微生物聚羥基脂肪酸酯的應(yīng)用新進展

陳國強

(清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100084)

微生物聚羥基脂肪酸酯的應(yīng)用新進展

陳國強

(清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100084)

生物制造產(chǎn)業(yè)系包括生物燃料、生物材料和生物化學(xué)品的產(chǎn)業(yè)，近來也稱為“白色生物技術(shù)”。由于國內(nèi)外對有關(guān)不依賴于石油原料、環(huán)保以及二氧化碳減排和可再生資源的利用等產(chǎn)業(yè)的重視，生物制造產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展的機會。聚羥基脂肪酸酯(簡稱PHA)擁有優(yōu)良的生物可降解性、生物相容性和光學(xué)性能，是當今生物制造的重點之一。經(jīng)過數(shù)十年的努力，PHA已經(jīng)成長為一個包括工業(yè)發(fā)酵、環(huán)保材料、生物燃料和醫(yī)用植入材料等的產(chǎn)業(yè)鏈。綜述了聚羥基脂肪酸酯的應(yīng)用新進展及國內(nèi)發(fā)展現(xiàn)狀。

聚羥基脂肪酸酯;生物制造;環(huán)保材料;PHA

1 前言

石油資源的日漸枯竭和環(huán)境的高污染是當經(jīng)社會發(fā)展的兩大核心制約因素，日益受到各國政府的高度關(guān)注。因此，具有不依賴于石油原料、環(huán)保低碳和可再生性等特點的生物制造產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展的機會。生物制造產(chǎn)業(yè)包括生物燃料、生物材料和生物化學(xué)品等產(chǎn)業(yè)，近來也被稱為“白色生物技術(shù)”。目前開發(fā)的重點集中在下列領(lǐng)域:① 生物燃料:從纖維素獲得生物燃料乙醇、從生物廢棄物獲得生物燃氣(甲烷)和氫氣;②生物材料:生物聚酯如聚羥基脂肪酸酯PHA和聚乳酸PLA等;③生物化學(xué)品:如平臺化學(xué)品包括乳酸、琥珀酸、1，3-丙二醇、3-羥基丙酸等。

生物聚酯——聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一種典型的“低碳材料”。它來源于吸收了二氧化碳的植物，形成后可以作為塑料使用，使用后可以轉(zhuǎn)化為燃料HAME，燃燒后放出的二氧化碳進行光合作用轉(zhuǎn)化為植物，植物又可以作為PHA發(fā)酵原料，如圖1所示。由于具有優(yōu)異的生物可降解性、生物相容性和可再生性，PHA已成為當今生物制造領(lǐng)域研究和產(chǎn)業(yè)化的重點之一。迄今，研究者對于PHA的合成途徑、代謝工程、材料性能和應(yīng)用等方面進行了系統(tǒng)的研究。國內(nèi)外相繼建立了與PHA大規(guī)模生產(chǎn)相關(guān)的20幾家公司(表1)。PHA和相關(guān)技術(shù)正在形成了一個從發(fā)酵、材料、能源到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的工業(yè)價值鏈。

圖1 低碳材料PHA的綠色循環(huán)Fig.1 Schematic diagram of green recycle for low carbon materials PHA

表1 全球生產(chǎn)和研究PHA的公司Table 1 Global PHA research and production companies

在國內(nèi)各級機構(gòu)支持下，在幾個五年計劃和863計劃支持下，我國在PHA研究的各個領(lǐng)域近年來取得眾多研究成果，相關(guān)產(chǎn)業(yè)也得到大力發(fā)展［1］。目前，國內(nèi)已形成了8個PHA生產(chǎn)企業(yè)，總產(chǎn)能超過1.5萬t，提供了國際市場上所有PHA類型，使我國在PHA產(chǎn)業(yè)化的種類和產(chǎn)量方面都處于國際領(lǐng)先地位。下面具體對國內(nèi)外PHA的應(yīng)用新進展和國內(nèi)發(fā)展現(xiàn)狀進行分析討論。

2 PHA簡介

PHA由含有羥基的脂肪酸單體組成，單體的羧基與相鄰單體的羥基之間形成酯鍵，分子結(jié)構(gòu)如圖2所示。其中，R可以是烷基、烯基、帶有苯環(huán)的烷基、甚至是帶有鹵素的烷基等等。R可以從一個C到12個C不等。另外，根據(jù)單體結(jié)構(gòu)的規(guī)律性，PHA還可以分為PHA均聚物(Homopolymers)、PHA隨機共聚物(random copolymers)或PHA嵌段共聚物(block copolymers)等。這些不同的結(jié)構(gòu)給PHA帶來了許多熱力學(xué)性能，可以滿足一些列不同的應(yīng)用。

2.1 PHA結(jié)構(gòu)和分類

PHA具有150多種單體結(jié)構(gòu)［2］，其中包括含有3～16個C原子的各種飽和、非飽和、直鏈或支鏈的3-羥基、4-羥基、5-羥基、6-羥基脂肪酸，具有脂肪族或芳香族的側(cè)鏈，也可能具有甲基、鹵原子、羥基、環(huán)氧基、氰基、羰基、苯基、苯腈基、硝基苯基和酯化羰基等取代基［3］。

圖2 PHA結(jié)構(gòu)通式Fig.2 PHA general molecular structures

根據(jù)PHA的單體組成，可將其大致分成以下3類:單體組成在3～5個C原子的PHA稱為短鏈PHA(scl-PHA:short chain length PHA);單體組成在6～16個C原子的PHA稱為中長鏈PHA(mcl-PHA:medium chain length PHA);由短鏈和中長鏈單體共聚形成的短鏈中長鏈共聚 PHA(scl-mcl-PHA)［4］。

按照單體單元的連接方式不同，PHA可大致分為3類:①只含有一種單體的均聚PHA(homopolymer);②由兩種或者更多種單體單元隨機聚合而成無規(guī)共聚PHA(random copolymer);③主鏈由兩個或兩個以上的鏈段構(gòu)成，且每一鏈段只含有一種單體單元的嵌段共聚PHA(block copolymer)［5］。

2.2 PHA的性能

PHA的材料學(xué)性質(zhì)主要是由其單體組成和單體比例決定。依結(jié)構(gòu)單元的組成不同，PHA具有從硬的晶體到軟的彈性體等一系列不同聚合物的性質(zhì)。短鏈PHA大多數(shù)有比較高的結(jié)晶度，表現(xiàn)出硬而強的塑料特性;而中長鏈PHA由于結(jié)晶度很低，表現(xiàn)出軟而韌的彈性體特征。除了熱塑性之外，PHA還具有生物可降解性，生物相容性，疏水性、光學(xué)異構(gòu)性、壓電性等特殊性能［6］。

與傳統(tǒng)石化塑料相比，PHA的最大優(yōu)勢就是其環(huán)境降解性。PHA的環(huán)境降解主要在微生物分泌的胞外酶作用下進行，影響PHA環(huán)境降解速率的因素很多:從外部條件來看，主要有環(huán)境類型，微生物種群及活力、水分、溫度等方面;從材料自身性質(zhì)來看，影響其降解速率的因素主要有PHA的分子結(jié)構(gòu)、聚集態(tài)結(jié)構(gòu)、材料宏觀形態(tài)、第二組分，如添加劑和共混的聚合物等［7］。

2.3 PHA的微生物發(fā)酵生產(chǎn)

PHA 由微生物大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，迄今為止，數(shù)種PHA，包括聚-3-羥基丁酸酯(PHB)、3-羥基丁酸和3-羥基戊酸共聚物(PHBV)、3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚物(P3HB4HB)、3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)及中長鏈PHA(mcl PHA)均實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)(表2)［1］。PHA的生產(chǎn)包括菌種復(fù)蘇、搖瓶優(yōu)化、初級發(fā)酵實驗及工廠級放大發(fā)酵。PHA的有效微生物生產(chǎn)取決于幾個因素，包括最終細胞密度、細菌生長速率、PHA在細胞干重中的百分比、達到最高細胞密度所需要的時間、底物和產(chǎn)物間的轉(zhuǎn)化效率以及底物價格及提純PHA的方法。在PHA生產(chǎn)技術(shù)的開發(fā)不同階段，必須考慮以上的因素。

此外，針對于特定的用途，PHA還應(yīng)該有合適的性能，這些性能包括合適的分子量、由單體結(jié)構(gòu)和組成及PHA生產(chǎn)條件共同決定的機械性能和熱力學(xué)性能等?；蚬こ?，分子進化，合成生物學(xué)及PHA生產(chǎn)條件操控等技術(shù)，被大量地應(yīng)用于生產(chǎn)具有特異結(jié)構(gòu)和超高分子量的PHA。野生型細菌和重組細菌均用于各種PHA的大規(guī)模生產(chǎn)(表2)［1］。對于大規(guī)模應(yīng)用來說，PHA生產(chǎn)成本必須足夠低，否則，PHA無法進入市場。

表2 用于PHA實驗或大規(guī)模生產(chǎn)的野生菌株和工業(yè)化菌種Table 2 Wild type and industrial strains used for pilot or large scale PHA production

3 PHA的應(yīng)用

3.1 PHA作為生物燃料的應(yīng)用

張曉軍等研究者發(fā)現(xiàn)，PHA包括PHB和mcl PHA可分別通過酸水解催化轉(zhuǎn)化為R-3-羥基丁酸甲酯(3HBME)及中鏈羥基甲酯(3HAME)(圖3)。研究顯示3HBME和3HAME的燃燒熱分別為20 kJ/g和30 kJ/g。乙醇的燃燒熱為27 kJ/g，加入3HBME或 3HAME后，可分別將乙醇的燃燒熱提升為30 kJ/g和35 kJ/g。在正丙醇和正丁醇中加入3HBME或3HAME后，可導(dǎo)致燃燒 熱 的 輕 微 降 低。3HBME/柴 油，3HBME/汽 油，3HAME/汽油等混合燃料的燃燒熱低于汽油柴油等純?nèi)剂?，但作為燃料來說是合理的。粗略估計，由廢水和活性淤泥等為原料的PHA制得的生物燃料的生產(chǎn)價格約為1 200$/t［8］。包括酒精和生物柴油在內(nèi)的生物燃料，始終存在“糧食或者燃料”及“燃料或者耕地”等爭論，而源于廢水和活性淤泥的PHA生物燃料的生產(chǎn)，是具有廢水處理和能源生產(chǎn)雙重功效的過程。這也使PHA在能源方面的應(yīng)用開辟了新的領(lǐng)域。

圖3 PHA甲酯化降解生成生物燃料3HBME和3HAMEFig.3 Biofuels 3HBME and 3HAME derived from methyl esterification of PHA

3.2 PHA作為生物可降解塑料的應(yīng)用

最初，德國的Wella AG公司使用PHA制作日常用品及包裝材料。PHA也被P＆G、Biomers、Metabolix及其它的一些公司開發(fā)為包裝膜，主要用于購物袋，集裝箱和紙張涂料和一次性的用品，例如剃面刀，器皿，尿布，女性衛(wèi)生產(chǎn)品，化妝品容器和杯子及醫(yī)療器械手術(shù)服，家居裝飾材料，地毯，包裝袋和堆肥袋等［1］。

PHB纖維具有高抗張強度，可經(jīng)在玻璃化溫度附近等溫結(jié)晶制得。延長PHB纖維等溫結(jié)晶的時間可導(dǎo)致最大拉伸比的降低。當同溫結(jié)晶的時間延長至24 h以上時，PHA纖維的抗張強度顯著提高［9－10］。低分子量的拉伸纖維的抗張強度大于高分子量的。等溫結(jié)晶化處理后再進行拉伸的PHB具有導(dǎo)向性的α晶體形式和平面之字形的β晶體結(jié)構(gòu)。Vogel等在熔融紡絲過程中，嘗試利用過氧化氫進行反應(yīng)擠出。他們成功地提高了材料的結(jié)晶度并阻止了纖維中的二次結(jié)晶。這些加工方法克服了PHA的脆性，生產(chǎn)出機械性能更強的PHA纖維。通過向PHB結(jié)構(gòu)中摻入不同摩爾分數(shù)的4HB，3HV或者中長鏈單體獲得的共聚PHA，其韌性和彈性獲得大幅度提高(表3)，具有更廣闊的應(yīng)用前景。

表3 PHA與傳統(tǒng)聚合物塑料性能的比較Table 3 Comparison of PHA and conventional plastics regarding properties

3.3 PHA作為醫(yī)用植入材料的應(yīng)用

研究者對 PHB，PHBV，P3HB4HB，P4HB，聚-3-羥基辛酸P3HO(poly-R-3-hydroxyoctanoate)和PHBHHx等PHA材料在縫線、修復(fù)裝置、維修補丁、繃帶、心血管補丁、骨科針、防粘連膜、支架、引導(dǎo)組織修復(fù)/再生設(shè)備、關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)支架、神經(jīng)導(dǎo)管、肌腱修復(fù)裝置、脊髓支架、人造食道及傷口敷料等方面的應(yīng)用進行了開發(fā)［11］。美國波士頓的Tepha公司專門研究心包補片，動脈增強，心臟支架，血管移植物，心臟植入物和補片，縫合線，輔料劑，隔離粉和藥物等。他們的P4HB以PHA4400為名字作為醫(yī)用材料進入市場［12］。近期研究顯示，PHBHHx因其良好的壓電性而被成功地用于促進骨骼再生。研究者對于PHBHHx在神經(jīng)損傷的修復(fù)和人工血管方面的應(yīng)用也加以開發(fā)(圖4)［13］。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)PHA的寡聚物具有營養(yǎng)和治療的功效［14］。

Shishatskaya等人發(fā)現(xiàn)，在長于1年的試驗期中，PHB和PHBV單纖維縫合沒有造成植入?yún)^(qū)的體內(nèi)任何不良反應(yīng)，在對于PHBHHx的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象［15］。PHBHHx的最重要的性質(zhì)之一是作為植入生物材料是無毒、無免疫刺激特性，而且其降解產(chǎn)物包括單體和低聚物，甚至激活Ca離子通道并促進受損組織再生［16］。美 國 Tepha公 司 以 P4HB 為 原 料 生 產(chǎn) 的TephaFLEX?可吸收縫合線產(chǎn)品于2007年獲得美國食品與藥品管理局(FDA)的美國上市批準。更多PHA生物材料將很快進入臨床試驗。因為PHA材料的多樣性，人們可以期望PHA成為一個具有豐富用途的生物植入材料家族。

圖4 PHBHHx電紡絲膜和神經(jīng)導(dǎo)管支架的SEM像:(a)PHBHHx納米纖維，(b)PHBHHx神經(jīng)導(dǎo)管Fig.4 SEM images of PHBHHx electric spinning films and its neuron conduits:(a)PHBHHx nanofibers and(b)PHBHHx neuron conduit

3.4 PHA作為手性單體的生產(chǎn)和應(yīng)用

如果細胞在C源限制培養(yǎng)條件下生長，所積累的PHA可降解為單體，可作為C源和能量來源被細菌重新利用，也可用于產(chǎn)生PHA單體［17］。隨著越來越多的新的PHA單體的被發(fā)現(xiàn)，PHA已經(jīng)成為獲得手性化合物的新來源。

各種光學(xué)純的(R)-3-羥基烴酸(R-HA)可以通過解聚生物合成的PHA很方便的制得。PHB在添加二氯乙烷和甲醇的條件下，經(jīng)不同催化反應(yīng)條件可化學(xué)降解生產(chǎn)(R)-3-羥基丁酸(R-3HB)或(R)-3-羥基丁酸甲酯［18］。Roo等通過水解假單胞菌生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯制備手性的(R)-3-羥基烴酸和(R)-3-羥基烴酸甲酯［17］。他們首先水解回收醇解后的PHA，然后蒸餾3-羥基烴酸甲酯混合物，分成幾個組分。隨后，將(R)-3-羥基烴酸甲酯皂化產(chǎn)生相應(yīng)的羥基烴酸，RHA的最終產(chǎn)量高達92.8%。

Lee和同事證明，R-3HB可以在有效地通過提供適當?shù)沫h(huán)境條件后，在體內(nèi)產(chǎn)生的解聚合作用下產(chǎn)生。他們在針對Alcaligenes latus的研究中發(fā)現(xiàn)，降低pH值至3～4，能誘導(dǎo)細胞內(nèi)的PHB解聚酶達到最高活性，并且阻止了細胞重新利用(R)-3HB［19］。Ren等將惡臭假單胞菌素細胞懸浮在不同pH值磷酸鹽緩沖液中。當pH值為11，降解和單體釋放速率最高。在這種條件下，(R)-3-羥基辛酸(R-3HO)和(R)-3-羥基己酸 (R-3HHx)在培養(yǎng)9 h后降解的效率超過90%，相應(yīng)單體的產(chǎn)量也超過90%。在相同條件下，相比于飽和單體，不飽和單體的降解產(chǎn)率較低［20］。

PHA來源的單體RHA含有手性中心及兩個易于修改的功能團(－OH和－COOH)。因此，RHA的一個重要的應(yīng)用是作為單體合成高分子材料，并作為合成精細化學(xué)品如抗生素，維生素，芳烴和信息素的起始原料［21］。

最常見的PHA單體成員，即(R)-3HB已被用作生產(chǎn)碳青霉烯類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯的原料。(R)-3HB一個最大的優(yōu)點是，人類對它具有良好的耐受性，其在體內(nèi)半衰期短。因此，(R)-3HB可直接用作口服藥物。最近，(R)-3HB已應(yīng)用于治療失血性休克，大面積燒傷，心肌損傷，腦缺氧及帕金森等。(R)-3HB能降低人類因老年癡呆癥和帕金森神經(jīng)元細胞模型的死亡率，能改善角膜上皮糜爛。此外，研究發(fā)現(xiàn)(R)-3HB能顯著改善小鼠的記憶［22］。

(R)-3HB對于體外成骨細胞的生長有積極的促進影響，并可用于體內(nèi)骨質(zhì)疏松癥的治療。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(R)-3HB能增加血清堿性磷酸酶活性和鈣沉積，降低血清骨鈣素，防止骨密度降低，從而提高股骨最大載荷和骨變形抗力，以及改善骨小梁體積［23］。

到目前為止，大多數(shù)PHA單體應(yīng)用的開發(fā)，基于來源充足的(R)-3HB。若其他的手性單體有了充足的來源，那么新的手性(R)-3HA的醫(yī)療應(yīng)用將迅速出現(xiàn)。這是一個很有潛力的領(lǐng)域。

3.5 利用PHA合成機制提高微生物的適應(yīng)性

有許多關(guān)于PHA生理功能的報道，主要是圍繞如Ca源缺乏、干燥、紫外線輻射、高滲透壓和存在有機溶劑等生存不利的條件下提高存活能力。

另據(jù)報道，有能力積累PHB的細菌更適應(yīng)突然增加的底物濃度。最近，Zhao等人比較了PHBHHx產(chǎn)生菌嗜水氣單胞菌A.hydrophila 4AK4及其相應(yīng)PHBHHx合成酶PhaC突變菌株(稱為A.hydrophila CQ4)的生存能力［24］。清華大學(xué)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型的4AK4可提供更好的抵抗環(huán)境壓力，包括冷熱處理，過氧化氫，紫外線輻射，乙醇處理，高滲透壓等。實時聚合酶鏈反應(yīng)研究表明，PHBHHx的合成可提高γροS編碼的Sigma因子表達水平。因此，有可能利用PHA來改進一些工業(yè)微生物的耐受性。

此外，PHA合成消耗大量的乙酰輔酶A和NADH，可用于調(diào)節(jié)某些微生物的代謝，促進產(chǎn)物形成。例如，獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus是一個生產(chǎn)化妝品透明質(zhì)酸的重要菌株。當R.eutropha的PHB合成基因phbCAB轉(zhuǎn)入獸疫鏈球菌中時，重組菌只產(chǎn)生40 g/L的乳酸和7.5 g/L的透明質(zhì)酸，而野生型產(chǎn)生了65 g/L的乳酸和5.5 g/L的透明質(zhì)酸［25］。本研究成功證明，與PHA合成有關(guān)的能源和C源代謝，可應(yīng)用于調(diào)節(jié)其他代謝產(chǎn)物的途徑。

Han等人分析和比較了大腸桿菌在PHB合成和非PHB合成條件下的抗性蛋白質(zhì)生成情況［26］，為PHA的合成與增強抗逆性有關(guān)的分子提供了證據(jù)。當分析重組菌株的蛋白質(zhì)二維電泳圖時發(fā)現(xiàn)，3個熱休克蛋白Gro-EL，GroES和DanK在有PHB的積累時顯著上調(diào)。積累的PHB也誘導(dǎo)了其他與抗性蛋白有關(guān)的基因的加強表達。這很好地說明了引入PHA的合成加強了大腸桿菌抗逆性，有助于提高菌株的耐受性。

以上研究結(jié)果清楚地說明，PHA的合成能提高非PHA生產(chǎn)菌株的抗壓能力，相關(guān)的合成機制可借用來改善在不斷變化的包括溫度、pH值、底物類型和濃度等環(huán)境壓力下工作的非PHA生產(chǎn)菌的生產(chǎn)能力。

3.6 PHA顆粒表面蛋白的應(yīng)用

圖5 胞內(nèi)PHA顆粒結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5 Structural schematic diagram of a PHA intracellular granule

幾種蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)位于胞內(nèi)PHA顆粒的表面(圖5)［27］。在這些蛋白質(zhì)中，PHA合成酶可以通過其N-末端與β-半乳糖苷酶融合，實現(xiàn)與β-半乳糖苷酶共價固定在PHA微球上。同樣，無論是PHA解聚酶的底物結(jié)合域，還是其他PHA合成調(diào)節(jié)酶PhaF或PhaP(PHA顆粒相關(guān)蛋白)的N-末端結(jié)構(gòu)域，都可以被用來把融合蛋白錨定在PHA微球上。已證實 PHA合成調(diào)節(jié)蛋白PhaR有兩個不同的結(jié)果域，分別與 DNA和PHB結(jié)合［28］，PhaR可以吸附于各種疏水性聚合物，如PHB，PLA，聚乙烯PE和聚苯乙烯等。這種吸附主要是非特異性疏水作用。Banki等開發(fā)出了一種以菜豆凝血素和目標蛋白之間自我裂解的內(nèi)含融合為基礎(chǔ)的新型重組蛋白純化系統(tǒng)，融合蛋白對細胞自身產(chǎn)生的PHB微粒有親和力［29］。通過收集吸附有重組蛋白的PHB顆粒，內(nèi)含自我剪切酶導(dǎo)致重組蛋白的釋放。這個PHB蛋白純化系統(tǒng)應(yīng)用便捷和廉價。

王芝輝等利用一種pH誘導(dǎo)的自剪切內(nèi)含子和PHA納米顆粒開發(fā)出了一種新型蛋白質(zhì)純化方法(圖6)。產(chǎn)生靶蛋白的基因和內(nèi)含子與PhaP是融合的，這些基因在胞內(nèi)共同過表達。重組大腸桿菌產(chǎn)生的含有目的蛋白及內(nèi)含子和PhaP的融合蛋白，通過細菌溶解過程與所有其他大腸桿菌的蛋白質(zhì)一起釋放。然后在體外吸附到表面疏水的聚合物納米粒上。吸附有融合蛋白的微米或納米粒子，經(jīng)離心濃縮，然后純化的目的蛋白被自我剪切的內(nèi)含子釋放，通過一個簡單的離心過程與微米或納米粒子分離。該系統(tǒng)已成功地用于生產(chǎn)和純化增強型綠色熒光蛋白(EGFP)、麥芽糖酶結(jié)合蛋白(MBP)和β-半乳糖苷。此方法使低成本生產(chǎn)和純化高附加值的蛋白成為可能［30］。

圖6 一種基于pH誘導(dǎo)的自剪切內(nèi)含子和PHA納米顆粒和顆粒結(jié)合蛋白的新型蛋白質(zhì)純化方法:(a)結(jié)構(gòu)示意圖，(b)蛋白純化流程Fig.6 A protein purification method based on pH induced intein and PHA granule binding proteins:(a)structure illustration and(b)flowsheet of protein purification

4 國內(nèi)PHA產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀

我國在PHA領(lǐng)域的研究在世界范圍內(nèi)是最活躍的，特別是清華大學(xué)和中科院。基礎(chǔ)研究的活躍開展，進一步促進了我國PHA產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，這就解釋了我國目前具有世界最多的PHA產(chǎn)業(yè)化企業(yè)的原因。

我國在研究、開發(fā)和應(yīng)用可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好生物材料已經(jīng)奠定了堅實的基礎(chǔ)，包括長春應(yīng)用化學(xué)研究所、清華大學(xué)、天津大學(xué)和山東大學(xué)等單位，在聚羥基脂肪酸酯PHA領(lǐng)域的研發(fā)工作以及國內(nèi)業(yè)已形成1.5萬t PHA的生產(chǎn)能力，這為PHA產(chǎn)業(yè)鏈的形成做好了技術(shù)和物質(zhì)儲備(圖7)。特別是最近天津國韻生物材料公司與荷蘭DSM公司等合作投資2 000萬美元建立一個1萬t的PHA的工廠，目前產(chǎn)能僅次于美國Metabolix和ADM合作在建的5萬t工廠。

除了在產(chǎn)業(yè)化方面取得成功之外，在國家自然科學(xué)基金的支持下，我國還克隆了20個以上與生物聚酯PHA合成有關(guān)的基因，合成了15種非傳統(tǒng)的PHA材料，開發(fā)了PHA加工成形的工藝技術(shù)。同時，在植物體系也成功地表達了一種聚酯。在“九五”期間，我國在天津、浙江、江蘇和廣東分別進行了PHA材料的中試和工業(yè)化生產(chǎn)，取得了寶貴的產(chǎn)業(yè)化經(jīng)驗。目前在山東、江蘇、浙江和天津正在進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)基地的擴大建設(shè)，總產(chǎn)能將超過10萬t。

在專利方面，至2009年底國內(nèi)外有關(guān)PHA的專利共881個，其中我國擁有64個，清華大學(xué)占其中21個。

圖7 PHA產(chǎn)業(yè)鏈Fig.7 PHA industrial value chain

5 結(jié)語

聚羥基脂肪酸酯PHA具有與傳統(tǒng)石化塑料如聚乙烯、聚丙烯等類似的材料學(xué)性質(zhì)，同時PHA可由碳水化合物、脂肪酸等可再生資源合成，并且在環(huán)境中可以完全降解進入自然界生態(tài)循環(huán)，因此被認為是一種環(huán)境友好的“綠色塑料”，具有替代傳統(tǒng)不可降解塑料的前景。PHA多種的單體結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生材料性能的多樣性:從堅硬質(zhì)脆的硬塑料到柔軟的彈性體，因而比其他生物可降解材料具有更廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。PHA材料由于具有良好的組織相容性，可用于醫(yī)用植入材料和藥物緩釋材料。PHA單體的立體特異性以及羥基、羧基等活性位點，使其可以作為精細化工合成品的起始原料;一些HA單體還具有特殊的生物學(xué)活性和醫(yī)療應(yīng)用前景。PHA合成機制的引進可以提高微生物的適應(yīng)性，增加抗逆性。近年來又不斷開發(fā)出PHA作為生物燃料、蛋白純化系統(tǒng)，藥物特異輸送系統(tǒng)等多種應(yīng)用。PHA領(lǐng)域已經(jīng)形成了一條包含農(nóng)業(yè)、發(fā)酵、塑料、包裝、生物燃料、精細化工、醫(yī)藥和營養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)價值鏈。PHA生產(chǎn)成本的降低、生產(chǎn)和應(yīng)用的規(guī)?；约伴_發(fā)出更多更成熟的高附加值應(yīng)用需要微生物學(xué)家，遺傳學(xué)家，植物學(xué)家，化學(xué)家，高分子科學(xué)家，化學(xué)工程師，生物技術(shù)，醫(yī)學(xué)科學(xué)家，政府機構(gòu)和工業(yè)界等跨領(lǐng)域的通力合作。

References

［1］Chen Guoqiang(陳國強).A Microbial Polyhydroxyalkanoates(PHA)Based Bio-and Materials Industry［J］.Chemical Society Reviews，2009，38:2 434－2 446.

［2］Sudesh K，Abe H，Doi Y.Synthesis，Structure and Properties of Polyhydroxyalkanoates:Biological Polyesters［J］.Progress in Polymer Science，2000，25:1 503 －1 555.

［3］Steinbüchel A，Valentin H E.Diversity of Bacterial Polyhydroxyalkanoic Acids［J］.FEMS Microbiology Letters，1995，128:219 －228.

［4］Reddy C S K，Ghai R，Rashmi，etal.Polyhydroxyalkanoates:an Overview［J］.Bioresource Technology，2003，87:137 －146.

［5］Abe H，Doi Y，Kumagai Y.Synthesis and Characterization of Poly［(R，S)-3-Hydroxybutyrate-β-6-Hydroxyhexanoate］as a Compatibilizer for a Biodegradable Blend of Poly［(R)-3-Hydroxybutyrate］and Poly(6-Hydroxyhexanoate)［J］.Macromolecules，1994，27:6 012－6 017.

［6］Steinbüchel A，Lutke-Eversloh T.Metabolic Engineering and Pathway Construction for Biotechnological Production of Relevant Polyhydroxyalkanoates in Microorganisms［J］.Biochemical Engineering Journal，2003，16:81 －96.

［7］Gao Haijun(高海軍)，Chen Jian(陳 堅)，Du Guochen(堵國成)，etal.聚β－羥基丁酸(PHB)降解的研究和展望［J］.Journal of Wuxi High Industry University(無錫輕工大學(xué)學(xué)報)，1996，15:174－178.

［8］Zhang X J，Luo R C，Wang Z，etal.Application of(R)-3-Hydroxyalkanoate Methyl Esters Derived from Microbial Polyhydroxyalkanoates as Novel Biofuels［J］. Biomacromolecules，2009，10:707－711.

［9］Mikova G，Chodak I.Properties and Modification of Poly(3-Hydroxybutanoate)［J］.Chemicke Listy，2006，100:1 075 －1 083.

［10］Tanaka T，Yabe T，Teramachi S，etal.Mechanical Properties and Enzymatic Degradation of Poly［(R)-3-Hydroxybutyrate］Fibers Stretched after Isothermal Crystallization Near T-g［J］.Polymer Degradation and Stability，2007，92:1 016 －1 024.

［11］Chen G Q，Wu Q.The Application of Polyhydroxyalkanoates as Tissue Engineering Materials［J］.Biomaterials，2005，26:6 565－6 578.

［12］Martin D P，Williams S F.Medical Applications of Poly-4-Hydroxybutyrate:a Strong Flexible Absorbable Biomaterial［J］.Biochemical Engineering Journal，2003，16:97 －105.

［13］Bian Y Z，Wang Y，Aibaidoula，etal.Evaluation of Poly(3-Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxyhexanoate)Conduits for Peripheral Nerve Regeneration［J］.Biomaterials，2009，30:217 － 225.

［14］Martin D P，Peoples O P，Williams S F，etal.Nutritional and Therapeutic Uses of 3-Hydroxyalkanoate Oligomers.US 359086［P］，1999.

［15］Qu X H，Wu Q，Zhang K Y，etal.In Vivo Studies of Poly(3-Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxyhexanoate)Based Polymers:Biodegradation and Tissue Reactions［J］.Biomaterials，2006，27:3 540-3 548.

［16］Cheng S，Chen G Q，Leski M，etal.The Effect of D，L-Beta-Hydroxybutyric Acid on Cell Death and Proliferation in L929 Cells［J］.Biomaterials，2006，27:3 758 － 3 765.

［17］De Roo G，Kellerhals M B，Ren Q，etal.Production of Chiral R-3-Hydroxyalkanoic Acids and R-3-Hydroxyalkanoic Acid Methylesters via Hydrolytic Degradation of Polyhydroxyalkanoate Synthesized by Pseudomonads［J］.Biotechnology and Bioengineering，2002，77:717－722.

［18］Seebach D，Beck A K，Breitschuh R，etal.Direct Degradation of the Biopolymer Poly［(R)-3-Hydroxybutyric Acid］to(R)-3-Hydroxybutanoic Acid and Its Methyl Ester［J］.Organic Syntheses，1993，71:39.

［19］Lee S Y，Lee Y，Wang F L.Chiral Compounds from Bacterial Polyesters:Sugars to Plastics to Fine Chemicals［J］.Biotechnology and Bioengineering，1999，65:363－368.

［20］Ren Q，Grubelnik A，Hoerler M，etal.Bacterial Poly(Hydroxyalkanoates)as a Source of Chiral Hydroxyalkanoic Acids［J］.Biomacromolecules，2005，6:2 290 － 2 298.

［21］Ruth K，Grubelnik A，Hartmann R，etal.Efficient Production of(R)-3-Hydroxycarboxylic Acids by Biotechnological Conversion of Polyhydroxyalkanoates and Their Purification［J］.Biomacromolecules，2007，8:279－286.

［22］Zou X H，Li H M，Wang S，etal.The Effect of 3-Hydroxybutyrate Methyl Ester on Learning and Memory in Mice［J］.Biomaterials，2009，30:1 532－1 541.

［23］Zhao Y，Zou B，Shi Z，etal.The Effect of 3-Hydroxybutyrate on the in Vitro Differentiation of Murine Osteoblast MC3T3-E1 and in Vivo Bone Formation in Ovariectomized［J］.Biomaterials，2007，28:3 063－3 073.

［24］Zhao W，Chen G Q.Production and Characterization of Terpolyester Poly(3-Hydroxybutyrate-co-3-Hydroxyvalerate-co-3-Hydroxyhexanoate)by Recombinant Aeromonashydrophila 4AK4 Harboring Genes PhaAB［J］.Process Biochemistry，2007，42:1 342 －1 347.

［25］Zhang J Y，Hao N，Chen G Q.Effect of Expressing Polyhydroxybutyrate Synthesis Genes(phbCAB)in Streptococcus Zooepidemicus on Production of Lactic Acid and Hyaluronic Acid［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，71:222 －227.

［26］Liu Q，Ouyang S P，Kim J.The Impact of PHB Accumulation on L-Glutamate Production by Recombinant Corynebacterium Glutamicum［J］.Journal of Biotechnology，2007，132:273 －279.

［27］Rehm B H.Biogenesis of Microbial Polyhydroxyalkanoate Granules:a Platform Technology for the Production of Tailor-Made Bioparticles［J］.Current Issues in Molecular Biology，2007，9:41－62.

［28］Yamashita K，Yamada M，Numata K，etal.Nonspecific Hydrophobic Interactions of a Repressor Protein，PhaR，with Poly［(R)-3-Hydroxybutyrate］Film Studied with a Quartz Crystal Microbalance［J］.Biomacromolecules，2006，7:2 449 － 2 454.

［29］Banki M R，Gerngross T U，Wood D W.Novel and Economical Purification of Recombinant Proteins:Intein-Mediated Protein Purification Using in Vivo Polyhydroxybutyrate(PHB)Matrix Association［J］.Protein Science，2005，14:1 387 －1 395.

［30］Wang Z H，Wu H N，Chen J，etal.A Novel Self-Cleaving Phasin Tag for Purification of Recombinant Proteins Based on Hydrophobic Polyhydroxyalkanoate Nanoparticles［J］.Lab on a Chip，2008，8:1 957－1 962.

Recent Progress in Application of Microbial Polyhydroxyalkanoates

CHEN Guoqiang
(Department of Biological Science and Biotechnology，Tsinghua University，Beijing 100084，China)

Biomanufacturing industry includes biofuels，biomaterials and biochemicals，and it is also called“white biotechnology”.Due to recent policy to promote industries independent of petroleum，CO2reduction and environmentally friendliness，biomanufacturing develops very fast.Being a family of biopolyesters with biodegradability，biocompatibility and chirality;microbial polyhydroxyalkanoates(PHA)has become one of the focuses of biomanufacturing today.Over the past several decades，PHA has been developed into an industrial value chain ranging from industrial fermentation，bioplastics，and biofuels to medical implant materials.In this review，we describe the most recent PHA developments including new applications both in China and aboard.

polyhydroxyalkanoates;biomanufacturing industry;Bioplastics;PHA

R318.08

A

1674－3962(2012)02－0007－09

2011－12－09

陳國強，男，1963年生，教授、博士生導(dǎo)師