2例復(fù)雜熱性驚厥兒童GABRG2基因突變分析

孔慶英，石 巖

熱性驚厥（febrile seizure，F(xiàn)S或febrile convulsion，F(xiàn)C）是嬰幼兒期最常見的驚厥性疾病，其定義為發(fā)生在嬰幼兒期的伴有發(fā)熱的驚厥發(fā)作，并排除中樞神經(jīng)系統(tǒng)及曾有無熱驚厥病史者。本病的臨床經(jīng)過有多樣性，可分為單純熱性驚厥（simple febrile seizure，SFS）和復(fù)雜熱性驚厥（complex febrile seizure，CFS）兩型。其中CFS的發(fā)病年齡＜6個(gè)月或在6歲以上仍發(fā)病，起病時(shí)體溫可不足38℃，發(fā)作形式有部分性發(fā)作表現(xiàn)，起病24h內(nèi)可復(fù)發(fā)1次或多次，驚厥時(shí)間較長，有的可達(dá)20min～30min，發(fā)作前可能已有中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常（如：智力低下、腦損傷或腦發(fā)育不全等），熱退后一周腦電圖仍有異常等特征。CFS可由病毒感染、神經(jīng)生物化學(xué)異常等引起，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。另外，熱性驚厥發(fā)作的嚴(yán)重程度、再發(fā)的危險(xiǎn)性以及熱性驚厥與癲癇之間也存在著遺傳上的聯(lián)系。目前以不同種族和地區(qū)的家系進(jìn)行基因定位得到的熱性驚厥候選染色體區(qū)域已經(jīng)有8q13－21（FEB1）［1］、19p13.3（FEB2）［2］、2q23－24（FEB3）［3］、5q14－15（FEB4）［4］和6q22－24（FEB5）［5］等。而確切與熱性驚厥相關(guān)的基因尚未找到，對于遺傳基因的研究也大多集中于已知與其他癲癇有關(guān)基因的研究。目前已發(fā)現(xiàn)配體門控氯離子通道GAGAA受體γ2亞基基因（GABRG2）和電壓門控鈉離子通道α1、α2、β1亞基基因（SCN1A、SCN2A、SCN1B）的基因突變與CFS有關(guān)［6］。其中以GABRG2基因突變導(dǎo)致復(fù)雜熱性驚厥最常見。為分析GABRG2基因的突變特點(diǎn)，現(xiàn)將2例CFS患兒的臨床特點(diǎn)和GABRG2基因分析報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 病例［1］ 男，4歲。在3個(gè)月時(shí)有熱性驚厥發(fā)作，表現(xiàn)為雙眼上翻凝視、面色青紫、牙關(guān)緊閉、口吐白沫、口角及四肢不由自主地抽動、大小便失禁。抽搐時(shí)間約2min后，自行停止，神志恢復(fù)快，清醒后感乏力。此后一年內(nèi)有2次熱性驚厥發(fā)作，發(fā)作時(shí)體溫均不足38℃，發(fā)作持續(xù)時(shí)間延長（＞15 min），3歲時(shí)出現(xiàn)一次無熱驚厥發(fā)作，表現(xiàn)為雙眼上翻、面色蒼白、呼吸急促、口角及四肢抽搐，無大小便失禁。實(shí)驗(yàn)室檢查腦電圖（electroencephalogram，EEG）顯示背景波正常，發(fā)作時(shí)可見頂／顳區(qū)棘－慢波，發(fā)作間歇期EEG正常，以后發(fā)作間歇期慢波明顯增多，隨著年齡的增長日漸活躍并顯示頻發(fā)的不規(guī)則棘波，核磁（Magnetic－resonance imaging，MRI）腦掃描顯示正常。在發(fā)育過程中早期的行為發(fā)育正常，但語言發(fā)育延遲。腦脊液檢查正常，血生化、血鈣、血糖、血電解質(zhì)、尿素氮、氨基酸檢查均無異常改變。

病例［2］ 男，3歲。在8個(gè)月時(shí)出現(xiàn)首次熱性驚厥發(fā)作，表現(xiàn)為口周發(fā)紺，呼吸急促，上肢不自主的抽動，下肢伸直，強(qiáng)直抽搐，伴呼之不應(yīng)。2歲時(shí)出現(xiàn)兩次熱性驚厥發(fā)作，間隔不足24 h，發(fā)作時(shí)體溫不足38℃，表現(xiàn)與第一次發(fā)作相同，持續(xù)時(shí)間約20min，伴大小便失禁，神志恢復(fù)時(shí)間長，但沒有以癲癇持續(xù)狀態(tài)為特征時(shí)出現(xiàn)的驚厥發(fā)作、失神性發(fā)作、肌陣攣、遲緩性發(fā)作。實(shí)驗(yàn)室檢查EEG顯示背景波正常，呈兒童異常睡眠EEG。MRI腦掃描顯示正常，腦脊液檢查正常，血生化、血鈣、血糖、血電解質(zhì)、尿素氮、氨基酸檢查均正常。

1.2 研究方法

1.2.1 血標(biāo)本的采集和基因組DNA提取 經(jīng)實(shí)驗(yàn)對象的書面同意并簽訂知情同意書后，取2例患者的外周靜脈血5mL，10%草酸鉀抗凝，高鹽法提取白細(xì)胞基因組DNA。

1.2.2 引物選擇與合成 GABRG2的9個(gè)外顯子序列（NT－023133）及cDNA 序列（NM－000816）由http：／／www.genatlas.org／獲得，按參考文獻(xiàn)［7，8］應(yīng)用的引物序列設(shè)計(jì)引物，所有引物均設(shè)計(jì)在內(nèi)含子或非翻譯區(qū)，其擴(kuò)增產(chǎn)物包括5’非翻譯區(qū)和所有外顯子，并包括各個(gè)外顯子兩端大約20個(gè)～30個(gè)堿基的內(nèi)含子。引物委托北京諾賽基因組研究中心有限責(zé)任公司合成。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 對GABRG2基因的9個(gè)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系是25 μL，包括10×Taq buffer2.5μL、25mmol／L MgCl21.5μL、2.5 mmol／L dNTP 2μL、5pmol／μL正反向引物各2μL、Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司）1.25U、基因組DNA 1μL、加去離子水至25μL體積。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火58℃～64℃30s，退火溫度由具體引物決定，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。4℃保存。取3μL的PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物直接測序 以PCR引物作為測序引物，委托北京諾賽基因組研究中心有限責(zé)任公司，用末端終止法在ABI9700型熱循環(huán)儀上進(jìn)行測序反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，延伸產(chǎn)物在ABI PRISM3730型XLDNA序列分析儀上進(jìn)行分析。對測序異常的片段重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再次正向、反向測序，共3次，以驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。測序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件包中的SeqmanTM軟件及EditSeq軟件（Lasergene公司產(chǎn)品）與正常GABRG2全基因組序列（GenBank accession no.NT－013133）進(jìn)行比對分析，并用http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增 GABRG2基因9個(gè)外顯子PCR擴(kuò)增片段與預(yù)計(jì)的大小一致，沒有非特異性擴(kuò)增帶。

2.2 DNA測序 根據(jù)人類DNA序列變異命名建議和美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的 GeneBank數(shù)據(jù)庫資料（NM－000816）命名GABRG2基因變異。對2例CFS的患者的GABRG2基因全部9個(gè)外顯子及其周圍部分內(nèi)含子進(jìn)行檢測，在第9外顯子處檢測出1個(gè)致病基因突變：1287G＞A，遺傳密碼子TGG被替換為終止密碼子TGA，這一無義突變使390位的色氨酸殘基被終止密碼替換 （W390X）。這一基因突變在HGMD中已公布。

3 討 論

熱性驚厥是嬰幼兒期最常見的驚厥性疾病，發(fā)病率2%～5%［9］?；純侯A(yù)后一般良好，但約3%的患兒以后發(fā)展為無熱驚厥，即癲癇［10］。CFS是嬰幼兒期熱性驚厥的復(fù)雜形式，主要診斷條件有：①24h內(nèi)多次復(fù)發(fā)；②發(fā)作持續(xù)＞15min；③發(fā)作形式呈部分性發(fā)作者。熱性驚厥附加癥（febrile seizure plus，F(xiàn)S＋）是一個(gè)新提出的熱性驚厥類型，其診斷標(biāo)準(zhǔn)是：在熱性驚厥發(fā)展為典型癲癇之前，有2次以上的無熱驚厥發(fā)作，或在6歲以后仍有熱性驚厥者，稱為熱性驚厥附加癥。Scheffer等［11］在1997年對澳大利亞一個(gè)熱性驚厥表型的家系的受累成員的臨床表型進(jìn)行系統(tǒng)分析后，首先在國際上提出全面癲癇伴熱性驚厥附加癥（generalized epilepsy with febrile seizure plus，GEFS＋）的概念。其常見的表型是FS、FS＋，其他表型包括FS＋伴失神、FS＋伴肌陣攣或失張力發(fā)作，呈常染色體顯性遺傳伴外顯率不全，其外顯率為62%～76%［12］，有明顯的表型異質(zhì)性（同一基因突變有不同的臨床表型）。目前認(rèn)為FS＋和GEFS＋是同一基因的不同表現(xiàn)，其基因位于染色體19q13.1或2q21－q33，該基因與熱性驚厥候選染色體基因座FEB2和FEB3部分重合。

熱性驚厥的病因尚不完全明確，近年來研究發(fā)現(xiàn)，本病有明顯的遺傳傾向。其遺傳機(jī)制較復(fù)雜，可能為常染色體顯性遺傳，也有隱性遺傳和多基因遺傳的報(bào)道，伴年齡相關(guān)的不完全外顯性及表現(xiàn)度。有明顯的遺傳異質(zhì)性（多基因遺傳，單基因遺傳均可見于FS）和基因座異質(zhì)性（有幾個(gè)基因位點(diǎn)都引起相同的FS表型）。

GABAA受體主要介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸傳遞的快速抑制，對抑制性突觸后電流對大腦神經(jīng)元的興奮起抑制作用［11］，由α1－6、β1－3、γ1－3、δ、ε、π、ρ1－3幾個(gè)不同的亞基組成，而α1、β2、γ2是 GABAA 受體的主要亞型［13］。其中 GABRG2基因定位于5號染色體的長臂上（5q34）［14，15］，全長85.70kb，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，編碼GABAA受體的γ2亞基，主要參與受體的運(yùn)輸、聚集及突觸的保護(hù)。目前發(fā)現(xiàn)的GABRG2基因熱點(diǎn)突變有7種，其中有3種錯(cuò)義突變：R43Q［16］、K289M［17］、R139G［18］；3 種 無 義 突 變：Q351X［19］、W390X［7］、Q40X［20］；1 種剪切位點(diǎn)的突變：IVS6＋2T＞G［21］，均為單基因并呈常染色體顯性遺傳伴外顯率不全。其中W390X、Q351X突變位于3、4結(jié)構(gòu)域之間的細(xì)胞內(nèi)環(huán)，在翻譯時(shí)過早的引入一終止密碼子，使成熟的GABA受體蛋白失去了第四跨膜區(qū)，這種截短的GABA受體使細(xì)胞膜表面的受體密度下降，與GABA的結(jié)合下降，從而減弱了對神經(jīng)元興奮性的抑制，增加神經(jīng)元的興奮性和放電，增強(qiáng)突觸對興奮性傳入的反應(yīng)［22］。Sun等［8］對一GEFS＋家系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該家系先證者的GABRG2基因存在第9外顯子的雜合無義突變1287G＞A（W390X），先證者之母和具有GEFS＋表型的其他家系成員均攜帶該基因突變，3代共有7例受累成員，臨床表型1例為FS，6例為FS＋，1例攜帶該突變的家系成員臨床表型正常，外顯率約為87.5%，家系符合常染色體顯性遺傳伴外顯率不全。Harkin等［23］對一GEFS＋大家系進(jìn)行研究，先證者為SMEI，家系中有FS表型9例，F(xiàn)S＋表型1例。先證者及其父母親均有GABGG2基因的Q352X突變，而2例受累者無此突變，進(jìn)一步說明GEFS＋家系成員攜帶同一基因突變但表型輕重可以不同，其表型還受其他遺傳因素和環(huán)境因素的影響。R43Q突變改變了第1、2跨膜區(qū)胞外段的高度保守的氨基酸殘基區(qū)域（與苯二氮卓類結(jié)合的區(qū)域），減少細(xì)胞膜表面受體的表達(dá)，并影響其運(yùn)輸［23］和與大腦皮層興奮性有關(guān)的苯二氮卓類的結(jié)合力［24］。Wallace等［16］首先在一熱性驚厥家系中報(bào)道了R43Q突變，其先證者表型是特發(fā)性全身癲癇綜合征（IGES），而一些無癥狀攜帶者也可在一些上一代中發(fā)現(xiàn)R82Q的突變，同時(shí)，在這一家系中有EEG異常或驚厥發(fā)作的病人未見R82Q的突變，這說明R43Q突變外顯率不全及在一些個(gè)體中可能有另外一些因素參與從而抑制了驚厥的發(fā)作。K289M突變改變了第2和第3跨膜區(qū)之間胞外段的一高度氨基酸保守區(qū)域，降低GABA受體電活動的幅度［25］。R139G是跨膜區(qū)域胞外段與熱性驚厥有關(guān)的一錯(cuò)義突變，這一突變增加了受體的脫敏作用并降低了對地西泮的敏感性［18］。IVS6＋2T＞G，這種GABAA受體突變的作用尚不完全清楚，但認(rèn)為由于外顯子的跳躍導(dǎo)致編碼蛋白的功能喪失這是由于他在第5外顯子和第7外顯子連接位置過早出現(xiàn)終止密碼子［26］，使受體功能障礙，抑制功能不足，可能與導(dǎo)致CFS易感性有關(guān)。

對本研究中的2例CFS兒童進(jìn)行研究，采用PCR擴(kuò)增GABRG2基因9個(gè)外顯子及其周圍的部分內(nèi)含子，用正反向引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接DNA序列測定，結(jié)果在2例CFS兒童中均發(fā)現(xiàn)GABRG2基因第9外顯子第1287位G＞A，使第390位的色氨酸（Trp，W）殘基被終止密碼替換（W390X），這與已發(fā)現(xiàn)的突變熱點(diǎn)相一致，提示GABRG2基因突變是CFS兒童的主要致病原因。對兩位患者的父母親進(jìn)行突變基因篩查，發(fā)現(xiàn)在第一位患者父親有相同的突變位點(diǎn)但未發(fā)病，這說明W390X突變有不同的外顯率［8，12］，與國內(nèi)外報(bào)道相一致。而在母親未發(fā)現(xiàn)相同的突變。在第二位患者母親發(fā)現(xiàn)突變，曾有熱性驚厥史，未對其弟弟進(jìn)行突變基因篩查。以上證據(jù)表明，GABRG2基因突變可導(dǎo)致CFS疾病的發(fā)生。

總之，本研究在2例CFS患兒中檢測到GABRG2基因1個(gè)致病突變（W390X），提示GABRG2基因突變是本研究2例CFS兒童的主要致病原因。

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