膠質(zhì)瘤源性Exosome的研究進展

王立威，孫玉學，張 博，黃海燕，吳宣萱＊

（1.長春市人民醫(yī)院 伽瑪?shù)吨行?，吉?長春130051；2.吉林大學白求恩第一醫(yī)院 神經(jīng)腫瘤外科，吉林 長春130021）

腦膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是最常見的顱內(nèi)腫瘤，有逐年增長的趨勢。膠質(zhì)母細胞瘤患者的平均存活期小于15個月［1］。數(shù)十年來，盡管手術治療、放射治療以及生物化學治療在臨床上普及應用，但是患者的生存期未見明顯延長［2］。1987年，Johnstone等首次用exosome來描述網(wǎng)織紅細胞分泌的這種囊性小泡，這種囊性小泡在網(wǎng)織紅細胞的最后階段把不必要的膜成分排除胞外［3］。后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn) B細胞［4］、T 細胞［5］、樹突狀細胞［6］、腫瘤細胞均可分泌exosome，腫瘤患者的血清、腹水、胸水等亦有exosome，特別是膠質(zhì)瘤細胞源性exosome含有 mRNA、miRNA［7］、線粒體DNA、熱休克蛋白（HSPs90，70，60和27）、EGFRvIII和 TGF－1［8］等生物大分子，具有重要的研究意義。腫瘤源性exosome含有這些特殊的分子物質(zhì)，對闡述線粒體疾病有一定的意義，可推動腫瘤的免疫治療。

1 Exosome概述

Exosome，又稱外切酶體、微粒體，起源于晚期核內(nèi)體，由30－100μm大小的小囊泡在多聚體內(nèi)（MVBs）聚集而成［9］。多數(shù)多聚體被溶酶體酶水解；一部分多聚體與細胞質(zhì)膜融合釋放小囊泡到細胞外，形成exosome。細胞通過釋放exosome來排出胞內(nèi)的毒性物質(zhì)，包括殘留的化學治療劑，病毒以及信使RNA和微小RNA［10］。Graner，M.W.等已經(jīng)證實人類與鼠的膠質(zhì)瘤細胞都可以分泌exosome［11］。在癌癥病人的惡性滲出液［12］、腹水［13］以及血清［14］中也存在 exosome。Michael W.Graner［8］等人通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤源性exosome是由50－100納米的囊性小泡組成的，含有熱休克蛋白。Michele Guescini等人研究證實了exosome還有線粒體DNA［15］。下面我們從三個方面來探討膠質(zhì)瘤源性的exosome的生物學性質(zhì)、相應的功能以及對基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學的實踐意義。

2 Exosome蛋白質(zhì)組學研究

蛋白質(zhì)組學，早在1995年由Marc Wilkins提出這一概念［16］。經(jīng)過十余年的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學已發(fā)展為通過雙向凝膠電泳、生物質(zhì)譜技術以及生物信息學等方法在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)特征（包括蛋白質(zhì)的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用）的一門學科，用于蛋白質(zhì)的鑒定，研究蛋白質(zhì)功能，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關于疾病發(fā)生、細胞代謝等過程的整體而全面的認識。

Hiratsuka等 利 用 2－DE 和 MALDI－TOF－MS技術，在膠質(zhì)瘤中鑒定出了11種上調(diào)的蛋白質(zhì)和一種下調(diào)的細胞骨架相關蛋白－SIRT2。Honda等應用非平衡PH梯度凝膠電泳分離多個膠質(zhì)瘤細胞系的水溶性蛋白質(zhì)，結果發(fā)現(xiàn)人和鼠的膠質(zhì)瘤細胞系蛋白圖譜存在顯著不同。Iwadate等應用2－DE和MALDI－TOF－MS技術對膠質(zhì)瘤標本進行分析，根據(jù)2－DE結果對膠質(zhì)瘤的蛋白表達譜進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)聚類分析的結果與病人生存率和生存時間有明顯的相關性，進行 MALDI－TOF－MS分析，鑒定了25種蛋白質(zhì)，分別屬于信號轉(zhuǎn)導蛋白、分子伴侶蛋白等。Michael W.Graner等人用二維聚丙烯凝膠電泳研究膠質(zhì)瘤源性exosome和SMA560vIII源性exosome所含蛋白質(zhì)［8］，根據(jù)其在電解槽中不同的移動速度分離出45種蛋白質(zhì)，包括HSC90、70、60、27，與免疫相關的抗PDI抗體、肌動蛋白、CD171、CD40、干擾素、白介素6、白介素1，與信號轉(zhuǎn)導相關的DNA／RNA蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、分子伴侶、蛋白酶或者蛋白酶抑制劑，特異的蛋白質(zhì)包括抑制蛋白2，3－DPGH、凋亡蛋白、CENP－P （#26）、唾液酸合酶、eIF3、PCNA、MT 磷酸酶、EF－1、蛋白酶體和ALIX（一種蛋白質(zhì)，exosome的標記蛋白）。研究結果顯示，其含的蛋白質(zhì)有的跟人類H2159MG exosome所含蛋白質(zhì)相同，一部分為其自身所特有。Johan Skog［17］等人通過研究發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤患者exosome中含有血管源性蛋白。

蛋白質(zhì)組學研究顯示了膠質(zhì)瘤源性exosome蛋白質(zhì)大多數(shù)是多功能蛋白質(zhì)，具有酸性等電點，是與酶及新陳代謝有關的物質(zhì)。這些蛋白質(zhì)大部分是低聚復合物，分別是大分子蛋白、TCP－1／HSP60、蛋白酶體、肌動蛋白、微管蛋白、40S的核糖體蛋白、延長因子、轉(zhuǎn)化因子、鐵蛋白以及糖酵解中的四種酶。NF－κB和ApoA－1的關系在脂質(zhì)的新陳代謝中起著重要作用［25］。ApoA－1通過exosome運送到各種細胞或者從細胞中釋放，都受控于NF－κB的狀態(tài)和細胞脂質(zhì)的生物化學性質(zhì)。烯醇酶和肌動蛋白是細胞表面血纖維蛋白溶原酶和血管生成抑制因子的受體。烯醇酶和生長因子的關系，說明生長因子可能與糖酵解相關的蛋白有相關性，生長因子對糖酵解有一定的影響。這些蛋白質(zhì)低聚復合物是由exosome體內(nèi)的蛋白質(zhì)聚集而成的。有文獻報道，很多病毒蛋白與exosome蛋白相似，很難區(qū)分病毒顆粒與exosome。有學者從膠質(zhì)瘤患者中發(fā)現(xiàn)了人巨細胞病毒，在外周血中發(fā)現(xiàn)了HCMV DNA［26］。有人推測來自膠質(zhì)瘤患者的HCMV DNA可能來自exosome，有待研究。

Michael W.Graner等［8］人用Ingenuity軟件分析了其蛋白質(zhì)路徑，最高的兩種被描述為“血液的、免疫的、呼吸系統(tǒng)的疾病”和“細胞間信號傳遞、癌癥、血液病學的發(fā)展”。結果證明，不同來源exosome蛋白質(zhì)之間有密切的關系，同時有很多信號蛋白存在于腫瘤細胞中，特別是腦腫瘤，并發(fā)現(xiàn)很多exosome蛋白與免疫有關，如CD40、干擾素、白介素6、白介素1。這些相關性凸顯了exosome存在著正常和病理兩種細胞狀態(tài)。

3 Exosome免疫學研究

通過對膠質(zhì)瘤源性exosome所含蛋白質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，其中很多蛋白質(zhì)是與免疫有關的蛋白質(zhì)，如HSP、EGFRvII、CD40、干擾素、白介素6和白介素1。

Exosome表面HSP有助于抗原提呈細胞或者自然殺傷細胞的免疫反應；另一方面，細胞表面HSP2724與腫瘤的浸潤性生長有關，所以關于exsome表面HSP的研究越來越受關注。HSP27存在于exosome的表面，exosome類似于細胞，細胞表面蛋白能變成exosome表面蛋白。如果exosome能隨血液或者腦脊液在體內(nèi)流動，那么Exosome表面的HSP27，同時也可作為腫瘤表面抗原，亦可作為腫瘤標記。從膠質(zhì)瘤患者血清中分離出exosome，證明了exosome含有EGFR和EGFRvIII、HSP／HSC70、TGF－＿1。EGFRvIII和 TGF－＿1用于區(qū)別是來自腫瘤源性的exosome還是來自病人的血清，亦可作為腫瘤標記。Exosome可以在尿液和羊水中提取，可以用exosome含有的核酸作標記。

從病人和正常人血清中分離出的exosome含有EGFR，而從膠質(zhì)瘤患者exosome中可發(fā)現(xiàn)EGFRvIII，在正常人血清中是不存在的。正常人的exosome含有HSP／HSC70和EGFR，不含EGFRvIII和TGF－＿1。TGF是一免疫調(diào)節(jié)因子。EGFRvIII這種變異的受體容易被激活而導致癌癥的發(fā)生，同時可作為腫瘤抗原，引起相關免疫反應［18］。EGFR－vIII和TGF－＿1是膠質(zhì)瘤所特有的，可作為生物標記，同時它們具有免疫特性，包括抗原性和抑制免疫。EGFRvIII抗原有利于分析膠質(zhì)瘤產(chǎn)生exosome的過程，也可使我們在體外建立膠質(zhì)瘤產(chǎn)生exosome的模型。EGFRvIII可以根據(jù)相關信號的激活路徑轉(zhuǎn)移到不含EGFRvIII的超微小泡中去。

很多報道稱腫瘤源性的exosome具有免疫抑制力［19］，TGF在免疫抑制中起重要作用，免疫抑制的靶細胞包括自然殺傷細胞［20］，效應 T 細胞［21］，抗原提呈細胞［22］。高度惡性膠質(zhì)瘤患者的免疫系統(tǒng)是受到抑制的，推測exosome可能跟免疫抑制有關。免疫抑制和免疫促進的平衡點取決于exosome，免疫反應是由內(nèi)在和外在的因素共同決定的。Exosome的抗原和免疫刺激是很重要的，但更重要的是免疫調(diào)節(jié)功能，比如FAS配體、脂肪、病毒，甚至TGF調(diào)節(jié)因子。Michael W.Graner等［8］人通過對鼠的研究發(fā)現(xiàn)，exosome實際上能產(chǎn)生免疫刺激，包括T細胞和抗體的產(chǎn)生，但不能延長鼠的存活期?；铙w中的exosome能產(chǎn)生抗體。但是，如果很難接近腫瘤組織，或者有一種類似腫瘤的組織來結合抗體，這樣就不能起到抗腫瘤的作用。因此，在這種情況下，exosome產(chǎn)生的免疫反應不足以抑制腫瘤的發(fā)生。也有報道稱exosome能引起保護性抗體反應，抑制腫瘤表達SARS病毒蛋白，這些exosome都來自在經(jīng)抗病毒免疫的人類細胞株［23］?？贵w的產(chǎn)生以及細胞毒性T細胞的減少有益于腫瘤的治療。膠質(zhì)瘤源性exosome具有抗炎的作用和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，能減少腫瘤免疫反應，能夠給我們提供新的治療方法治療嚴重的疾患。

4 Exosome分子生物學研究

Exosome，亦稱外切體，是因為在酵母中的exosome具有一個具有3’，5’－外切核酸酶活性的復合物，參與了多條RNA的代謝途徑，包括mRNA和pre－mRNA的周轉(zhuǎn)，5.8sRNA的加工，多種snRNA及snoRNA的加工等［28］，在膠質(zhì)瘤exosome中尚未發(fā)現(xiàn)。Johan Skog等［17］人研究證實了惡性膠質(zhì)瘤患exosome含有 mRNA，miRNA。Michael W.Graner等［11］人在膠質(zhì)瘤細胞分泌的exosome中發(fā)現(xiàn)了與RNA轉(zhuǎn)錄有關的起始因子和延長因子eIF3，EF－1。Michele Guescini等人［27］通過PCR技術發(fā)現(xiàn)了exosome中含有線粒體DNA，這些與基因有關的分子的發(fā)現(xiàn)將會開啟膠質(zhì)瘤新的研究方向。

在膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)對基因研究有重要意義，mRNA和miRNA可作為基因探針或腫瘤標記，有助于膠質(zhì)瘤的診斷。Exosome中的線粒體DNA有望成為基因克隆的載體，制備腫瘤疫苗，有待于進一步研究。Exosome中是否含有線粒體蛋白質(zhì)尚不清楚，但Staubach［29］已在乳腺癌exosome中發(fā)現(xiàn)了線粒體蛋白質(zhì)。

4 展望

自從發(fā)現(xiàn)exosome以來，人們對它的研究從未間斷，希望通過對膠質(zhì)瘤源性exosome的研究為膠質(zhì)瘤治療提供新的方法。目前，樹突狀細胞性exosome作為細胞疫苗已進入第一臨床階段實驗。膠質(zhì)瘤源性的exosome，是一種亞細胞成分，富含HSP、EGFRvII等多種生物活性分子，在適當?shù)臈l件下可持續(xù)發(fā)揮長期穩(wěn)定的免疫調(diào)節(jié)作用，由于其體積小，易保存，穩(wěn)定高效，且為非細胞性物質(zhì)，集中了DC疫苗和非細胞載體的優(yōu)勢，因而有望取代DC成為一種新的免疫治療手段，在非細胞性疫苗生物治療方面前景廣闊。Exosome富含各種信號轉(zhuǎn)導分子，可以將相應的信號從胞內(nèi)帶到胞外，引起細胞周圍各種信息的交換。在基礎研究中，發(fā)現(xiàn)exosome含有線粒體及與真核生物有關的轉(zhuǎn)錄因子，在解釋線粒體疾病、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及克隆方面起到一定的作用。

［1］Stupp R，Mason WP，van den Bent MJ，et al.Eisenhauer，E.，and Mirimanoff，R.O.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma［J］.N Engl J Med，2005，352：987.

［2］Ohgaki H，and Kleihues P.Population－based studies on incidence，survival rates，and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2005，64：479.

［3］Johnstone RM，Adam M，Hammond JR，et al.Vesicle formationg during reticulocyte maturation：association of plasma membraneactivities with released vesicles（exosome）［J］.J Biol Chem，1987，262（19）：9412.

［4］Raposo G，Nijman HW，Stoorvogel W，et al.B lymphocytes secrete antigen－presenting vesicles［J］.J Exp Med，1996，183（3）：1161.

［5］Blanchard N，Lankar D，F(xiàn)aure F，et al.TCR activation of human T cells induces the production of exosomes bearing the TCR／CD3／zeta complex［J］.J Immunol，2002，168（7）：3235.

［6］Zitvogel L，Regnault A，Lozier A，er al.Eradication of established murine tumors using a novel cell free vaccine：dendritic cell derived exosomes［J］.Nat med，1998，4（5）：594.

［7］Johan S，Tom W，Sjoerd van R.Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic Biomarkers［J］.nature cell biology，2008，10（12）：1470.

［8］Michael W.Graner，OscarAlzate，Angelika.echkovskaia，etl.Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes［J］.The FASEB，2009，23：1541.

［9］Keller，S.，Sanderson，M.P.，Stoeck，A.，and Altevogt，P.）Exosomes：from biogenesis and secretion to biological function［J］.Immunol Lett，2006，107：102.

［10］Calzolari A，Raggi C，Deaglio S，et al.TfR2localizes in lipid raft domains and is released in exosomes to activate signal transduction along the MAPK pathway［J］.J Cell Sci，2006，119：4486.

［11］Graner MW，Cumming RI，and Bigner DD.The heat shock response and chaperones／heat shock proteins in brain tumors：surface expression，release，and possible immune consequences［J］.J Neurosci.，2007，27：11214.

［12］Andre F，Schartz NE，Movassagh M，et al.Malignant effusions and immunogenic tumour－derived exosomes［J］.Lancet，2002，360：295.

［13］Taylor D D，and Gercel－Taylor C.Tumour－derived exosomes and their role in cancer－associated T－cell signaling defects［J］.Br J ancer，2005，92：305.

［14］Kim JW，Wieckowski E，Taylor D D，et al.Fas ligand－positive membranous vesicles isolated from sera of patients with oral cancer induce apoptosis of activated T lymphocytes［J］.Clin Cancer Res，2005，11，1010.

［15］Michele G，Susanna G，Vilberto S.Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA［J］.J Neural Transm ，2010，117：1.

［16］Wasinger V C，Cordwell SJ，Cerpapoljak A，et al.Progress with gene－product mapping of the mollicutes mycoplasma hgenitalium［J］.Electrophoresis.1995，16（7）：1090.

［17］Johan Skog，Tom Würdinger1，Sjoerd van Rijn，et al.Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers［J］.nature cell biology，2008，10（12）：1470.

［18］Kuan CT，Wikstrand CJ，and Bigner DD.EGFRvIII as a promising target for antibody－based brain tumor therapy［J］.Brain Tumor Pathol，2000，17：71.

［19］Valenti R，HuberV，Iero M，et al.Tumor－released microvesicles as vehicles of immunosuppression［J］.Cancer Res，2007，67：2912.

［20］Clayton A，Mitchell JP，Court J，et al.Human tumor－derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin－2［J］.Cancer Res，2007，67：7458.

［21］Abusamra AJ，Zhong Z，Zheng X，et al.Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8＿T－cell apoptosis［J］.Blood Cells Mol Dis，2005，35：169.

［22］Yu S，Liu C，Su K，et al.Tumor exosomes inhibit differentiation of bone marrow dendritic cells［J］.J.Immunol，2007，178：6867.

［23］Kuate S，Cinatl J，Doerr HW，et al.Exosomal vaccines containing the S protein of the SARS coronavirus induce high levels of neutralizing antibodies［J］.Virology，2007，362：26.

［24］Bausero MA，Page DT，Osinaga E，et al.Surface expression of Hsp25and Hsp72differentially regulates tumor growth and metastasis［J］.Tumour Biol，2004，25，243.

［25］Gerbod－Giannone MC，Li Y，Holleboom A，et al.TNF induces ABCA1through NF－＿B in macrophages and in phagocytes ingesting apoptotic cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103：3112.

［26］Mitchell DA，Xie W，Schmittling R，et alSensitive detection of human cytomegalovirus in tumors and peripheral blood of patients diagnosed with glioblastoma［J］.Neuro－oncol，2007，10：10.

［27］Michele Guescini，Susanna Genedani，Vilberto Stocchi，et al.Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA［J］.J Neural Transm，2010：117：1.

［28］Allmang C，Petfalski E，Podteljnikov A，et al.The yeast exosome and human PM－Scl are related complexes ［J］.Genetics ＆ Development，1999，13（16）：2148.

［29］Staubach S，Razawi H，Hanisch FG，Proteomics of MUC1－containing lipid rafts from plasma membranes and exosomes of human breast carcinoma cells MCF－7［J］.Proteomics，2009，9：2820.