(nóng)林水產(chǎn)省食品綜合研究所和日本中國農(nóng)業(yè)試驗(yàn)場(chǎng)，共同研究開發(fā)成功世界首例發(fā)芽糙米［11］，并已產(chǎn)業(yè)化、商品化。目前日本市場(chǎng)采用真空包裝的發(fā)芽糙米價(jià)格是糙米的2倍。由于發(fā)芽糙米比糙米的營養(yǎng)價(jià)值和生理活性具有明顯的優(yōu)勢(shì)，且烹煮便利，口感類同于大米飯，因而一上市即得到消費(fèi)者認(rèn)可。有專家預(yù)言:發(fā)芽糙米可能將成為21世紀(jì)人類的主食資源［12］。

日本學(xué)者茅原［13］認(rèn)為，發(fā)芽糙米中的GABA含量升高是因?yàn)?在發(fā)芽過程中谷氨酸脫羧酶被激活，導(dǎo)致糙米本身所含的谷氨酸以及蛋白酶水解蛋白質(zhì)生成的谷氨酸脫羧生成GABA。

愛巖［14］、三枝貴代［15］、衫下朋子［16］等通過對(duì)米胚芽GAD酶學(xué)性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，微酸環(huán)境利于GABA的產(chǎn)生 (最適pH為5.6)，堿性條件下GABA含量不增加;最適溫度為40℃，米胚GAD對(duì)谷氨酸 (Glu)的Km值為32.37 mmol/L，超過60℃，酶活性基本喪失。在最適條件下米胚芽浸泡4 h，可使GABA富集達(dá)400 mg/100 g，約提高10倍。另外，鈣離子可用來激活米胚GAD，從而提高GABA的產(chǎn)量。Panatda Jannoey［17］采用5個(gè)廣泛栽培的常規(guī)水稻品種 (PL2，CN1，KDML105，SP1，PT1)，以LC－MS法分析谷氨酸和GABA，研究了糙米發(fā)芽過程中GABA的動(dòng)態(tài)變化過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn):所有品種的谷氨酸含量存在顯著差異，糙米發(fā)芽后20～30 d，嫩葉里GABA含量急劇增加，認(rèn)為發(fā)芽20～30 d的嫩葉可作為制藥的原材料。

Komatsuzakia Noriko［18］認(rèn)為浸泡 3 h 加通氣處理21 h，35℃，相比只浸泡處理，GABA含量從10.1 mg/100 g增加到24.9 mg/100 g。通20 min蒸汽和用乙醇處理3 min，能完全消除發(fā)芽過程中滋生的微生物的影響，而對(duì)GABA的含量沒有任何影響。

Mithu Dasa等［19］認(rèn)為曲霉屬真菌和木霉屬菌能產(chǎn)生木聚糖酶和纖維素酶，用這兩種酶處理發(fā)芽糙米2 h，50℃，然后35℃浸泡24 h，GABA的含量升高到27 mg/100 g，而脂肪和纖維含量顯著降低。

Anuchita Moongngarm［20］對(duì)普通糙米和黑米的化學(xué)成分進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)兩種米發(fā)芽后GABA、甘氨酸、賴氨酸和亮氨酸含量均顯著增加。

2.2 國內(nèi)研究概況

2.2.1 加工研究

與日本等發(fā)達(dá)國家相比，我國在發(fā)芽糙米富含GABA水稻新品種選育，及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)方面落后很多，起步較晚。到目前為止，已有隆平糧社、麻陽鴻達(dá)實(shí)業(yè)有限公司、煙村公司等6家單位的發(fā)芽糙米產(chǎn)品相繼問世。

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李再貴與日本學(xué)者辰巳英三［21］，于2003年研究了發(fā)芽糙米的前處理脫脂技術(shù)及發(fā)芽過程中GABA含量的變化情況，認(rèn)為品種不同，GABA含量變化也不同。脫脂處理 (40℃，2 h)無論是對(duì)原料還是發(fā)芽糙米，都有利于提高GABA的含量。脫脂的發(fā)芽糙米GABA含量比沒有脫脂時(shí)提高80 mg/100 g，提高近三分之一。另外，對(duì)發(fā)芽條件 (溫度、pH值和時(shí)間)進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，認(rèn)為40～50℃處理4 h，pH5～6，能使米胚中的GABA得到有效地富集。還指出發(fā)芽糙米與普通大米按1∶5的比例混合煮飯，與普通米飯的口感幾乎沒有區(qū)別。

顧振新等［22］用赤霉素處理對(duì)糙米發(fā)芽力及其主要成分變化的影響進(jìn)行了研究，認(rèn)為GA3處理能顯著提高發(fā)芽糙米中淀粉降解量和還原糖、水溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸含量，其中以0.20 mg/L赤霉素處理的為最高。張緒璋等［23］也認(rèn)為生長素GA對(duì)富集GABA有一定的促進(jìn)作用，能使發(fā)芽糙米GABA含量提高4倍。

劉玲瓏［24］研究了GABA含量及其合成關(guān)鍵酶(谷氨酸脫羧酶)的變化動(dòng)態(tài)，認(rèn)為GABA主要集中在胚部，隨著浸水時(shí)間延長，GAD的活性呈逐漸增加趨勢(shì)。GAD活性變化與GABA的積累呈顯著正相關(guān)，表明浸水后種胚GABA的積累與GAD的催化反應(yīng)有關(guān)。張暉［25］得到米胚GAD的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH為5.6。米胚GAD的熱穩(wěn)定較差，75℃時(shí)酶基本完全失活。但米胚GAD在較寬的pH范圍內(nèi) (pH4.5～8.0)都較為穩(wěn)定，能保持88%以上的酶活。Ca2+濃度達(dá)到500 μmol/L時(shí)對(duì)米胚GAD的激活作用最強(qiáng)，可使酶的相對(duì)活性達(dá)到145%，Ca2+能提高酶與底物的親和力，對(duì)米胚GAD的活性有較強(qiáng)的激活作用。李冰冰等［26］比較了糙米與稻谷發(fā)芽期間及發(fā)芽結(jié)束后GAD活力、GABA和谷氨酸 (Glu)含量的變化。結(jié)果表明，糙米和稻谷在 (32±1)℃條件下以1.2 L/min通氣量，用含有0.1%L－谷氨酸和0.1%抗壞血酸的培養(yǎng)液浸漬發(fā)芽，生長速率和呼吸速率均以糙米為快。王玉萍等［27］則認(rèn)為發(fā)芽糙米以1.0 L/min通氣量為最佳。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，發(fā)芽糙米中GABA含量和Glu含量分別比發(fā)芽稻谷增加64.05%和14.68%，整個(gè)發(fā)芽期間糙米中GAD活力始終高于發(fā)芽稻谷。

張燕等［28］以“豫粳6號(hào)”粳米為材料，分別用蒸餾水、電生酸性水、電生堿性水、1%次氯酸鈉溶液殺菌劑進(jìn)行清洗或浸泡。結(jié)果表明，用殺菌劑清洗比浸泡時(shí)還原糖和GABA含量都要高，其中用電生酸性水清洗的發(fā)芽糙米還原糖和GABA含量最高并能明顯抑制糙米發(fā)芽過程中細(xì)菌的滋生。

江湖等［29，30］研究了亞硒酸鈉處理對(duì)糙米發(fā)芽GABA的影響，建立富硒發(fā)芽糙米發(fā)芽率與γ－氨基丁酸含量的數(shù)學(xué)模型，富硒發(fā)芽糙米的最佳工藝參數(shù)為:浸泡液中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度5 mg/L，浸泡時(shí)間9 h，浸泡溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間21 h，培養(yǎng)溫度31.5℃，發(fā)芽率77.67%。研究也認(rèn)為0.2%氯化鈣溶液處理有較好的富鈣能力。

馬濤等［31］對(duì)糙米發(fā)芽條件進(jìn)行優(yōu)化，認(rèn)為，糙米發(fā)芽最佳條件為:發(fā)芽溫度37.5℃，發(fā)芽時(shí)間28 h，氯化鈣溶液濃度0.5%。

鄧宇［32］研究了溫度、時(shí)間、pH值及不同營養(yǎng)液對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響，得出:30℃下浸泡10 h后發(fā)芽24 h，糙米GABA含量達(dá)51.5 mg/100 g。pH5.5的營養(yǎng)液，0.15 mmol/L Ca2+，2.0 mmol/L磷酸吡哆醛 (PLP)，2.00 mg/mL谷氨酸鈉，1.5 mmol/L VB6浸泡發(fā)芽糙米，均能有效調(diào)節(jié)糙米富集GABA。

2.2.2 品種研究

中國水稻研究所［33］應(yīng)用生物工程技術(shù)誘發(fā)水稻組織中L－谷氨酸脫羧酶變異，選育出L－谷氨酸脫羧酶活性高、能合成大量GABA的突變體，于2003年培育出一種富含GABA的巨胚水稻新品種，該品種GABA含量比一般品種高5～6倍。

姚森等［34］、張緒璋等［23］的試驗(yàn)結(jié)果表明，不同品種發(fā)芽糙米的GABA含量存在明顯差異。姚森還比較了不同品種發(fā)芽糙米GABA含量、GAD活性和谷氨酸轉(zhuǎn)化速率等，認(rèn)為早稻品種顯著高于中稻和晚稻，秈稻稍高于粳稻，可能是由GAD酶活性差異所致，差異最高87.88 mg/100 g，最低34.62 mg/100 g，平均含量56.84 mg/100 g。發(fā)芽糙米的GABA生成量與芽長、糙米原料中谷氨酸含量、GAD活性呈極顯著正相關(guān)，谷氨酸與蛋白質(zhì)含量也成極顯著正相關(guān)。孫向東等［35］和康彬彬［36］等的研究結(jié)果表明不同品種間的GABA含量差異在1倍以上，發(fā)芽糙米的GABA含量與糙米原料中谷氨酸含量呈極顯著正相關(guān)、谷氨酸含量與蛋白質(zhì)含量也是極顯著正相關(guān)。靳祥等［37］研究表明，粳稻回交后代GABA含量高于秈稻回交后代，有色米高于無色米，不同回交世代GABA含量差異較大，在水稻GABA高含量育種方面，對(duì)早世代材料選擇更易獲得高GABA材料。

3討論

3.1 關(guān)于GABA的含量檢測(cè)

由于GABA對(duì)電化學(xué)、紫外－可見光及熒光不靈敏，用直接法測(cè)定要求樣品前處理純凈，樣品單一，當(dāng)批量分析時(shí)只分析GABA一種氨基酸，可以采用改良的比色法。此時(shí)，需要注意添加試劑的順序不能顛倒，嚴(yán)格控制加熱顯色的溫度和時(shí)間，否則顯色效果不理想，影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。如果待測(cè)樣品數(shù)量少，精度要求較高時(shí)，可以選用氨基酸分析儀或液相色譜法。選前者，要配選合理的分離柱、流動(dòng)相及洗脫梯度，防止α氨基，α肽等物質(zhì)的干擾，以免使結(jié)果偏高。某些實(shí)驗(yàn)室不一定具有專門的氨基酸分析儀，可以用液相色譜，此法常采用柱前衍生，此時(shí)，選用合適的衍生劑是關(guān)鍵。OPA應(yīng)用最廣泛，但衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，信號(hào)衰減快，所以多用于全自動(dòng)的在線分析;Dansyl－Cl，Dabsyl－Cl，F(xiàn)MOC容易生成多級(jí)衍生產(chǎn)物，給后續(xù)分離帶來麻煩和壓力;FDNB在室溫下即熔融，不便于操作;而PITC毒性大，對(duì)柱子的壽命影響也大，且需專門的衍生裝置在無水狀態(tài)下衍生。近年來，新興的衍生劑有AQC和CDNB等，AQC衍生迅速、衍生物穩(wěn)定、紫外檢測(cè)靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，但衍生試劑昂貴;CDNB和FDNB一樣具有二硝基苯基團(tuán)，衍生原理和FDNB類似，相比FDNB價(jià)廉易得、理化性質(zhì)穩(wěn)定、衍生操作方便簡單。

3.2 關(guān)于發(fā)芽糙米的GABA研究

近十年以來，國內(nèi)學(xué)者對(duì)發(fā)芽糙米及相關(guān)制品的研究重點(diǎn)集中在糙米發(fā)芽技術(shù)和發(fā)芽工藝上，大多數(shù)研究者選用一個(gè)或幾個(gè)品種，研究糙米發(fā)芽的最佳技術(shù)參數(shù)和不同的品種間含量差異，得到的最佳參數(shù)也有所不同，缺少對(duì)不同水稻品系全面系統(tǒng)的研究。我國水稻品種類型繁多，今后應(yīng)對(duì)不同水稻品種發(fā)芽糙米中GABA含量差異形成的原因及基因型進(jìn)行分析，以篩選出高GABA含量及高GAD活性的品種，為農(nóng)產(chǎn)品深加工企業(yè)提供優(yōu)質(zhì)原材料。而目前對(duì)這方面的研究很少，可靠有用的科研成果不多。

高GABA含量是可以遺傳的性狀，因此要加工富含GABA的發(fā)芽糙米制品，首先要從品種選育著手，尤其是我國的雜交稻面積已占水稻總面積的60%，可以說南方秈稻區(qū)的大部分人每天都是以雜交稻米為主食，因此選育富含γ－氨基丁酸的發(fā)芽糙米專用雜交稻組合對(duì)于提高人民的生活水平、預(yù)防或治療相關(guān)疾病具有重大的社會(huì)效應(yīng)。并且隨著這種專用雜交稻組合的推廣，還可以帶動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對(duì)于增加農(nóng)民收入和解決城市人口的就業(yè)問題具有重要意義。

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