牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1及其相關(guān)蛋白礦化作用的研究進展*

占 柳 謝淑娟 潘衛(wèi)紅

牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1(DMP-1)是在大鼠cDNA文庫中檢測到的酸性磷酸化細胞外基質(zhì)蛋白，是礦化組織中非膠原蛋白的重要組成部分。DMP-1主要表達于牙齒，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)其在骨組織、腎臟、胰腺等其它部位亦見表達，牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1不僅參與未分化間充質(zhì)細胞向成牙本質(zhì)細胞分化，還介導(dǎo)了牙本質(zhì)的礦化和細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]，但具體的機制尚未明確。

1. 牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1的基因結(jié)構(gòu)

DMP-1基因是首個被克隆的牙本質(zhì)相關(guān)基因。到目前為止，人類已經(jīng)成功克隆了大鼠、小鼠等多種動物及人的DMP-1基因全序列。DNA序列分析顯示牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1富含天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸，且其具有許多潛在的酪蛋白激酶Ⅰ和酪蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點，同時具有一個潛在的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)細胞附著序列和一個經(jīng)證實的N-糖基化一致序列。

大鼠DMP-1由489個氨基酸殘基組成，其cDNA基因包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，全長為13kb。第一個外顯子長約95bp，編碼5’端非翻譯區(qū)的大部分區(qū)域；第二外顯子長約19bp，編碼5’端非翻譯區(qū)，氨基酸殘基的信號肽以及N末端的兩個氨基酸；第3、4、5外顯子分別編碼16、11、15個氨基酸。其中第5外顯子是由多個片段接合而成；第6外顯子是牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1的基因中最大的外顯子，包含了80%的編碼信息，約占cDNA全長的1/10，編碼3’端非翻譯區(qū)、終止碼和與細胞黏附相關(guān)的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸細胞附著序列(RGD)三肽序列。外顯子與內(nèi)含子邊界的確定，屬于0類型，即外顯子與內(nèi)含子在邊界合作中密切貼合，遵從經(jīng)典的GT/AG規(guī)則。5個內(nèi)含子的長度分別為3791bp、465bp、2047bp、162bp、1375bp，其編碼的5個內(nèi)含子中第一個內(nèi)含子最大，對DMP-1在組織中的特異性表達起到重要的作用[2]；第4內(nèi)含子最小。Pang Jl等[3]的研究初步確定了DMP-1上游啟動子序列在成牙本質(zhì)細胞分化中的調(diào)控作用及機制。在同源性方面，大鼠與人的基因序列的同一性為66.2%。另外，DMP-1基因還包含了SP1、AP1、GATA、CREB、C-Myc等基因的接合位點以及ELK1、ISRE等的血清反應(yīng)元件[4-6]。

除DMP-1外，DMPS的家族成員還有DMP-2和DMP-3。DMP-2屬于牙本質(zhì)磷蛋白家族，富含絲氨酸和天門冬氨酸，是細胞外基質(zhì)(ECM，extracellular matrix)生物礦化的初始調(diào)控蛋白。與DMP-2相比，DMP-3基因具有DSP基因編碼序列，編碼小型牙本質(zhì)磷蛋白(minni-PP)。且DMP-2的兩個功能域之間無終止碼。

2. 核心結(jié)合因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1的表達的影響

①核心結(jié)合因子-1(Cbfɑ1)對牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1表達的影響

近年來的研究表明，Cbfɑ1的功能對骨形成領(lǐng)域的掌握和研究有重要的影響。Cbfɑ1表達于成骨細胞譜系的細胞中，并調(diào)節(jié)骨形成特異性基因的表達，同時它是成骨細胞和成牙本質(zhì)細胞分化的關(guān)鍵。核心結(jié)合因子Cbfɑ1是成骨細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，Cbfɑ1基因敲除實驗表明Cbfɑ1在骨和牙的發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用。在Cbfɑ1缺乏的動物中，同時發(fā)現(xiàn)骨發(fā)育不全或牙發(fā)育不全的癥狀。JQ.Feng[7]等通過體外凝膠電泳實驗，Cbfɑ1瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)合無Cbfɑ1因子小鼠的體內(nèi)研究，證實DMP-1是骨發(fā)育初始階段軟骨細胞和成骨細胞的標(biāo)記基因，同時在軟骨和骨發(fā)育的過程中，DMP-1是Cbfɑ1一個重要的目標(biāo)分子，Pang Jl[3]等通過熒光素酶活力測試顯示，在成牙本質(zhì)細胞分化的過程中，Cbfɑ1正調(diào)節(jié)DMP-1的表達并對DMP-1瞬時表達形式產(chǎn)生影響。

在骨骼的發(fā)育過程中，Cbfɑ1與DMP-1的表達有時候會有所重疊，但 Cbfɑ1的表達早于DMP-1。JQ.Feng[7]等在研究 Cbfɑ1 和 DMP-1 的表達模式時發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎發(fā)育的第12.5天，軟骨形成；在胚胎發(fā)育的第14.5天，骨化開始；在胚胎發(fā)育的第16.5天，骨快速形成。在E12.5天并未發(fā)現(xiàn)DMP-1的表達，而Cbfɑ1在軟骨組織中明顯表達。在E14.5天，Cbfɑ1在軟骨組織中繼續(xù)高度表達，在此階段，發(fā)育的骨中能夠觀察到DMP-1的表達，但僅限于含有肥大軟骨細胞的區(qū)域。在E16.5天，DMP-1表達于肥厚的軟骨細胞和成骨細胞中，與Cbfɑ1的表達相重疊。JQ.Feng通過對突變體小鼠的研究也證實了無Cbfɑ1突變體小鼠缺乏成熟的骨組織且牙齒發(fā)育不全。這說明Cbfɑ1是骨組織和牙齒發(fā)育過程中的一個重要的調(diào)節(jié)因子。Cbfɑ1轉(zhuǎn)染表達媒介能夠誘導(dǎo)C3H10T1/2細胞內(nèi)DMP-1的表達，且與其劑量成正相關(guān)關(guān)系。說明Cbfɑ1功能性地調(diào)節(jié)了DMP-1的表達。

然而，在出生后小鼠骨的發(fā)育過程中，Cbfɑ1的表達與DMP-1的表達逐漸相脫離。在產(chǎn)后2周齡的動物體內(nèi)，DMP-1在肥大的軟骨細胞和骨細胞中高度表達，在產(chǎn)后8周齡的動物體內(nèi)，DMP-1在骨細胞中高度表達，Cbfɑ1在軟骨細胞和骨細胞中均未表達，卻高度表達于成骨細胞中[7]，由此表明，Cbfɑ1與DMP-1在出生后小鼠骨的發(fā)育過程中，這種相關(guān)性已消失。

②轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子c-Jun、c-Fos對牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

DMP-1是在成牙本質(zhì)細胞分化過程中能表達具有時空特異性的細胞外基質(zhì)的酸性磷酸蛋白，雖然在動物試驗中已經(jīng)分離出DMP-1啟動子，然而，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是如何調(diào)控DMP-1啟動子，我們知之甚少。

轉(zhuǎn)錄因子AP1(activator protein 1)家族可參與細胞增殖和分化，是骨組織和牙組織的特異性轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子的同位反應(yīng)元素存在于DMP-1的啟動因子中，結(jié)合MatInspector 軟件分析結(jié)果，可推測c-Jun和c-Fos是通過結(jié)合人DMP-1啟動子區(qū)的作用位點從而發(fā)揮對DMP-1的調(diào)控作用[8,9]。逄鍵梁[10]等的研究表明c-Jun和c-Fos可降低人DMPl基因轉(zhuǎn)錄活性，是HDPSCs向成牙本質(zhì)細胞方向分化重要的調(diào)節(jié)因子，DMP-1啟動子序列-110～-100bp區(qū)可能是c-Jun、c-Fos有效作用位點。

c-Jun和c-Fos是AP1超蛋白家族的主要成員，Narayanan K[11]等推測c-Jun和c-Fos可能參與牙本質(zhì)細胞時空表達Dmp-1的調(diào)控過程。C-Jun的mRNA水平隨著牙本質(zhì)細胞的分化程度而增加，其在年輕和成熟的成牙本質(zhì)細胞中均有表達，說明c-Jun參與牙胚中成牙本質(zhì)細胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，可作為成牙本質(zhì)細胞的標(biāo)志物。Hirata M[9]的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠磨牙牙冠處臨近牙本質(zhì)礦化的成牙本質(zhì)細胞中，有c-Fos的表達，其表達可能與成牙本質(zhì)細胞中增強的骨鈣素水平相關(guān)?？偠灾琧-Jun和c-Fos在早期成牙本質(zhì)細胞分化過程中發(fā)揮作用，而在中末期分化的成牙本質(zhì)細胞中的作用并不明顯。

3. 牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1的功能

①DMP-1在牙本質(zhì)礦化中的作用

目前，學(xué)者們并不確定牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1的確切功能，Gajjeraman[12]等研究表明，大鼠重組DMP-1全基因及天然DMP-1C末端在Ⅰ型膠原的作用下均可加速羥磷灰石的成核作用，而DMP-1N末端則抑制其成核作用。由于DMP-1的組成中富含大量的絲氨酸，而絲氨酸多以磷酸化的形式存在，使得DMP-1成為等電點為3.68的強酸性蛋白，且磷酸化的氨基末端，可以與Ca2+結(jié)合。由此推測，DMP-1能夠使羥磷灰石成核。在此過程中，DMP-1首先與Ca2+結(jié)合并啟動礦物質(zhì)沉積，隨著成核的無定形鈣磷沉淀物成熟，進而擴大融合，最終導(dǎo)致晶體形成[13,14]。另外，DMP-1基因的N末端氨基酸序列可以啟動和穩(wěn)定非平衡狀態(tài)下的晶體以及核周圍的微環(huán)境[15]。

DMP-1由成牙本質(zhì)細胞合成分泌并在極化的牙本質(zhì)細胞頂端表達，然后沿著細胞突分泌到礦化組織的前沿，像DMP-1這樣的酸性蛋白質(zhì)是成牙本質(zhì)細胞礦化過程中重要的有機基質(zhì)成分和參與核。成牙本質(zhì)細胞的礦化是一個多步驟的復(fù)雜過程，精確地細胞介導(dǎo)機制參與調(diào)控這一過程。首先，組織形成細胞分泌結(jié)構(gòu)性基質(zhì)蛋白，這些結(jié)構(gòu)性基質(zhì)蛋白決定了組織的形狀，并提供有序的、定向晶核形成和生長的空間。其次，組織形成細胞分泌一系列磷酸化的DMP-1，當(dāng)晶核的形成和生長機制被啟動，在不同的成核程序中，具有調(diào)控功能的酸性大分子DMP-1在特定的位點進入結(jié)構(gòu)性基質(zhì)中。正因為DMP-1結(jié)合鈣離子和結(jié)構(gòu)性基質(zhì)的相互作用，最終調(diào)節(jié)晶體的生長、形態(tài)及礦化核的最終大小。

DMP-1除了具有Ca2+結(jié)合的能力，還具有高度的親和力，可以和Ⅰ型膠原纖維結(jié)合，增加重建的Ⅰ型膠原纖維的直徑[16]。另外，膠原蛋白中還含有少量的Ⅴ型膠原，經(jīng)大量的研究證實，Ⅴ型膠原大分子形成原核后，Ⅰ型膠原交聯(lián)到Ⅴ型膠原中，膠原纖維交織成網(wǎng)，從而為牙本質(zhì)的礦化提供支架和空間。AtulSuresh Deshpande[17]等通過投射型電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)磷酸化的DMP-1與非磷酸化的DMP-1的主要區(qū)別在于磷酸化的DMP-1誘導(dǎo)礦化部分成核，在此過程中無需膠原纖維的參與。

②DMP-1在骨組織形成和改建中的作用

DMP-1高度表達于胚胎發(fā)育過程中的成骨細胞。其表達與骨細胞核的形成與礦化密切相關(guān)，DMP-1存在于礦化早期的成骨細胞核內(nèi)，在成骨細胞礦化的過程中，Jun-B和p300協(xié)同作用，能夠顯著地調(diào)控DMP-1的啟動子的活性。p300內(nèi)源性組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性在DMP-1表達調(diào)控中有著重要的作用[18]。Jun-B的Ser-79位置的磷酸化及Jun-B與p300之間的相互作用對成骨細胞的礦化同樣十分重要。定性研究表明，機械負(fù)載對骨細胞中DMP-1的表達起到重要的調(diào)控作用，為了應(yīng)對機械負(fù)載，骨細胞中的DMP-1被誘導(dǎo)表達，DMP-1 的氨基酸序列含有酸性結(jié)構(gòu)域，攜帶負(fù)電荷，與攜帶正電荷的鈣離子有很強的結(jié)合能力，因此能促進羥基磷灰石的形成并調(diào)控骨細胞的分化，在體內(nèi)參與硬組織的礦化過程。在骨折愈合過程中，DMP-1通過對破骨細胞的黏附，從而激活破骨細胞，進而增強骨痂改建。

近年來，學(xué)者們對DMP-1的研究不斷深入，DMP-1的基因結(jié)構(gòu)、特異性表達極其礦化功能已經(jīng)逐漸被認(rèn)識。但是，DMP-1對成牙本質(zhì)細胞分化和成熟的具體機制、如何調(diào)節(jié)牙本質(zhì)和骨組織的形成等尚不明確，及其在修復(fù)性牙本質(zhì)中的具體調(diào)控機制、對牙齒和骨組織礦化過程的調(diào)控作用尚不清楚。因此，對于DMP-1的探討，在今后的研究中還有很多問題有待解決。

[1]Chaussain C，Eapen AS，Huet E，et a1.MMP2-cleavage Of DMPI generatesabioaetivepeptidepromoting differentiation of dental pulp stem／progenitor cell[J].Eur Cell Mater，2009，18：84—95

[2]Lu Y，XieY，Zhang S，et,al.DMP1-targeted Creexpression in odontoblastsand osteocytes[J].J Dent Res,2007，86(4)：320—325

[3]PangJL，Zhang YQ，Ke J，eta1.Upregulation ofdentin matrix protein 1 promoteractivities by core binding factorα1 in human dental pulp stem cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2007，357(2)：505—510

[4]GeorgeA,Gui J,JenkinsNA，et,al.In situ localization and chromosomal mapping of the AG1(Dmp1)gene[J].J Histochem Cytochem,1994,42(12)：1527-1531

[5]D'Souza RN,CavenderA,Sunavala G,et,al.Gene expression patternsof murinedentin matrix protein 1(Dmp1)and dentin sialophosphoprotein (DSPP)suggestdistinct developmental funct ions in vivo[J].J Bone Miner Res,1997,12(12),2040-2149

[6]Kulkarni GV,Chen B,Malone JP,et,al.Promotion of selective cell attachment by the RGD sequence in dentine matrix protein 1[J].Arch Oral Biol,2000,45(6)：475-484

[7]Fen JQ,Zhang J,DallasSL,et al.Dentin Matrix Protein 1,a Target Molecule for Cbfa1 in Bone,Is a Unique Bone Marker Gene[J].Journal Of Bone And Mineral Research,2002,17(10)：1822-1831

[8]Chen S，Inozentseva-Clayton N,Dong J,et al.Binding of two nuclear factors to a novel silencer element in human dentin matrix protein 1 (DMP1)promoter regulates the cell type-specific DMP1 gene expression[J].J Cell Biochem,2004,92(2)：332—349

[9]Hirata M，Yamaza T，Mei YF，et a1.Expression of osteocalein and Jun D in the early period during reactionary dentin formation after tooth preparation in ratmolars[J].J Cell TissueRes，2005，9(3)：455—465

[10]逢鍵梁,鄧天政,朱曉茹，等.c-Jun、c-Fos對人牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的研究[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，24（6）：443-447

[11]NarayananK.RamachandranA，HaoJ，eta1.Transcriptional regulation of dentin matrix protein 1(DMPl)by AP—l(c—fos／c—jun)factors[J].Connect Tissue Res,20 02，3(2-3)：365-371

[12]Gajjeraman S, Narayanan K，Hao J，etal. Matrix macromolecules in hard tissues control the nucleation and hierarchical assembly of hydroxyapatite[J].J Biol Chem.2007,282(2)：l193-1204

[13]Kulkarni GV，Chen B，Malone JP,et al.Promotion of selective cell attachment by the RGD sequence in dentine matrix protein 1[J].Arch Oral Biol.2000,45(6)：475-184

[14]HeG，Dahl T,VeisA,et al.Nucleation of apatitecrystalsin vitro by self-assembled dentin matrix protein 1[J].Nat Mater.2003,2(8)：552-558

[15]Sivakumar Gajjeraman,Karthikeyan Narayanan,Jianjun Hao,et al.Matrix Macromolecules in Hard Tissues Control theNucleation and Hierarchical Assembly of Hydroxyapatite[J].The Journal Of Biological Chemistry,2007,282(2),1193-1204

[16]He G,George A.Dentin matrix protein 1 immobilized on typeⅠcollagen fibrils facilitates apatite deposition in vitro[J].JBiol Chem.2004,279(12),11649

[17]Atul Suresh Deshpande,Ping-An Fang,Xiaoyuan Zhang,et al.Primary Structure and Phosphorylation of Dentin Matrix Protein 1(DMP1)and Dentin Phosphophoryn(DPP)Uniquely Determine Their Role in Biomineralization[J].American Chemical Society,2011,12,2933-2945

[18]Narayanan K，SrinivasR，Peterson MC，eta1.Transcriptional regulation of dentin matrix Protein 1 by Jun B and p300 during osteoblastdifferentiation[J].J Biol Chem，2004，79(43)：44294-44302