MODS技術(shù)的研究和應用進展

黃自坤，李俊明

（南昌大學第一附屬醫(yī)院 檢驗科，江西 南昌330006）

早期發(fā)現(xiàn)和診斷結(jié)核病（Tuberculosis，TB）病人、及時選用敏感藥物給予有效治療，是減少TB傳播機會、控制TB疫情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，病原學診斷仍是TB診斷的金標準，也是判斷疾病活動性、傳染性和療效考核的主要指標。傳統(tǒng)的TB病原學檢查主要是涂片抗酸染色檢查和羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法（L－J法）?？顾崛旧膬?yōu)點是操作簡單，快速，但敏感性差，陽性率僅為30－40%。L－J法敏感性較好，但由于結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）生長緩慢，檢測時間要求很長（一般為4周），加上藥敏分析的時間，報告周期一般需要2個月左右，很難滿足臨床需要［1］。

MTB全自動培養(yǎng)系統(tǒng)的出現(xiàn)是TB診斷的一個巨大進步，不僅使得MTB培養(yǎng)的敏感性獲得了很大的提高，培養(yǎng)的時間也明顯縮短［2］。但該方法只在一些發(fā)達國家得到了一定的應用，而全球TB患者絕大部分分布在經(jīng)濟相對落后的發(fā)展中國家。因此，研發(fā)快速、可靠、適于在發(fā)展中國家推廣的TB診斷和藥敏檢測技術(shù)仍是包括我國在內(nèi)的廣大發(fā)展中國家急待解決的主要問題之一。

顯微鏡觀察藥敏檢測技術(shù)（microscopic observation drug－susceptibility assay，MODS）是近年來建立的一種結(jié)核病病原學檢測新技術(shù)，與傳統(tǒng)病原學檢測方法相比，具有敏感性好、檢出時間短、可同時進行藥敏分析、無需昂貴的特殊設(shè)備和檢測成本低等優(yōu)點，被認為是一種適于在發(fā)展中國家推廣使用的TB診斷和藥物敏感性檢測方法，受到越來越多的關(guān)注。近年，MODS技術(shù)的研究和應用取得了很大的進展，本文就MODS技術(shù)的研究和應用進展，以及目前面臨的挑戰(zhàn)作一綜述。

1 MODS技術(shù)的原理及主要特點

MODS技術(shù)的主要原理是利用MTB在適宜的液體培養(yǎng)基中的生長速度較在固體培養(yǎng)基上快，且會形成特征性的索狀結(jié)構(gòu)的特性，利用液體培養(yǎng)基對痰、胸水或腦脊液等標本進行直接培養(yǎng)，并在一定時間內(nèi)在顯微鏡下觀察是否形成特征性索狀結(jié)構(gòu)，以判斷標本中是否存在MTB的方法。MODS技術(shù)一般采用24孔細胞培養(yǎng)板進行MTB的培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定時間后定期在倒置顯微鏡下觀察MTB生長形成的特征性索狀結(jié)構(gòu)。若在培養(yǎng)時設(shè)置加有一定濃度抗結(jié)核藥物的培養(yǎng)孔，對比含和不含藥物的培養(yǎng)孔內(nèi)MTB的生長情況，即可對待檢MTB的藥物敏感性進行評價［3］。

目前，MODS技術(shù)一般采用含10%OADC添加劑的M7H9液體培養(yǎng)基進行MTB培養(yǎng)，陽性標本一般可在7天左右觀察到特征性的索狀結(jié)構(gòu)。同時，由于MODS技術(shù)可直接對臨床標本進行培養(yǎng)以獲得其中MTB的藥物敏感性信息，而不像傳統(tǒng)的藥敏檢測方法那樣需要利用MTB純培養(yǎng)物進行分析，因此與傳統(tǒng)病原學診斷方法相比，其檢測時間大大縮短。此外，MODS技術(shù)還具有遠高于傳統(tǒng)病原學診斷方法的敏感性，以及遠低于MTB全自動培養(yǎng)方法的成本的特點。因此這一技術(shù)的實施和推廣將對目前結(jié)核病的診斷和藥敏檢測產(chǎn)生巨大的推動作用。

2 MODS技術(shù)在結(jié)核病診斷中的研究和應用

2.1 MODS技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的研究和應用

MODS技術(shù)由Caviedes等［3］在2000年首先報道。在該項研究中，Caviedes等系統(tǒng)比較了金胺O染色法、L－J法、7H11培養(yǎng)基培養(yǎng)法、分枝桿菌自動化培養(yǎng)系統(tǒng)、MODS技術(shù)和PCR技術(shù)對臨床疑似結(jié)核病患者的痰標本的檢測參數(shù)，結(jié)果顯示，MODS技術(shù)的敏感性達到92%，顯著高于金胺O染色法和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法（L－J法和7H11培養(yǎng)基培養(yǎng)法），與分枝桿菌自動化培養(yǎng)系統(tǒng)和PCR技術(shù)無顯著性差異。同時，在所有的病原學檢測方法中，MODS技術(shù)的檢出時間最短（9天），且檢測成本僅為分枝桿菌自動化培養(yǎng)系統(tǒng)檢測成本的約十分之一。因此這一研究充分展示了MODS技術(shù)在結(jié)核病快速診斷中的價值。

隨后，Moore等［4］開展的一系列大樣本多中心的研究結(jié)果顯示，MODS技術(shù)診斷結(jié)核病的陽性預測值和陰性預測值分別為97.0%和99.7%，而平均檢出時間僅為6－8天，明顯短于分枝桿菌自動化培養(yǎng)系統(tǒng)的10－16天和L－J法的21－33天，進一步肯定了MODS技術(shù)在結(jié)核病診斷中的重要價值。最近，不同學者分別在巴西、洪都拉斯、埃塞俄比亞、印度和厄瓜多爾等國家進行了MODS技術(shù)的應用研究，這些研究雖然在數(shù)據(jù)上有一些小的差異，但研究結(jié)果均支持MODS技術(shù)是一種敏感、可靠、快速和相對廉價的結(jié)核病病原學診斷技術(shù)，尤其適應于在經(jīng)濟相對落后的發(fā)展中國家推廣應用［5－8］。

值得一提的是，Reddy和 Ha等［9，10］的研究顯示，對于HIV感染合并結(jié)核病的這一類特殊人群的診斷，MODS技術(shù)同樣具有很高的檢測敏感性和特異性，同時能夠滿足快速診斷的要求。這些研究提示MODS技術(shù)可以作為一種在HIV感染者中診斷或排除肺結(jié)核有效的篩選方法，對于在HIV感染者中進行結(jié)核病預防性治療措施的實施有重要的推動作用。

在國內(nèi)，近期也有學者開展了一些MODS技術(shù)研究的有益探索，并取得了一些有價值的成果，但遺憾的是我國學者目前開展的研究多數(shù)是在實驗室以分枝桿菌標準株進行的研究，尚未見有直接采用臨床標本進行檢測的研究報道［11－13］。

2.2 MODS技術(shù)在兒童結(jié)核病診斷中的研究和應用

由于痰標本留取困難等原因，兒童肺結(jié)核的病原學檢測往往檢出率很低，加之兒童結(jié)核病往往癥狀不典型，很容易造成漏診和誤診。為提高兒童肺結(jié)核的診斷率，很多學者嘗試采用其它的標本進行病原學檢測，如鼻咽抽吸物、胃抽吸物和糞便等，但這些標本成份較痰標本更為復雜，且MTB所處的環(huán)境與痰中也有很大的區(qū)別。為驗證MODS技術(shù)在這些標本中的診斷效能，探討其在兒童結(jié)核病中的應用價值，Oberhelman等［14］分別采用抗酸染色法、MODS技術(shù)和L－J法對165例患兒留取的胃抽吸物、鼻咽抽吸物和糞便標本進行檢測，結(jié)果表明，MODS技術(shù)的平均檢出時間為10天，檢測敏感性為86.8%，遠高于L－J法的55.3%和抗酸染色法的39.5%。尤其值得一提的是，在抗酸染色陰性的患兒標本中，MODS技術(shù)的檢測敏感性依然達到了82.6%。因此，該研究提示MODS技術(shù)同樣適用于胃抽吸物、鼻咽抽吸物和糞便等標本的快速、高效檢測。

最近，Ha、Oberhelman等［15，16］的一系列研究進一步肯定了MODS技術(shù)在兒童結(jié)核病診斷中的巨大優(yōu)勢，證實MODS技術(shù)可大大提高對兒童結(jié)核病的診斷效率。但另一方面，Graham等［17］的研究同時發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核病高危組中，一些兒童雖然有明顯的肺結(jié)核臨床癥狀，但MODS檢測結(jié)果卻為陰性，且具體原因還不清楚，仍需進一步深入探討。

2.3 MODS技術(shù)在肺外結(jié)核診斷中的研究和應用

肺外結(jié)核往往缺乏特異性的全身癥狀和影像學變化，局部癥狀也往往被其他癥狀掩蓋，因此臨床診斷較為困難，實驗室診斷顯得尤為重要。但常規(guī)方法如涂片鏡檢和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)法等在肺外結(jié)核的診斷方面效果并不理想，因此尋找一種更為敏感和特異的肺外結(jié)核檢測方法一直是臨床醫(yī)生和實驗室研究人員的努力方向。Caws等［18］最先探討了MODS技術(shù)在結(jié)核性腦膜炎中的診斷價值。在該研究中Caws等對230份臨床疑似結(jié)核病腦膜炎患者的腦脊液標本進行了檢測，結(jié)果顯示MODS檢測的敏感性為64.9%，顯著高于抗酸染色法的52.6%，與分枝桿菌全自動培養(yǎng)系統(tǒng)和L－J法（均為70.2%）比較略低，但統(tǒng)計學分析顯示差異并無顯著性。Caws認為，該研究中MODS法敏感性稍差的主要原因可能在于檢測過程中標本使用量上的差異。在MODS檢測中，由于細胞培養(yǎng)板容量的限制，每檢測孔的標本量只有100μl，而分枝桿菌全自動培養(yǎng)系統(tǒng)和L－J法接種的標本均為250μl，而病原學檢測的敏感性與標本量的多少是直接相關(guān)的，若使用較大容量的培養(yǎng)板，其陽性率可能會進一步提高。此外，本研究的另一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，與檢測痰標本的檢出時間相比，MODS檢測腦脊液的平均檢出時間更短，只需6天，這可能由于腦脊液標本無需進行前處理即可直接進行培養(yǎng)，而痰標本在培養(yǎng)前需經(jīng)氫氧化鈉和乙酰半胱氨酸進行預處理，而這種預處理可能對MTB的生長具有抑制作用。因此，這一研究提示MODS在結(jié)核性腦膜炎診斷中不僅具有有敏感、快速的特點，還具有操作簡便和費用低廉的優(yōu)點，對結(jié)核性腦膜炎的早期診斷具有重要價值。

此后，Tovar等［19］探討了MODS技術(shù)在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價值。研究發(fā)現(xiàn)，在對胸膜活檢組織的檢測中，MODS的敏感性達到81%，遠高于L－J法的51%。雖然在胸水中的檢測敏感性只有20%－40%（視標本的處理與否不同），但也遠高于L－J法的6%－7%。同時，與在其他標本中一樣，MODS的平均檢出時間與L－J法相比有很大的縮短，顯示MODS技術(shù)對結(jié)核性胸膜炎的診斷也具有很好的應用和推廣價值。

3 MODS技術(shù)在MTB藥敏檢測中的研究和應用

耐藥MTB的產(chǎn)生和流行是結(jié)核病化療的巨大障礙。研究證實，由于經(jīng)驗性治療的不合理用藥是耐藥性MTB產(chǎn)生的重要原因之一，反過來，隨著耐藥率的不斷升高，經(jīng)驗性用藥的弊端更加明顯［20］。由于目前 WHO推薦的MABA法（microplate alamar blue assay）進行MTB的藥敏分析需要采用MTB純培養(yǎng)物進行檢測，所需時間很長，臨床往往無法等待藥敏檢測報告再作治療，因此這一矛盾在廣大的發(fā)展中國家仍難以克服，這也是目前耐藥性結(jié)核病逐年升高的主要原因之一。MODS技術(shù)由于可采用臨床原始標本直接進行藥物敏感性分析，且培養(yǎng)時間較短，在MTB的藥敏檢測中表現(xiàn)出良好的應用潛力。

Caviedes等最先評價了MODS技術(shù)在檢測MTB對利福平（RIF）和異煙肼（INH）耐藥性中的價值［3］。研究顯示，視采用的藥物濃度不同，MODS技術(shù)對RIF和INH的藥敏檢測結(jié)果與金標準MABA的符合性為89%－100%，表現(xiàn)出極佳的可靠性，更為重要的是，藥敏檢測時間由MABA的3周（尚未計算得到純培養(yǎng)物的標本培養(yǎng)時間）縮短至9.5天，大大縮短了藥敏檢測的時間，對臨床合理選用治療藥物具有重要的意義。隨后，Moore和Mello等［4，21］的研究均證實，MODS技術(shù)檢測 MTB對RIF和INH敏感性的結(jié)果與金標準方法的符合率均在90%以上，得到藥敏結(jié)果的中位時間由68天縮減到7天。這一系列的研究均提示MODS技術(shù)在分析MTB對RIF和INH的敏感性方面具有極佳的可靠性和推廣應用價值。但在對另幾種抗結(jié)核一線藥物如乙胺丁醇（EMB）和鏈霉素（SM）的藥敏檢測中，不同的實驗室得出的結(jié)論卻存在較大差異，Moore等［4］的研究顯示 MODS技術(shù)對EMB和SM的藥敏檢測結(jié)果與金標準方法的符合率均大于90%，但Caviedes等［3］的研究卻顯示只有51%－77%。這可能與不同研究小組采用的藥物來源和濃度不同，以及MTB在不同地區(qū)的耐藥譜存在差異有關(guān)。但大多數(shù)的研究均提示MODS技術(shù)對臨床常用的抗結(jié)核藥物的藥敏分析結(jié)果具有很高的可靠性［22－27］。Minion等［28］最近進行的一項薈萃分析也支持這一觀點。

4 MODS技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)及展望

綜上所述，MODS技術(shù)與現(xiàn)有的結(jié)核病病原學診斷方法相比，具有不可比擬的優(yōu)點，適合于在發(fā)展中國家大力推廣。但作為一種新興技術(shù)，MODS技術(shù)同樣存在一些不足，在推廣應用之前尚面臨一系列的挑戰(zhàn)。其中，首當其沖的是如何實現(xiàn)MODS技術(shù)的標準化。目前，雖然已有大量的相關(guān)研究報道，但不同研究小組對標本去污劑的選擇及去污處理方法、標本的最終接種量、藥敏檢測過程中的藥物濃度選擇等很多方面均缺乏統(tǒng)一，研究過程中采用的參照方法也各不相同，而這些差異都會直接影響到檢測結(jié)果。因此，建立一個統(tǒng)一的標準對更為客觀地評價MODS技術(shù)的效果，增強不同實驗室之間的結(jié)果可比性方面具有重要意義。其次，MODS技術(shù)與分枝桿菌全自動培養(yǎng)系統(tǒng)一樣，難以對培養(yǎng)出的細菌進行進一步的分類鑒定。再次，由于在檢測過程中需頻繁地取出培養(yǎng)板觀察，MODS技術(shù)的操作安全性也不容忽視。

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