硫氧還蛋白對(duì)缺血再灌注保護(hù)機(jī)制研究進(jìn)展1）

王洪志，武小薇，張一娜

急性心肌梗死作為我國(guó)發(fā)病率、致殘率和死亡率三高的疾病，已經(jīng)成為人類健康的主要?dú)⑹?。心肌遭受缺血損傷后使用抗凝藥物、溶栓藥物和早期冠脈介入治療恢復(fù)血流灌注，反而加重心肌損傷，稱之為心肌缺血再灌注損傷。1960年，Jennings等［1］首次在犬科動(dòng)物上發(fā)現(xiàn)缺血后再灌注組織損傷加大；1985年，Braunwald和Kloner［2］明確提出了“心肌缺血再灌注損傷”的概念。缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，涉及能量代謝、多種生物活性分子及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如再灌注誘發(fā)的大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）開放，炎癥和細(xì)胞凋亡等，均參與了心肌缺血再灌注損傷，最終加重心肌損傷甚至危及生命［3］。隨著對(duì)缺血再灌注損傷機(jī)制研究的深入，防治策略的研究也有了長(zhǎng)足的發(fā)展。近年來人們發(fā)現(xiàn)一種重要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白——硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）在缺血再灌注損傷中扮演重要角色。本文就該領(lǐng)域的研究進(jìn)展做一綜述。

1 Trx構(gòu)成

1964年，Peter Reichard等在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白，揭開了人們對(duì)Trx系統(tǒng)研究的序幕。Trx系統(tǒng)由Trx、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）和還原型輔酶Ⅱ（NADPH）組成，廣泛存在于原核和真核細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括心肌細(xì)胞也不例外。Trx有五個(gè)可修飾的半胱氨酸（封閉圈）。其中的兩個(gè)，即Cys-32和Cys-35，在催化部位參與Trx酶的活性［4］。含二硫鍵的Trx通常被稱為氧化型Trx（Trx-S2），含巰基的Trx則為還原型 Trx［Trx-（SH）2］，Trx系統(tǒng)的作用主要通過后者來實(shí)現(xiàn)，而Trx還原需要通過TrxR來完成［5］。Trx還原作用的機(jī)制就在于其與底物X-S2結(jié)合后還原蛋白底物。哺乳動(dòng)物的心肌中包含兩個(gè)不同的Trx，細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的為Trx1，線粒體定位的為Trx2。它們的區(qū)別在于半胱氨酸含量：線粒體Trx有兩個(gè)像細(xì)菌蛋白的半胱氨酸殘基，而胞質(zhì)Trx擁有6個(gè)半胱氨酸殘基［6］。

2 Trx的生物活性

2003年，Yamawaki等證實(shí)Trx系統(tǒng)在多種條件下保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，在維持生理以及心血管功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Trx系統(tǒng)，作為一個(gè)無處不在的巰基氧化還原酶系統(tǒng)，可以通過清除過量氧自由基調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡、修復(fù)過氧化的巰基蛋白、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等方面起著保護(hù)心肌的重要作用［7］。

Trx是由應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生，這些應(yīng)激包括紫外線輻射，X射線照射，氧化應(yīng)激和病毒感染誘導(dǎo)，也可以在缺血的組織由再灌注或缺血性預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)。相比之下，Trx1活性對(duì)病變組織細(xì)胞凋亡顯著減少起主要作用。研究表明，Trx在三個(gè)方面起作用：調(diào)節(jié)氧化還原平衡；與各種蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮抗凋亡促生長(zhǎng)作用，通過蛋白間的互動(dòng)，Trx改變酶的活性或接觸蛋白的亞細(xì)胞定位，從而影響各種細(xì)胞功能［4］；調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。Trx1在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，還有細(xì)胞外都起著重要作用。Trx2主要在線粒體內(nèi)發(fā)揮作用。

2.1 細(xì)胞質(zhì)

2.1.1 清除活性氧 氧化應(yīng)激對(duì)缺血再灌注損傷的作用已經(jīng)得到了共識(shí)，能夠?qū)е录?xì)胞功能受損，脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)降解，甚至使核酸斷裂［8］。心臟是一個(gè)耗氧器官，富含線粒體。氧化應(yīng)激時(shí)，線粒體產(chǎn)生ROS，線粒體對(duì)ROS是脆弱的，高ROS的進(jìn)一步損害線粒體，通過ROS誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，從而形成ROS和線粒體功能障礙的惡性循環(huán)。ROS也通過抑制離子通道的活性降低心臟泵血功能［4］。ROS在缺血再灌注心肌細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)影響到幾乎所有細(xì)胞的調(diào)控水平。

研究顯示，ROS對(duì)細(xì)胞不僅僅是破壞性因素，也履行第二信使的功能，能夠刺激細(xì)胞內(nèi)的氧化還原緩沖系統(tǒng)啟動(dòng)。心肌細(xì)胞死亡或者生存的關(guān)鍵取決于其氧化還原狀態(tài)，即活性氧與抗氧化劑之間是否失衡［9，10］。在細(xì)胞質(zhì)中，Trx1通過二硫鍵-巰基的交換反應(yīng)發(fā)揮還原作用，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。Trx1作為還原劑可直接清除ROS，降低氧自由基的破壞，從而降低DNA損傷以及蛋白質(zhì)的氧化失活、脂質(zhì)過氧化［11］。

2.1.2 ASK1 Trx1可以通過抑制凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）發(fā)揮抗凋亡功能。ASK1是細(xì)胞內(nèi)的一種重要的促凋亡蛋白，它能通過 MKK3／6和MKK7激活下游兩個(gè)凋亡激酶：P38MAPK和c-Jun氨基末端激酶（JNK），在細(xì)胞因子及應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡過程中起著關(guān)鍵作用［12］。ASK1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由線粒體途徑介導(dǎo)的，它可能參與對(duì)bcl-2家族蛋白的修飾。Trx1可抑制ASK1的活性，上調(diào)Bcl-2／bax的比值減少細(xì)胞凋亡，從而起到對(duì)缺血再灌注損傷保護(hù)的作用［13］。在生理?xiàng)l件下，ASK1的活性由幾個(gè)細(xì)胞因子抑制：包括 Trx、glutaredoxin和磷酸絲氨酸結(jié)合蛋白［14］。1998年，Saitoh等［15］首次報(bào)道了關(guān)于Trx1抑制ASK1活性的功能。在生理?xiàng)l件，胞漿中的還原型Trx1同ASK1的N-末端緊密結(jié)合，使ASK1處于抑制狀態(tài)，不激活凋亡程序。體外研究表明Trx1還可以促進(jìn)泛素化和降解ASK-1［14］。當(dāng)細(xì)胞受到氧化刺激時(shí)，Trx1由于氧化而與ASK1分離，使ASK1恢復(fù)活性，從而引發(fā)下游凋亡事件。再灌注中，活性氧可以進(jìn)一步氧化產(chǎn)生大量毒性更強(qiáng)的過氧化亞硝酸自由基（ONOO-），而ONOO-可以引起Trx1第49位酪氨酸的硝基化。當(dāng)Trx1發(fā)生硝基化后，不可逆地失去與ASK1結(jié)合的能力，ASKl與之分離而活化［11］。

后來發(fā)現(xiàn)線粒體Trx2以同樣的方式抑制ASK1抗細(xì)胞凋亡。Trx1和Trx2共同調(diào)節(jié)ASK1的凋亡活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)ASK1誘導(dǎo)的非JNK依賴的凋亡通路。Trx1和Trx2在不同的部位調(diào)節(jié)ASK1，Trx1與位于細(xì)胞漿的ASK1結(jié)合，而Trx2與位于線粒體ASK1結(jié)合。Trx1還與內(nèi)皮細(xì)胞中ASK1結(jié)合調(diào)節(jié) ASK1誘導(dǎo)JNK 的激活和凋亡［4，16］。

2.1.3 AKT Trx1已被證明與一種蛋白磷酸酶Phosphatase and Tensin homolog（PTEN）相互作用，激活PI3K和Akt發(fā)揮抗凋亡功能。PTEN是PI3K-Akt信號(hào)通路的重要抑制因子，在C2脂質(zhì)結(jié)合域有一個(gè)關(guān)鍵的半胱氨酸殘基，Trx1催化部位的Cys-32與之相互作用形成二硫鍵。這種相互作用導(dǎo)致催化部位的空間位阻PTEN基因［4］。因此，Trx1-PTEN基因的相互作用，使PTEN磷酸酶活性衰減，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K-Akt信號(hào)通路活化，活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase-9、核因子κB（NF-κB）、糖原合成酶激酶-3（GSK-3）、環(huán)磷腺苷（cAMP）反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用［6］。

2.2 細(xì)胞核 Trx1發(fā)揮抗凋亡功能，僅僅在細(xì)胞液內(nèi)修飾蛋白是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，它還在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，redox factor 1（REF-1）及其下游因子是Trx1作用的重要靶點(diǎn)。氧化還原因子-1（REF-1）是蛋白質(zhì)的DNA主要的修復(fù)因子，它也可作為轉(zhuǎn)錄輔激活因子刺激轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性。REF-1是有氧化還原反應(yīng)敏感Cys殘基的蛋白質(zhì)，必須在還原狀態(tài)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Trx1作為一個(gè)供氫體與REF-1形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使之成為對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，能誘導(dǎo)DNA結(jié)合多種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子如活化蛋白轉(zhuǎn)錄因子（AP-1）、NF-κB、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、p53和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，發(fā)揮抗凋亡促生長(zhǎng)的功能［6，9］。NF-κB和AP-1還是與炎癥關(guān)系密切的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，多種趨化因子［單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte ehemoattraetant protein-1，MCP-1）］和細(xì)胞間黏附分子（VCAM-1）基因啟動(dòng)子區(qū)包含有 AP-1和／或 NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)［17］。

Yodoi研究組最早提出了Trx調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的假說［18］。NF-κB通常與其抑制物IκB蛋白結(jié)合成復(fù)合物，以非活性形式存在于胞漿中。在胞漿中，Trx發(fā)揮抗氧化作用，能抑制活性氧對(duì)IκB激酶的激活、IκB的降解和NF-κB的核轉(zhuǎn)位，在胞核中，Trx通過還原效應(yīng)增強(qiáng)NF-κB與DNA的結(jié)合能力，因而促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。應(yīng)激誘導(dǎo)Trx向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，這時(shí)，胞漿Trx的減少解除了對(duì)NF-κB的抑制，而核內(nèi)Trx的增多則促進(jìn)了NF-κB同DNA的結(jié)合。這樣，Trx在核內(nèi)外定向運(yùn)動(dòng)使得NF-κB能夠接受外界信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。但該機(jī)制也受到了一些質(zhì)疑。Gius研究組發(fā)現(xiàn)，AP-1的DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性在穩(wěn)定表達(dá)硫氧還蛋白還原酶的細(xì)胞系中顯著增強(qiáng)，同時(shí)Trx1在這些細(xì)胞系中定位于細(xì)胞核內(nèi)，提示Trx1能增強(qiáng)AP-1的活性調(diào)節(jié)。移位到細(xì)胞核，Trx1和APE-1／Ref-1之間相互作用增強(qiáng)AP-1（Jun and Fos）的DNA結(jié)合活性，調(diào)節(jié)AKT介導(dǎo)的抗凋亡信號(hào)介導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)［19］。

2.3 細(xì)胞外 Trx在應(yīng)激條件下可分泌到細(xì)胞外，并發(fā)揮抗凋亡，抗炎活性保護(hù)細(xì)胞，以及作為自分泌／旁分泌因子促進(jìn)增長(zhǎng)。Trx可能是各種抗氧化劑中唯一具有細(xì)胞外功能的蛋白，Trx影響到鄰近的細(xì)胞，并可能防止損傷擴(kuò)展［4］。研究發(fā)現(xiàn)多種氧化應(yīng)激相關(guān)的病理狀態(tài)均可發(fā)現(xiàn)患者血清中Trx水平明顯升高。這種細(xì)胞分泌Trx的現(xiàn)象是宿主對(duì)氧化應(yīng)激的防御反應(yīng)。

Trx1有減弱炎癥反應(yīng)作用，減少人類單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞，動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)注射外源性Trx1可以抑制白細(xì)胞趨化。有體外試驗(yàn)表明，Trx1通過降低白細(xì)胞對(duì)MCP-1敏感性抑制白細(xì)胞趨化。有趣的是，這些結(jié)果與經(jīng)典的升高IL-8的水平阻止炎癥部位的白細(xì)胞外滲的報(bào)告一致。綜合二者，Trx1免疫調(diào)節(jié)作用很可能是由于其類趨化因子活性抑制白細(xì)胞聚集［20］。此外，JNK和p38通常與炎癥相聯(lián)系，Trx通過ASK1抑制二者發(fā)揮抗炎功能［21］。

其他，Trx1通過AP-1誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1（HO-1）介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，減少氧化應(yīng)激［22］。Trx1已被證明是促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)和提高活性繼而增加VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生長(zhǎng)［23，24］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rhTrx通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和PI3K，減少的c-Jun N-末端蛋白激酶和p38激活保護(hù)Ⅱ型上皮細(xì)胞［8］。另外，血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性過表達(dá)Trx2，可以減少氧化應(yīng)激和增加一氧化氮（NO）維護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能［8］。

2.4 線粒體 Trx2在調(diào)控細(xì)胞程序中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，它抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，增加線粒體膜電位，抑制Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路［8］。據(jù)認(rèn)為，功能的變化如線粒體減少膜電位mPTP的形成和線粒體細(xì)胞色素C的釋放是細(xì)胞凋亡重要原因［25］。此外，線粒體是生理情況下呼吸鏈中和病理情況ROS的主要來源，Trx2可調(diào)節(jié)線粒體的氧化還原狀態(tài)，在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用。

3 Trx活性調(diào)節(jié)

Trx的活性受到多種因素的調(diào)節(jié)：內(nèi)源性Trx抑制劑硫氧還蛋白的相互作用蛋白（Txnip）負(fù)向調(diào)節(jié)Trx還原酶的活性；Trx2還受到翻譯后修飾調(diào)節(jié)，既有正性調(diào)節(jié)也有負(fù)性調(diào)節(jié)。

3.1 TBP-2／TXNIP Nishiyama等最初把Txnip命名為硫氧還蛋白結(jié)合蛋白-2（TBP-2），也叫硫氧還蛋白相互作用蛋白或維生素D3-上調(diào)蛋白1（VUDP1），在心血管疾病發(fā)展中扮演重要角色。TBP-2與脂代謝失調(diào)密切相關(guān)，可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化和增加冠狀動(dòng)脈疾病的易感性。氧化應(yīng)激時(shí)，過度表達(dá)的TBP-2可與Trx結(jié)合，結(jié)合的Trx失去凋亡抑制功能而使凋亡增加，在細(xì)胞水平負(fù)性調(diào)節(jié)Trx1，并抑制NF-κB的DNA結(jié)合活性，級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原、生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞凋亡和衰老［26］。

3.2 翻譯后修飾 在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞凋亡是通過和抗凋亡分子之間的平衡嚴(yán)格控制的。由于多數(shù)細(xì)胞凋亡涉及的信號(hào)分子是蛋白質(zhì)，這些力量之間的正常平衡僅在基因水平上（轉(zhuǎn)錄調(diào)控）是不可以被摧毀，還要求在蛋白質(zhì)水平（翻譯后修飾）滅活。最近的研究表明，除了在基因水平上對(duì)Trx表達(dá)上調(diào)或下調(diào)外，Trx還對(duì)翻譯后調(diào)節(jié)修飾敏感。目前已確定四種形式的翻譯后修飾的Trx，這包括修飾發(fā)生在半胱氨酸殘基的氧化、谷胱甘肽化（glutathionylation）、S-亞硝基化和在酪氨酸殘基的蛋白質(zhì)硝化［14］。

在氧化應(yīng)激，Trx氧化是最常見的修飾，是半胱氨酸-32和半胱氨酸-35形成二硫鍵，和／或半胱氨酸-62和半胱氨酸-69間形成二硫鍵。谷胱甘肽化發(fā)生于CYS-73，這種翻譯后修飾顯著抑制Trx活性。Trx半胱氨酸-69（S-NO）亞-硝化，導(dǎo)致Trx1增強(qiáng)活性，這是唯一增強(qiáng)Trx活性的翻譯后修飾。亞硝基化不僅是Trx氧化還原活性的基礎(chǔ)，而且還調(diào)節(jié)Trx的抗凋亡及抗炎活性。Trx酪氨酸-49，由過氧亞硝酸鹽硝化 不可逆 的 抑 制 Trx活 性［4，12，14，27］。 因 此，一 氧 化 氮 和 二 次 反應(yīng)的產(chǎn)品，尤其是過氧化亞硝酸鹽，對(duì)Trx產(chǎn)生相反的效果。具體來說，一氧化氮本身誘導(dǎo)Trx亞硝基化增強(qiáng)其活性，而過氧化亞硝酸鹽硝化Trx導(dǎo)致不可逆失活［4］。NO信號(hào)和Trx系統(tǒng)之間的相互作用使心血管系統(tǒng)的氧化還原調(diào)控變得更加精細(xì)和復(fù)雜。

4 小 結(jié)

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)Trx介導(dǎo)的一系列抗氧化抗凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。內(nèi)、外源性Trx同樣起著心肌保護(hù)作用，這為我們減輕心肌缺血再灌注損傷提供了切入點(diǎn)，上調(diào)Trx表達(dá)及活化修飾將來可能成為抗缺血再灌注的重要手段。

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